Sluttentamen med svarsmallar Bke2/KE0003, 28:e Oktober 2002, 09 00-15 00. Max poäng = 88 p. Preliminär gräns för godkänd = 46 p (52 %). 1. Utan biologiska membran skulle inget liv kunna existera. a) Rita den kemiska strukturformeln för en membranlipid. (2.5p) b) Beskriv med en enkel skiss uppbyggnaden av ett biologiskt membran. (1p) c) e två exempel på energialstrande processer där biologiska membran är av central betydelse. (1p) d) Vad kallas den drivande kraften som gör att membraner hålls ihop (och som gör att proteiner veckar sig) (0.5p)? Hur fungerar den (1p)? (6p) a) Lipidfigur: lycerol (0.5p) med esterbindningar (0.5p) till fettsyror (R1, R2) på två hydroxyler (0.5p) och fosfat på den tredje (0.5p) som i sin tur har en polär grupp bunden (etanolamin, serin, kolin) (0.5p). b) Membranfigur: Dubbellager, hydrofila huvuden utåt, hydrofoba svansar inåt (1p). c) Membranet har en central betydelse vid oxidativ fosforylering (0.5p) och vid fotosyntes (0.5p). d) Hydrofoba effekten (0.5p). Hydrofoba delar av t.ex. lipider eller proteiner klumpar ihop sig med varandra för att undgå kontakt med vatten (1p). 2. I proteiner ingår 20 olika aminosyror, la, rg, sn, sp, ys, ln, lu, ly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, hr, rp, yr, Val. a) Placera varje aminosyra i en av följande 7 grupper: Sidokedjan innehåller 1) Svavel, 2) lkohol eller 3) mid eller är 4) lifatisk, 5) romatisk, 6) Sur eller 7) Basisk. (3p) b) minosyrorna ys, ly och Pro har speciella egenskaper som är betydelsefulla för strukturen hos det veckade proteinet. nge för var och en av dessa tre aminosyror vilken egenskap och vilken strukturell funktion aminosyran ofta har i proteiner. (3p) c) I många enzymer hittar man i aktiva ytan histidin med viktig katalytisk funktion. Vilka egenskaper hos histidin gör den lämplig att delta i enzymatiska reaktioner? e ett exempel på en enzymmekanism och vilken roll histidin har i denna reaktion. e ett exempel på någon annan funktion som histidin kan ha. (3p) (9p) a) 1. Svavel: ys, Met 2. lkohol: Ser, hr, (yr) 3. mid: sn, ln Sidan 1 av 12
4. lifatisk: la, ly, Ile, Leu, Pro,Val 5. romatisk: Phe, rp, yr 6. Sur: sp, lu 7. Basisk: rg, His, Lys (3p totalt, -0.5p för varje fel placerad aminosyra) b) ystein (ys) kan para ihop sig och bilda disulfidbryggor (0.5p) som binder ihop olika delar av polypeptidkedjan och stabiliserar proteinets tertiär-struktur (0.5p). lycin (ly) har ingen egentlig sidokedja utan bara väte på alfa-kolet vilket ger större vridbarhet runt alfa-kolet (phi och psi-vinklarna) (0.5p). ly sitter ofta där det är trångt (där större sidokedja inte får plats) eller där det behövs en kraftig böj i huvudkedjan (0.5p). Prolin (Pro) har en sidokedja som är kovalent bunden till peptidkvävet så att den bildar en ringstruktur där phi-vinkeln är fixerad och inte kan rotera (0.5p). Detta ger minskad flexibilitet och stabilisering av huvudkedjan. Prolin passar inte i alfa-helix och hindrar dess bildning. Pro kan fungera som "helix-brytare" i änden av en helix och förekommer ofta i böjar tillsammans med ly (0.5p). c) Histidin har pka-värde omkring 6-7 och den kan gärna uppta/avge proton vid fysiologiskt ph och delta i syra/bas-katalys (1p). His ingår t.ex. i den katalytiska triaden i serin-proteaser, där den tar upp och avger en proton (1p). His binder gärna till metalljoner, t.ex. till järn i hemoglobin, myoglobin och cytokromer (1p). 3. Proteiners struktur kan beskrivas i fyra nivåer. Beskriv kortfattat, med högst två meningar för varje: a) Primär struktur (1p) b) Sekundär struktur och namnen på de två viktigaste sekundärstrukturelementen (1p) c) ertiär struktur (1p) d) Kvartenär struktur (1p). (4p) a) Primärstruktur är aminosyrasekvensen (1p). b) Sekundärstruktur bildas när avsnitt av polypeptidkedjan veckar ihop sig med regelbundna vätebindingar i sekundärstruktur-elementen alfa-helix eller beta-flak (1p). c) ertiärstruktur beskriver hela polypeptidkedjans veckning, hur sekundärstrukturelement och sidokedjor är packade (1p). d) Kvartenärstruktur beskriver hur olika subenheter sitter ihop i ett oligomert protein/proteinkomplex (1p). Sidan 2 av 12
