Chlorotoxin (TM- 601)

Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling Termin 8 Av: Aseel Majid Chlorotoxin (TM- 601) 1

Sammanfattning Det finns tumörer som börjar uppstå i hjärnvävnaden och de kallas för primära hjärntumörer. Primära hjärntumörer är uppkallade efter den vävnad som de utvecklas ifrån. Den vanligaste hjärntumören är gliom, som inträder från differentierade gliaceller (största celltypen i nervsystemet) genom en dålig känd malign transformation. Gliomcellerna visar en märklig grad av antigenheterogenitet samt skiftande mutationer i sin arvsmassa men gliomcellerna kan också ha kvar vissa genetiska och antigena egenskaper som är gemmensamma för gliaceller. Om man drabbas av gliom kan man ha allvarliga symtom i nervssystemet, beroende på var i hjärnan tumören utvecklas.[1] Behandling av gliom beror på ett antal faktorer och omfattar olika metoder såsom kirurgi, strålbehandling (hög dos röntgenstrålning eller andra högenergistrålar som dödar cancercellerna) eller kemoterapi (genom att använda droger). Det finns också symtomatisk behandling som inkluderar vissa steroidhormoner (kortikosteroider) för att kontrollera effekterna av förhöjt tryck i skallen och kramper efter behov. Flera produkter för behandling av gliom har godkänts i förbindelse vid tidpunkten för inlämningen av ansökan om klassificering som särläkemedel. [2] Gliomcellerna har nyligen pekats på att de utrycker en gliomspecifik kloridjonkanal (GCC) som är ett substrat för chlorotoxin[1]. Chlorotoxin visade sig ha en anticancer effekt med specifik riktning mot cancerceller utan att påverka normala celler. Chlorotoxin är en peptid som består av 36 aminosyror. Åtta cysteinaminosyror bland de totala aminosyrorna i peptiden är sammankopplade med fyra disulfidbryggor. Detta toxin är positiv laddad vid ph 7. [3] Chlorotoxin kan antingen extraheras av skorpionens gift eller syntetiseras. [10] 2

Innehållsförteckning Sammanfattning s. 2 Historisk backgrund s. 4 Varför forska på chlorotoxin (TM- 601)? s. 5 Extraktion och isolering av chlorotoxin (TM- 601) s. 5 Biologisk aktivitet s. 6 Läkemedelsutveckling s. 7 Klinisk effekt och användning s. 8 Referenser s. 9 3

Historisk bakgrund Öknens spindeldjur skorpioner hade i århundraden mörka rykten. De ser främmande/skrämmande ut för de flesta människor. Men sedan kunde man påträffa att skorpioner, som de flesta giftiga varelser, är en viktig källa till botemedel för många sjukdomar som de orsakar. Anti- gift effekten deriveras direkt från skorpionens egen dödliga mix. Skorpionens gift studeras mycket noggrant av vissa medicinska forskargrupper. Den mest giftigaste skorpionen i världen är Deathstalker som också känd som den israeliska Desert Scorpion. Detta gift är ett kraftigt verkande nervgift som kan orsaka en stark smärta, oftast pga. muskelspasmer och fel i hela nervsystemet. Forskarna har dock funnit att giftet kan ha nytta inom medicin att rädda liv. [4] Figur 2: skorpion Deathstalker Deathstalker gift visade sig ha en smärtlindring effekt för cancerpatienter. Det är fortfarande okänt vilka specifika delar av giftet som interagerar med cancerceller. Giftet kan oftast orsaka smärta hos patienter utan cancer därför försöker forskarna att minska andra möjliga faktorer. [4] Peptiden chlorotoxin är en förening i Deathstalkers gift. Chlorotoxin kombinerar med skadade celler och de komponenter som orsakar tumörer för att försvaga dem och på så sätt kan enkel exponering för strålning ta bort vad som finns kvar. Man kan se en vanlig användning av giftet om genomgående tester visar sig vara framgångsrika och den syntetiska och icke dödliga versionen av giftet visar sig vara rent föremål. [4] 4

