UMEÅ UNIVERSITET LABORATIONSHANDLEDNING Biokemi Farmaceutisk kemi 1 Lars Backman 2011-09-09 BIOLOGISK SYNTES AV PROTEIN Utblick Våra gener innehåller all information som behövs för att tillverka en ny kopia av oss själva. Genom att generna blandas från båda föräldrarna blir våra avkommor exakt kopior av oss. Genom den mycket snabba utvecklingen inom det som allmänt kallas bioteknik kan man med mycket enkla medel göra nästan vad som helst med en uppsättning gener hos en levande varelse. Många av dessa möjligheter som i grunden är postiva för oss, som t ex sjukdomsdiagnostik, kan samtidigt användas för helt andra ändamål. Hur mycket vill vi veta om de sjukdomsanlag som vi kanske bär på? Ökad kunskap inom det här området, tillsammans med den information om det mänskliga genomets bassekvens som följer av HUGO-projektet, leder till svåra etiska frågor som vi måste ta ställning till. Målsättning Efter laborationen skall du: Förstå hur information förs från DNA till RNA till protein Veta var och hur proteiner tillverkas i en levande cell Ha viss kunskap om proteiners struktur Känna till hur man klonar en gen Lab - Protein syntes.docx 2011-0+9-09
Proteinsyntes 2(5) TEORI Introduktion Sedan början av 1970-talet har en fullkomlig revolution ägt rum inom modern biologi och biokemi. En helt ny metodik har utvecklats. Metoderna kallas för rekombinant-dna-teknik eller genetisk ingenjörskonst och grundas på möjligheten till genkloning. Genkloning är en teknik där man preparerar fram en specifik gen från större DNA-molekyler och mångfaldigar den. Tekniken spelar en viktig roll i dagens forskning; den används för att studera geners sekvens och struktur liksom kontroll av genuttryck men även proteiners och peptiders primärstruktur. Specifika genmodifieringar som riktad mutagenes eller deletioner har också blivit möjliga att göra. Rekombinant-DNA-tekniken är även viktig inom industrin, t ex för produktion av antibiotika, vacciner, hormoner, enzymer som bryter ned miljöfarligt avfall etc. Genkloning Vid genkloning måste rent DNA med de specifika generna prepareras fram. Arbetar man med högre eukaryota organismer så måste man ta hänsyn till att generna består av både exoner och introner. Exonerna är de delar av DNA som innhåller den information som translateras, dvs översätts till protein, och mellan dessa finns introner. Introner är DNA som inte översätts utan transkriberas och klipps bort via splicing när exonerna sätts ihop. Eftersom splicing inte sker hos bakterier kommer det inte att ske syntes av något funktionellt protein vid uttryck av eukaryota gener. För att undvika detta problem går man bakvägen istället. Först isoleras moget mrna vilka innehåller RNA med bortklippta introner sedan låter man enzymet omvänt transkriptas ( reverse transcriptase ) använda detta mrna som mall för syntesen av komplementärt DNA (cdna). Därigenom får man ett DNA-fragment som bara innehåller den kodande delen av genen. Vektorer Vektorer eller plasmider används som redskap för uttryck av gener till proteiner. Dessa vektorer har viktiga egenskaper: i) de kan överföras till bakterier; ii) de hålls stabila i värdcellen; och iii) de innehåller information för uttryck av proteiner. Vektorer finns naturligt i en mängd olika organismer, både prokaryota och eukaryota, och man brukar prata om två huvudgrupper, plasmider och bakteriofager. Plasmider kan replikera sig oberoende av värdcellens kromosom och finns naturligt hos en del bakterier liksom hos jäst. Bakteriofager är virus som infekterar bakterier. Virus injicerar sin kromosom in i värdcellen och replikeras där, antingen som egen DNA-molekyl eller inkorporerat i värdcellens kromosomala DNA. Det finns en mängd olika vektorer tillgängliga. Alla kommer ursprungligen