4. X, Y och Z är tre proteiner som återstår i ett prov efter inledande rening av ett E. colicellextrakt. Du laddar provet på en gelfiltreringskolonn och resultatet ser du i figuren nedan. a) Beskriv kortfattat principen för gelfiltrering samt ordna proteinerna X-Z i trolig storleksordning från det minsta till den största. (2p) b) Som du ser så har du inte lyckats att fullständigt isolera komponenten Y vilken du önskar rena för att så småningom använda för enzymkinetikstudier. Man vet dock att Y och X har skilda isoelektriska punkter (Y=7.5 respektive X=5.2). Du bestämmer dig för att försöka binda Y till en jonbytare med en negativt laddad ligand t.ex. M- Sepharose vid ph 6.5 för vidare rening. Protein Y binder mycket riktigt till denna till skillnad från X. Varför? (2p) c) Nu gäller det att få Y att lossna från M-jonbytaren. Du springer till kemikaliehyllan och märker till din fasa att natriumkloriden är slut (liksom andra lämpliga salter). Däremot finns det gott om olika buffertsubstanser. Föreslå ett alternativt sätt att få Y att släppa från jonbytaren. (1p) (5 p) 280 elfiltrering på Sephacryl 1 0.5 X Y Z 0 0 100 200 300 400 500 Volym (ml) a) elfiltreringskromatografi används för att separera proteiner/molekyler med avseende på storlek (0.5 p). Systemet består av två faser - en fast och en mobil (0.5p). Den fasta fasen utgörs t.ex. av kulor av en tvärbunden polysackarid och den flytande fasen vanligen av en buffert. Separationen beror av molekylernas förmåga att tränga in i gelkulornas porer (0.5p). Små molekyler tränger lättare in än stora och separationen sker följdaktligen i fallande storleksordning. Storleken på molekylerna i provet bör vara Z < Y < X. (0.5p). b) Vid ph 6.5 kommer Y som befinner sig under sin isoelektriska punkt ha en postiv nettoladdning och bör binda till den negativt laddade M-gruppen. X däremot bör vara negativt nettoladdat vid detta ph och binder följaktligen inte. (2p) c) enom att tillverka en buffert med ph 8-8.5 kan du troligen eluera Y som bör bli negativt laddat när ph höjs över dess isoelektriska punkt. (1p) Sidan 3 av 12
5. Enzymet E som följer Michaelis-Menten-kinetik har K m 1 M. Initiala reaktionshastigheten v 0 är 0.1 M/min vid en substratkoncentration på 10 mm och enzymkoncentrationen [E] tot 0.1 nm. Vad blir den initiala hastigheten v 0 a) om vi dubblar substratkoncentrationen vid samma enzymkoncentration, [S] = 20 mm? b) om [S] är lika med 1 M vid samma enzymkoncentration? c) om vi istället dubblar enzymkoncentrationen vid samma substratkoncentration, [S] = 10 mm, [E] tot = 0.2 nm? (3p) När [S] = 10 mm, [S] >> K m (substratkonc mycket större än K m ), och alltså är v 0 = Vmax = 0.1 M/min a) 0.1 M/min. För varje substratkoncentration större än 10 mm gäller fortfarande att v 0 = Vmax = 0.1 M/min (1p) b) 0.05 M/min. När [S] = K m gäller att v 0 = Vmax/2, eller 0.05 M/min (1p) c) 0.2 M/min. Hastigheten är proportionell mot enzymkoncentrationen. Dubbelt så hög enzymkoncentration ger dubbel hastighet. (1p) 6. ktiviteten hos enzym-molekyer kan regleras på olika sätt. a) Ett vanligt sätt är att andra ämnen än substrat eller produkt kan binda till speciella regulatoriska bindingsställen och påverka enzymets struktur så att det inhiberas eller aktiveras..ex. Fosfofruktokinas 1 (PFK-1), som katalyserar bildningen av fruktos-1,6- bisfosfat från fruktos-1-fosfat i glykolysen, inhiberas av citrat och aktiveras av MP. Vad kallas den typen av regleringsmekanism? b) En annan mekanism används ofta vid hormonell kontroll, t.ex. för att styra nedbrytning och syntes av glykogen. När hormonerna adrenalin (epinephrine), glukagon eller insulin binds till receptorer på cellytan ger det en signal inuti cellen att sätta på eller stänga av enzymerna glykogen-syntas och glykogen-fosforylas med denna mekanism. Vad kallas mekanismen? c) En tredje mekanism som vi stött på kontrollerar aktiviteten hos serin-proteaserna från bukspottkörteln, trypsin, kymotrypsin och elastas, som används i matsmältningen. Vad kallas denna mekanism? (3p) a) llosterisk reglering (1p) Sidan 4 av 12
