Molekylärbiologins centrala dogma m Replikation:Bassekvensen i DNA står för den genetiska informationen. När en cell ska delas måste DNA:tdupliceras man måste få nytt DNA med exakt samma bassekvens som originalet. Vid proteinsyntes överförs informationen från DNA till aminosyrasekvens i två steg: Transkription:Bassekvensen i DNA översätts till bassekvens i mrna. mrnafungerar sedan som mall för proteinsyntesen. Translation:Bassekvens i mrnaöversätts till aminosyrasekvensm h a trna. Processen sker på ribosomerna. En sekvens av tre baser utgör den GENETISKA KODEN och specificerar en viss aminosyra.
Transkription = Översättning av bassekvensen i DNA till RNA OBS! Enklare process i prokaryota system - mycket mer komplicerat i eukaryota system! RNA: Trehuvudtyper: trna transfer RNA rrna ribosomalt RNA mrna messenger RNA Alla tre är involverade vid proteinsyntesen: DNA mrna Protein Transkription Translation rrna trna I eukaryoter har man även funnit ytterligare en variant, snrna(small nuclear): Involverade vid splicing. Återkommer till detta!
Funktioner hos RNA rrna: Bygger tillsammans med proteiner upp RIBOSOMER. På ribosomerna sker proteinsyntesen. trna: mrna: Transporterar aminosyror från cytosolentill ribosomen. Ser till att rätt aminosyra hamnar på rätt plats i den växande polypeptidkedjan. Utgör mall för proteinsyntesen. mrnabildas genom avskrivning av DNA-sekvensen.
Strukturen hos RNA - trna 3 trna: Minsta typen av RNA, ca80 nukleotider. Intramolekyläravätebindningar mellan kvävebasergör att trna-molekylenblir klöverformad (2D). o o o Aminosyransom hämtas i cytosolenoch transporterastill ribosomenbinds till 3 -änden av trna-molekylen. I antikodonloopenfinns tre kvävebaser som baspararmed mrnaoch svarar för att aminosyrorna kommer i rätt ordning i proteinet. Innehåller flera ovanliga, modifierade baser.
Strukturen hos RNA - trna Tredimensionellt viker sig sedan trna så den blir L-formad. I den tredimensionella formen hamnar bindningsstället för aminosyran så långt som möjligt ifrån antikodonet. Olika trnamolekyler binder olika aminosyror aminosyran måste stämma med antikodonet.
Strukturen hos RNA - trna
Strukturen hos RNA - trna 5 3 Esterbindning En aminosyra kopplad på 3 -OH
Strukturen hos RNA - rrna rrna:stora RNA molekyler som tillsammans med proteiner bygger upp ribosomer(2/3 av massan är RNA, 1/3 proteiner). Ribosom innehåller rrna Ribosomernabestår av en mindre och en större subenhet (30S och 50S). I eukaryoter(40s och 60S) 50S 30S S = Sedimentationskonstanten = Svedberg 1 S motsvarar sedimentation på 10-13 s i en ultracentrifug (2 000 000 g) http://guweb2.gonzaga.edu/faculty/cronk/biochem/rindex.cfm?definition=ribosome
Strukturen hos RNA - mrna mrna mrna: Innehåller bassekvensen som specificerar aminosyrasekvensen i ett protein. mrna bildas när protein ska syntetiseras och bryts sedan snabbt ner för att nukleotiderna ska kunna återanvändasoch för att cellen ska kunna kontrolleranär ett visst protein syntetiseras. Bassekvensen i mrna erhålls genom transkription(avskrivning) av bassekvensen i DNA.
Strukturen hos RNA - mrna Metylerad kvävebas Hos eukaryota organismer modifieras mrna efter transkriptionen En cap struktur bildas på 5 änden och en längre sekvens med Adenin kvävebaser läggs till vid 3 änden Ökar stabiliteten Roll mindre känt Ökar stabiliteten? Underlättar translationen?
Strukturen hos RNA - mrna mrna innehåller informationen för ordningen på aminosyrorna i ett protein Tre nukleotider i följd kodar för en aminosyra Ex: UUU = Phe CAU = His AAG = Lys CGU = Arg CGC = Arg CGA = Arg CGG = Arg En aminosyra kan kodas av flera kodon = den genetiska koden är degenererad
Strukturen hos RNA - mrna mrna innehåller start signal (AUG) för proteinsyntes Formylgrupp
Strukturen hos RNA - mrna mrna innehåller stop signal för proteinsyntes
Transkriptionen Transkriptionen katalyseras av RNA-polymeras, ett enzym som kopplar samman ribosnukleotider i riktning 5 3. HosE.colibestår enzymet av fyra olika subenheter: α 2 ββ σ. σ-enhetens funktion är att hitta startstället, sedan dissocierar den och α 2 ββ katalyserar själva polymerisationen.