från naturligt förekommande plasmider eller virus och har modifierats på olika sätt för att passa genkloningstekniken. Inkorporering av DNA i en vektor För att praktiskt inkorporera ett DNA-fragment i en vektor så klipper man upp den med ett eller två restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer är enzymer som hydrolyserar fosfodiesterbindningen vid vissa speciella DNA-bassekvenser och de benämns utifrån vilken bakterie de härstammar från. EcoR I (från Escherichia coli) klyver vid sekvensen GAATTC och BamH I (från Bacillus amyloliquefaciens) klyver vid GGATCC. Det finns olika typer av restriktionsenzymer: enzymer som klyver dubbelsträngat DNA så att det sticker ut en bit enkelsträngad DNA, vilket ger sticky ends, och enzymer som klyver DNAs båda strängar på samma ställe så att ändarna är trubbiga, blunt ends. STICKY ENDS -N-G-A-A-T-T-C-N- EcoRI -N-G A-A-T-T-C-N- -N-C-T-T-A-A-G-N- -N-C-T-T-A-A G-N- BLUNT ENDS -N-A-G-C-T-N- AluI -N-A-G C-T-N- -N-T-C-G-A-N- -N-T-C G-A-N- Det här kan man utnyttja när man vill sätta ( klistra ) ihop två fragment som tidigare inte har suttit ihop. Man klyver vektorn och DNA med enzymer som ger samma sorts ändar. Även om man kan få sticky ends att sitta ihop genom basparning så krävs det att man fyller igen hålen ( nicks ) i DNAet genom att återskapar fosfodiesterbindningarna. Dessa nicks repareras av enzymet DNA-ligas. Den konstruktion som nu skapats av plasmiden och det nya DNA-fragmentet kallas för en rekombinant DNA-molekyl. Ofta innehåller vektorerna en gen som kodar för resistens mot en viss antibiotika. Bakterierna kan då överleva i ett medium som innehåller just den antibiotikan. Antibiotikan ampicillin (och andra penicillinderivat) binder till och inhiberar enzymer som deltar i syntesen av bakteriens cellvägg och hindrar därigenom bakterierna att växa. Genen för resistens mot ampicillin kodar för ett enzym, β-lactamas, som utsöndras i periplasman hos bakterien och katalyserar hydrolys av β-lactamringen på
Proteinsyntes 3(5) ampicillin vilket medför att ampicillinet förlorar sin funktion. Eukaryot cell Prokaryot cell DNA prepareras Klyva med restriktionsenzymer m-rna Reverse Transkriptas c-dna (ev. konstruera linkers) Separera fragment genom gelelektrofores Preparera fragment av en viss storlek lacz ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG Hind III Oligerad vektor Normal cell RbCl, 0 C DNA-Ligas Kompetent cell Självligerad vekto r "Fel" rekombinerad DNA-molekyl "Rätt" rekombinerad DNA-molekyl TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTA GAA GFPuv ATG ATG............ TAA TGA ATT CCA ACT GAG stopp EcoR I Figur 2. Restriktionskarta över pgfpuv Amp r - genen för ampicillinresisten; P lac - lac-operonets promotor; puc ori - start för replikation av plasmiden. 42 C Transformering Klon med "fel" vektor Klon med "rätt" vektor Figur 1. Grundläggande steg inom genkloning Plasmiden pgfpuv cell utan vektor överlever inte Klon med självligerad vektor Agar med antibiotika Plasmiden (pgfpuv) innehåller flera viktiga gensekvenser. Bl a finns genen för ampicillinresistens (amp r ), origin för replikationen (puc ori) och en inducerbar promotor för lac operonet (P lac ). Efter promotorn finns den kodande DNA-sekvensen för Green fluorescent protein (GFP). DNA-sekvensen som vi ska undersöka innehåller informationen för GFP, ett protein som normalt finns i manter av familjen Aequorea victoria. Om man belyser GFP med UV-ljus så börjar proteinet fluoresera, vilket kan utnyttjas för att t ex följa reningen av GFP. Den rekombinanta plasmiden överförs till en värdcell via transformering. Man använder ofta bakterier som värdceller för främmande DNA eftersom bakterier är lätta att odla och manipulera. Först måste man