Varför forska på chlorotoxin (TM- 601)? Effektiva tumörbehandlingar måste ha möjligheten att skilja cancerösa celler från friska celler för att döda de cancerösa utan att skada friska. Chlorotoxin binder främst till gliomceller utan att påverka andra friska celler. Denna effekt hos chlorotoxin har möjliggjort utvecklingen av nya metoder för behandling av flera typer av cancersjukdomar. [5] Med användning av ett rekombinant chlorotoxin påvisades att den specifikt och selektivt interagerar med enzymets MMP- 2- isomerarna som är specifikt uppreglerade i gliom samt relaterade cancrar men som ej uttrycks normalt i hjärnan. [6] Extraktion och isolering av chlorotoxin (TM- 601) Chlorotoxin (TM- 601) är en peptid som är känslig för värme och hydrolyseras lätt, därför krävs det en särskild hantering när man isolerar den (6). Chlorotoxin kan extraheras med hjälp av en fastfas- extraktion. Denna extraktion är en metod som tenderar att låta blandningen som ska extraheras rinna i en kolumn. Kolumnen är packad med en stationärfas som består av ett fast material (kisel är vanligast). Kolumnen fylls sedan med ett passande lösningsmedel och får tvättas i flera steg. Komponenter som har hög affinitet till stationärfasen kommer att fastna i kolumnen och resten kommer att rinna ut med lösningsmedlet.[8] Figur 3: fastfas- extraktion 5

Det finns fyra olika typer av fastfas- extraktionen (normalfas, reversedfas, ion exchange och adsorptionfas). Normala fasen används för att extrahera opolära substanser eftersom den har en opolär stationärfas och en polär mobilfas. Reversedfas är en motsats process till normalfasen och används då vid extraktion av polära substanser. I ion exchange består stationärfasen av laddade grupper som kan binda till substansen. Adsorption är ett exempel på antikropp antigen interaktion. Fastfas- extraktionen tar lång tid men man behöver inte filtrera provet innan.[8] Denna extraktion är en förberedande åtgärd för andra steg som isolering, koncentrering, separering och rengöring. Dessa steg genomförs för att få ut en biologisk aktiv substans.[7] Efter extraktionen och identifieringen av komponenternas egenskaper väljs en lämplig isolerings metod. Komponentens fysikaliska egenskaper som laddning, molekylstorlek, stabilitet och polaritet avgör vilken isolerings metod man ska välja. Polariteten är en viktig faktor i valet av lösningsmedel som ska användas i separationsmetoden. Sura och basiska substanser är lättare att separera i jämförelse med neutrala substanser. Om man använder en fel kromatografisk metod och applicerar besvärande prover igenom kan man få dålig separation och även kolumnen kan förstöras. [7] Exempel på kromatografiska metoder som kan användas för separation av produkter är HPLC (high performance liquid chromatography), GC (gas chromatography), TLC (thin layer chromatography) och SEC (size exclusion chromatography). [8] Biologisk aktivitet Chlorotoxin binder specifikt till receptorn i tumörceller. Chlorotoxin har förmåga att blockera kloridkanaler i proteinmembranet. Detta förhindrar kloridflödet. [9] Chlorotoxin binder till receptorn och levererar en dos med strålning. Strålningen dödar tumörcellen men den skadar inte omgivande friska celler. [15] Eftersom denna interaktion inte sker för nervceller eller normala gliaceller, tyder det på en potentiell cancerbehandling. [9] Chlorotoxin visade sig ha en anti- invasiv effekt på gliomceller. Denna effekt förmedlas via dess interaktion med MMP- 2 (matrix metalloproteinas- 2) som gör att penetrationen av normala och tumörceller genom vävnaden förhindras. Chlorotoxin 6