Transkriptionen - mekanism Samma procedur som vid replikationen 1. Ny trifosfatnukleotidbinder först till mallkedjan genom basparningi.e. vätebindning mellan två matchande kvävebaser 2. Hydroxylgruppenpå C3 i den intilliggande nukleotidengör en nukleofilattack på den innersta fosfor-atomen i den nya trifosfatnukleotiden. 3. PP i hydrolyseras och den nya nukleotidensätts ihop kovalent med resten av RNA kedjan 4. Energikrävande process. Pyrofosfat(PP i ) hydrolyserasvarvid energi frigörs
Transkriptionen - mekanism Nukleofil attack av OH på C3 5 3 3,5 -fosfodiesterbindning 5 Ny nukleotid 3 H-bindningar OBS! ribosi RNA deoxyribos i DNA Fosfaten är kopplad från C3 i kedjan till C5 i nästa socker, alltså 3,5 -fosfodiesterbindning. Kedjan växer 5 3 mrnaskrivs från 5 3
Transkriptionen RNA polymeras tar instruktionen från DNA Bassekvensen i mrna är komplementär till den blåa DNA-strängen (templat kedjan) Den svarta DNA kedjan kallas för den kodande kedjan eftersom den har samma sekvens som mrnaförutom vid positionen för U i mrnasom är T i DNA kedjan
mrna Transkriptionen
Transkriptionen - mekanism Mekanismen hos RNA polymeras liknar mekanismen för DNA-polymerasets: Syntetiserar ny kedja 5 3. 3 -OH gör nukleofilattack på innersta fosfaten i trifosfatnukleotidenvarvid pyrofosfatlämnar. Tar instruktioner från en DNA-mall. Skillnader i funktion mellan DNA- resp. RNA-polymeras: RNA-polymeraset behöver ingen primer. RNA-polymeraset saknar exonukleas aktivitet. Gör inte lika mycket om det blir fel!!! Replikation felet går vidare till nästa uppsättning celler Transkription genererar endast ett tillfälligt fel i ett och annat protein
Transkriptionen - start Transkriptionen startar vid s k promoterregioner. Dessa regioner är AT-rika: -35-regionen Pribnow-boxen (TATA-boxen) Ser lite olika ut vid olika promoter men båda sekvenserna måste finnas
Transkriptionen - start RNA polymeraset måste vira upp DNA för att transkriptionen skall börja Ca 17 baspar
Transkriptionen Transkriptionen sker i en transkriptionsbubbla som löper längst med DNA TRANSKRIPTIONSBUBBLA: DNA-helixenöppnas och stängs med samma hastighet så att det hela tiden är ca 17 baser oparade på den kodande DNA kedjan.
Terminering: Transkriptionen - terminering Transkriptionen fortgår till en termineringssignal nås. Två sekvenser som innehåller många G och C viker RNA:t till en stabil hårnålsloop Därefter kommer en sekvens med flera U destabilisering Destabilisering: A-U förbinds med 2 vätebindningar RNA och DNA hålls inte ihop så bra längre de separerar och RNA polymeraset släpper G och C basparar med 3 vätebindningar
Transkriptionen - terminering Vissa gener kräver en annan faktor för att avsluta transkriptionen, ett protein som kallas rho. Rho känner igen ytterligare sekvenser i det nysyntetiserade transkriptet, binder till RNA:t vilket leder till att RNA-polymeraset lossnar. Processen kräver energi! Notera; I båda fallen ovan så är det signaler i det nysyntetiserade RNA:tsom känns igen och inte signaler i DNA:t!
Transkriptionen I prokaryotertranslaterasmrnainnan hela genen transkriberats I eukaryoterbildas ett primärt transkriptsom processas innan färdigt mrnalämnar kärnan för transport till ribosomerna i cytosolen.
Transkriptionen I prokaryoter syntetiseras RNA av ett polymeras men i eukaryoter finns det tre olika polymeraser Polymerasernafinns på olika ställen i cellkärnan och koder för olika RNA molekyler samt är olika känsliga för α-amanitinsom är ett gift från svampen Amanita phalloides Lömsk flugsvamp
Transkriptionen Hos eukaryoter RNA polymeras I katalyserar formation av rrna som skall ingå i ribosomen Från transkriptionen fås pre-rrna som innehåller tre olika rrna molekyler (18S, 5.8S samt 28S) Modifieringav både ribos-och kvävebasenheter (röda streck). Ex metylering Klyvning Färdigprocessat rrna 40S 60S En annan rrna-molekyl(5s) som skall ingå i 60S transkriberas av RNA polymeras III
Transkriptionen Hos eukaryoter RNA polymeras III katalyserar formation av trna Processning av tidigt trna transkript Borttag av nukleotidervid 5 och 3 ändan Tillägg av CCA vid 3 änden Borttag av en 14 nukleotidlång intron splicing Modifiering av socker-och kvävebasenheter (viktigt för funktionen)
Transkriptionen Hos eukaryoter RNA polymeras II katalyserar formation av mrna För att RNA-polymerasetska hitta rätt startställe på DNA templatetkrävs ett antal transkriptionsfaktorer; TFII A, B, D, E, F, H. (TF = transkriptionsfaktorer, II RNA polymeras II) TFIID binder till TATA-boxenvia en av sina subenheter, TBP ( TATA-boxbindingprotein ). Detta leder till konformationsförändringar i DNA TFIIA och TFIIB binder in till TBP:syta.