behandla bakterien så att den kan släppa in plasmiden, dvs göra cellerna kompetenta. Kompetenta celler utsätts sedan för en iskall saltlösning (ofta RbCl) varefter man utsätter cellerna för en värmechock (42 C). Detta gör små hål i cellhöljet och plasmiden kan tas upp. Celler kan även transformeras med elektroporering, vilket innebär att cellerna får en elektrisk chock istället för värmechock. Elektropoering är ofta både enklare och effektivare än värmechock. När en cell tagit upp en plasmid kallar man den för en transformerad cell. Varje cell som överlever odling i medium med ampicillin (eller annan lämplig antibiotika) kommer att innehålla en plasmid och ger upphov till identiska kopior när den delar på sig. På en agarplatta kan detta ses som kolonier av celler där varje koloni är en klon. Uttryck av proteinet Efter att ha isolerat en klon med den rekombinanta genen kan man börja studera genen eller proteinet. För studier av proteinet odlas cellerna så att proteinet produceras. Uttryck av främmande proteiner är ofta toxiskt för bakterierna. För att undvika detta brukar man låta bakteriekulturen växa till en viss densitet (ca 1x10 7 celler/ml) och först därefter inducerar man produktionen av proteinet. Har man använt en plasmid med lac-
Proteinsyntes 4(5) operonets promotor framför genen sätter inducerar man syntes av proteinet genom att tillsätt IPTG (isopropylthiogalactopyranos) till bakteriekulturen. IPTG binder till lacrepressorn och förhindrar repressorn att inhibera proteinsysntes. Efter induktion låter man bakterierna producerar proteinet under en viss tid och skördar (centrifugera ner cellerna) därefter.
Proteinsyntes 5(5) EXPERIMENTELL DEL: BIOLOGISK SYNTES AV PROTEIN Lösningar och kemikalier Sterila lösningar DNA (plasmid pgfpuv) 1 ng/µl (i TE) LA 100/Amp och LA 100/Amp/IPTG plattor (100 µg amp/ml och 0.5 mμ IPTG) kompetenta celler (E. coli/jm109) plastinöser SOB-medium (komplementerat med Mg 2+ ) Sterila glasvaror mm Övrigt Pipettspetsar (200 µl) Eppendorfrör rackla (plast, glas) Kylblock (kylt -20 C) eller isbad Värmeblock eller vattenbad (42 C) UV-lampa Automatpipetter (20 µl och 200 µl) "rackelsnurra" Transformering och odling Tina 200 µl JM109 kompetenta celler på is. Torka under tiden 1 LA 100/Amp-platta och 1 LA 100/Amp/IPTG-platta i 37 C. Blanda 10 µl pgfpuv med 100 µl tinade kompetenta celler i två sterila Eppendorfrör. Inkubera båda proven på is i 30-45 minuter. Heat-shock Värm cellerna ( heat-shock ) vid 42 C i 90 sec i ett värmeblock eller vattenbad. Kyl på is i 5 min. Tillsätt 0.2 ml SOB och blanda om. Inkubera rören i 30-45 minuter på skak vid 37 C. Rackla ut lösningarna på LA-plattorna med och utan IPTG. Skriv upp namn, datum och typ av kultur på plattans undersida. Inkubera plattorna upp- och nervända i 37 C över natt. Analys av syntetiserat protein För att analysera om bakterierna har tillverkat GFP utnyttjas GFP fluorescerande egenskap. Beräkna hur många kolonier som har växt på de båda agar-plattorna. Belys sedan plattorna med UV-ljus och beräkna hur många kolonier som fluorescerar. Laborationsredogörelsen ska innehålla Teori: Beskriv teori och syftet med laborationen. Resultat: Diskussion: Referenser Beskriv resultaten och jämför speciellt tillväxten på de båda plattorna. Diskutera resultaten med utgångspunkt från teorin. Besvara även följande: Varför ger man bakteriecellerna en chock i samband med transformeringen? Vilken funktion har IPTG? Vad skulle hända om IPTG utelämnades? Varför tillverkas inte GFP på båda agar-plattorna? Brown, T.A. Gene Cloning and DNA analysis. An Introduction. 4th ed. (2001) Blackwell Science. Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press (USA) http://www.bio.cmu.edu/courses/biochemmols/ribosome/70s.htm