hämmar den enzymatiska aktiviteten hos MMP- 2 samt orsakar en minskning av ytan som yttras av MMP- 2. Den effekten hos chlorotoxin gör det till ett mycket effektivt läkemedel mot sjukdomar som involverar aktiviteten hos MMP- 2. [6] I studien (Use of chlorotoxin for targeting of primary brain tumors) kunde man med hjälp av nativt och rekombinant 125 I- märkt chlorotoxin visa att toxinbindning till gliomceller är specifik och innefattar hög affinitet med en dissociationskonstant på 4,2 n M och låg affinitet med en dissociationskonstant på 660 n M. I radioreceptoranalyser binder 125 I- märkt chlorotoxin till ett protein (antagligen GCC eller en receptor) med Mr = 72 tusen som varierar GCC- aktivitet. In vivo- targeting och biodistribution experiment gjordes genom att injicera 125 I- och 131 I- märkt chlorotoxin i gravt kombinerade immunbristande möss som bar xenograferade gliom. Chlorotoxin ackumuleras selektivt i tumörbärande mössens hjärna som har fått beräknat hjärna: muskelceller förhållande till 36,4% av injicerad dos/ g jämfört med 12,4% i kontrolldjuret. Tumör: muskel förhållande i tumörbärande möss med radioaktivitet lokaliserad i tumören är på 39,13% medan kontralateral hjärna: muskel förhållande är på 6,68%. Distributionen av 131 I- märkt chlorotoxin som är visualiserad genom in vivo reproduktion av gamma ray kamera skanningar visar en specifik och långvarig intratumoral lokalisering av den radioaktiva liganden. [1] Immunhistokemiska studier med biotinylerade och fluorescensmärkta chlorotoxin uppvisar en mycket selektiv märkning (färgning) av gliomceller in vitro, in situ och i delar av patientens biopsier. Chlorotoxins immunfärgning visar att vävnader inklusive normal human hjärna, njure och kolon var negativa. Dessa data tyder på att chlorotoxin- och chlorotoxin- konjugerade molekyler kan fungera som gliomspecifika markörer som har fått diagnostisk och terapeutisk potential. [1] Läkemedelsutveckling Chlorotoxin renas från skorpionen Deathstalkers gift men nyligen kunde man göra en syntetisk version av denna gift som kallas för TM- 60. TM- 601 kan ej döda cancerceller på egen hand vid en viss dos därför används den som en vektor för radioaktivt jod.[4] TM- 601 syntetiseras med hjälp av fastfas- kemisk- syntesen. Korrekt veckning och bildning av fyra disulfidbindningar uppnås via användning av skyddande förutsättningar och peptiden renas sen. [10] 7

131 I- chlorotoxin binder också specifikt till tumörceller och åstadkommer en mängd sekundära budbärare effekter genom en signalering av fosfatidylinositol. [11] Chlorotoxin kan kombineras med Cy5-5 (en fluorescerande molekyl) och bildar en CTX:Cy5-5 biokonjugat. Denna kombination har använts av forskarna vid Seattle Barnsjukhuset Research Institute och Fred Hutchinson Cancer Research Center för att begränsa cancercellerna från de omgivande normala cellerna. [12] Detta ger kirurger en bättre möjlighet att ta bort alla cancerceller utan att skada omgivande frisk vävnad. CTX:Cy5-5 avger fotoner i en nära IR spektrum och kan därmed visualiseras i operationssalen med hjälp av IR glasögon. Studier i musmodeller har visat att Cy5-5 kan identifiera tumörer med 2000 cancerceller, vilket gör det 500 gånger känsligare än MR. Behandlade djur uppvisade inga neurologiska eller beteendestörningar och obduktion visade inga tecken på neuropati. [13] klinisk effekt och användning Chlorotoxin är ännu inte ett godkänt läkemedel men i USA har detta läkemedel fått "ʺFast Track designation"ʺ som innebär att U.S. Food and Drug Administration prioriterar sitt arbete för att möjliggöra godkännandet av läkemedlet. [15] 131 I- chlorotoxin och TM- 601 är under utredning för behandlingen av gliom, därför att de specifikt binder till gliomceller och inte till de normala cellerna. [16] Tillvägagångssättet för att använda chlorotoxin kan enligt beräkningar vara så enkelt som att injicera en lösning av föreningar till patientenshuvud. [4] Enligt prekliniska studier är 131 I- chlorotoxin både en strålning och kemoterapi stabiliserande. I en tidigare fas I/ II klinisk studie definierades fördelningen och dosimetrin av enstaka injektion intrakavitär av 131 I- chlorotoxin och föreslog en klinisk aktivitet hos patienter med återkommande gliom.[11] Läkemedlet "ʺ 131 I- chlorotoxin"ʺ betecknas som ett särläkemedel och har indikationen för behandling av gliom.[14] 8