Transkriptionen Efter att TFIIB bundit in byggs komplexet på med TFIIF, E och H och RNA polymeras II TFIIH öppnar DNA helixen och fosforylerar den C- TFIIH öppnar DNA helixen och fosforylerar den C- terminala domänen (CTD) av polymeraset polymeraset lämnar promotorn och börjar transkriptionen
Transkriptionen Hos eukaryoter RNA polymeras II katalyserar formation av mrna 5 änden stabiliseras av Cap För att avsluta transkriptionen känner ett specifikt endonukleas igen sekvensen AAUAAA och klyver RNA nedströms En svans AAAAA(A) n kopplas på av poly(a)polymeras Splicing Färdigt mrna
Transkriptionen splicing av mrna De primära mrnatranskripteni eukaryoterbestår av EXONERoch INTRONER. Exonernainnehåller den genetiska informationen som kodar för protein - 2% av vårt genmaterial Intronerna(-98 % av vårt genmaterial)används inte som mall för proteinsyntes utan dessa klipps bort från mrna processen kallas för splicing I medeltal innehåller en gen hos människan 8 intronermen det kan finnas upp till 100 stycken Ofta kodar exonernaför olika funktionella domäner eller subenheter i ett protein Genom olika (alternativ) splicingkan olika varianter av mrnabildas från en och samma kodande region på DNA
Transkriptionen splicing av mrna Processen då introner avlägsnas och exoner sammanfogas kallas splicing. Exon Exon Splicing mrna före splicing mrna efter splicing
Transkriptionen splicing av mrna Alternativ splicing genererar mrna som är templat för olika proteinformer Splicing1 av mrnagenererar ett membranbundet protein Splicing2 av mrnagenererar ett protein som saknar den membranbindande delen
Splicing Mekanism: En intron startar alltid med GU och slutar med AG. Den har också alltid ett internt förgreningssäte med ett A. Exon1 Exon2
Splicing Stegvis: 1. 2 -hydroxylgruppen på A i förgreningssätetgör en nukleofilattack på fosforn i fosfodiesterbindningen som förbinder exon1 och intronen. Bindningen bryts. 2. 3 -hydroxylgruppen på exon1 attackerar fosfodiesterbindningen mellan exon2 och intronenvarvid en ny fosfodiesterbindningbildas mellan exon1 och exon2.
Splicing Katalyseras av ett komplex, SPLICEOSOMEN, som består av proteiner och snrna(sn = small nuclear). U 1, 2, 4, 5, 6 är snrnasom har en viktig funktion vid splicing: U1 binder till 5 -sätet och U2 till förgreningssätet Ett komplex av U4-U5-U6 binder in och SPLICEOSOMEN är komplett U6binder in till 5 -sätet och knuffar bort U1och U6-U2interagerar med varandra och knuffar bort U4. 2 -hydroxylgruppen på Ai förgreningssätet attackerar 5 -sätet varpå bindningen bryts. U5håller de två exonernanära varandra hydroxylgruppen i 5 -sätet attackerar 3 -sätet färdigsplicad exon
Splicing Alternativ splicing: Viktigt för ett begränsat genmaterial kan ge upphov till många olika proteiner. Typexempel: Antikroppsproduktion Bananflugor har ca 14 000 gener och en människa har ungefär dubbelt så många ca 24 000 Bananflugans huvudsysselsättning är att finna en banan och vi har många fler funktioner. Tittar man på antalet mrnavi bildar är det ca 150 000 alltså 6 ggr mer än generna. Slutsats: Genmaterialet kan användas för att ge flera olika mrna transkript Notera; En stor andel av alla genetiska sjukdomar (speciellt neurologiska) orsakas av mutationer som påverkar var gener splicas. Man tror att över 70% av alla gener är föremål för alternativ splicing för att producera funktionellt olika proteiner. Grundtesen, en gen = ett protein stämmer alltså inte. Vårt genmaterial skiljer sig motsvarande 1-2% från chimpanserna. Om vi inte hade alternativ splicingså skulle inte skillnaderna i proteinuttryck vara så stor som den är mellan människa och chimpans.
Ange mrna-sekvensen som motsvarar följande DNA sekvens 5 CGA TGT TAG CGT-3 Templatkedjan
Ange mrna-sekvensen som motsvarar följande DNA sekvens 5 CGA TGT TAG CGT-3 3 GCU ACA AUC GCA-5 SVAR: 5 ACG CUA ACA UCG 3 Templat kedjan mrna från 3-5