Referenser 1. http://translate.googleusercontent.com/translate_c?anno=2&hl=sv&rurl=transl ate.google.se&sl=en&tl=sv&u=http://cancerres.aacrjournals.org/content/58/21/ 4871&usg=ALkJrhgHyQ1SXEGir64SQhFcgmPP6SFGFA 2. http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:bjrxxx3vnqsj:www.e ma.europa.eu/docs/en_gb/document_library/orphan_designation/2009/10/w C500006506.pdf+klorotoxin&hl=sv&gl=se 3. ^ Lippens G, Najib J, Wodak SJ, tandsten A (januari 1995). "ʺNMR sekventiella uppdrag och lösning struktur chlorotoxin, en liten skorpion gift som blockerar kloridjonkanaler"ʺ Biokemi 34 (1):.. 13-21 doi : 10.1021/bi00001a003. PMID 7.819.188 4. http://se.hicow.com/antivenom/scorpion/sm%c3%a4rtlindring- 2448651.html 5. ^. Soroceanu L, Gillespie Y, Khazaeli MB, Sontheimer H (november 1998) "ʺAnvändning av chlorotoxin för inriktning av primära hjärntumörer"ʺ. Cancer Res 58 (21):. 4871-9. PMID 9.809.993. http://cancerres. aacrjournals.org / cgi / pmidlookup? view = lång & PMID = 9.809.993. 6. ^ ett b c Deshane J, Garner CC, Sontheimer H (februari 2003). "ʺChlorotoxin hämmar invasion gliom cellen via matrix metalloproteinas- 2"ʺ. J. Biol.. Chem 278 (6):. 4135-44 doi : 10.1074/jbc.M205662200. PMID 12.454.020 7. Samuelsson, G. och Bolin, L. (2009). Drugs of natural origin (6th revised edition). Kristianstad: Kristianstads Boktryckeri AB 8. http://www.sigmaaldrich.com/graphics/supelco/objects/4600/4538.pdf 9. ^ Lyons SA, O'ʹNeal J, Sontheimer H (augusti 2002). "ʺChlorotoxin, en skorpion- derived peptid, binder specifikt till hjärntumörer och tumörer i neuroektodermal ursprung"ʺ Glia 39 (2):.. 162-73 doi : 10.1002/glia.10083. PMID 12.112.367. 9

10. http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=sv&prev=/search%3fq% 3Dchlorotoxin%2Bsynthesis%26hl%3Dsv%26rlz%3D1R2RNRN_svSE440%26b iw%3d1366%26bih%3d403%26prmd%3dimvns&rurl=translate.google.se&sl= en&u=http://ar.iiarjournals.org/content/30/1/39.full&usg=alkjrhikkypkhfnfs j6jl1o_repnafsksw 11. http://googleusercontent.com hl=sv&prev=/search%3fq%3dchlorotoxin%2b(tm- 601)%26hl%3Dsv%26rlz%3D1R2RNRN_svSE440%26biw%3D1366%26bih% 3D442%26prmd%3Dimvns&rurl=translate.google.se&sl=en&u=http://meeti ng.ascopubs.org/cgi/content/abstract/24/18_suppl/1555&usg=alkjrhj3aq1vu MTec49Tfp99znmsbF3VYg 12. ^ Veiseh M, Gabikian P, Bahrami SB, et al (juli 2007). "ʺTumor färg: en chlorotoxin: Cy5.5 Bioconjugate för intraoperativ visualisering av cancer foci"ʺ Cancer Res 67 (14):.. 6882-8. doi : 10.1158/0008-5472.CAN- 06-3948. PMID 17.638.899 13. ^ "ʺtumör Målning revolutionerar kampen mot cancer"ʺ. http://www.fhcrc.org/about/ne/news/2007/07/16/tumor_painting.html. 14. http://translate.google.se/translate?hl=sv&sl=da&u=http://ec.europa.eu/health/ documents/community- register/2007/2007102232948/dec_32948_da.pdf&ei=yloxt- XtBc2M4gTs_YH_BA&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=1&ved=0CCUQ 7gEwAA&prev=/search%3Fq%3Dchlorotoxins%2Bindikationer%26hl%3Dsv% 26rlz%3D1R2RNRN_svSE440%26biw%3D1366%26bih%3D442%26prmd%3Di mvns 15. http://www.nyfikenvital.org/?q=node/1229 16. http://www.multilingualarchive.com/ma/enwiki/sv/chlorotoxin 10

Figur 1 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a4/chlorotoxin.png Figur2http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/93/Black_scorpion. jpg/210px- Black_scorpion.jpg Figur 3 http://www.biotage.com/graphics/9223.jpg 11