b) (Protein-)fosforylering (1p). Enzymet stängs av eller sätts på genom att en fosfatgrupp sätts på eller tas av från ett speciellt fosforyleringsställe på enzymet. Utförs av proteinkinaser. c) Proteolytisk aktivering (1p). Enzymet syntetiseras som ett inaktivt pro-enzym, och aktiveras genom att en eller flera peptidbindingar i proteinet hydrolyseras av ett proteas. 7. Flödet genom en metabolisk reaktionsväg, t.ex. glykolysen, styrs genom att aktiviteten för vissa nyckelenzymer regleras noggrannt. a) Vilka steg brukar vara reglerade, dvs. vad är gemensamt för de reaktioner som de reglerade enzymerna katalyserar? (1p) b) Vad kallas det när ett enzym i början av en metabolisk reaktionsväg inhiberas av produkten från ett senare steg? (1p) c) Vad kallas det när en produkt från ett tidigt steg aktiverar ett enzym i slutet av en metabolisk reaktionsväg? (1p) (3p) a) Metaboliskt irreversibla steg (1p) brukar regleras, dvs. reaktioner med stort negativt delta-. Mycket energi frigörs från substraten, ofta genom att P förbrukas. lternativa svar som ger poäng: Det första determinerade steget i en reaktionsväg (eller liknande, 0.5p). Steg där reaktionsvägar grenar sig ('branch-point enzyme', eller liknande, 0.5p). b) 'Feed-back'-inhibering (1p) c) 'Feed-forward'- aktivering (1p) 8. En del enzymer kräver ytterligare funktionella enheter än de aminosyror som ingår i polypeptidkedjan, s.k. co-enzymer. Människor och högre djur saknar förmågan att helt själva syntetetisera många av de co-enzymer som behövs. Istället måste vi få dem i oss via födan. De flesta essentiella ämnen som kallas vitaminer är prekursorer för sådana coenzymer. a) Ett co-enzym kan fungera som co-substrat eller prostetisk grupp. Vad är skillnaden? b) Vitaminet niacin (nikotinsyra) behövs till ett co-enzym, vilket (förkortning är OK)? I vilken typ av reaktioner ingår detta co-enzym och vilken funktion har det i cellen? Är det ett co-substrat eller en prostetisk grupp? c) Vitamin B 2, riboflavin, behövs till ett annat co-enzym, vilket (förkortning är OK)? Brukar det vara ett co-substrat eller en prostetisk grupp? Detta co-enzym deltar i liknande reaktioner och har liknande funktion, men har en förmåga som ovanstående co-enzym saknar. Vilken? (7p) Sidan 5 av 12
a) Ett co-substrat lämnar enzymet efter reaktionen (0.5p) och en ny molekyl kan komma i dess ställe. o-substratet regenereas av ett annat enzym nån annanstans. En prostetisk grupp däremot sitter normalt bunden till enzymet hela tiden (0.5p) och måste regenereras på plats innan enzymet kan katalysera en ny reaktion. b) Niacin görs om till nikotinamid som ingår i ND + (Nikotinamid-denin-Dinukleotid) NDH, NDP + och NDPH (1p, en räcker), som ingår i redox-reaktioner (oxidationer och reduktioner) och tar emot eller avger elektroner. Fungerar som elektronbärare (1p) och reduktionsmedel i cellen. Är co-substrat (1p). c) Riboflavin behövs till FD (Flavin-denin-Dinukleotid) och FMN (1p, en räcker). Är prostetiska grupper (1p). Ingår liksom ND + /NDH i oxidationer och reduktioner och kan ta emot och avge två elektroner, men kan också ta emot och avge en elektron i taget (1p). 9. Enzymet glycerolkinas saknas i fettvävnad. lycerol-3-fosfat är en av byggstenarna i biosyntesen av triacylglycerol. Fettceller är specialiserade på syntes och nedbrytning av triacylglyceroler, men de kan inte direkt använda glycerol eftersom de saknar enzymet glycerolkinas, som katalyserar reaktionen glycerol + P glycerol-3 fosfat + DP. Förklara hur och från vilket ämne fettvävnaden kan erhålla glycerol-3-fosfat som behövs för syntes av triacylglycerol. (4p) Från glukos (1p). lukos bryts ned i glykolysen (1p) till intermediärerna dihydroxyacetonfosfat (DH) (1p) och glyceraldehydfosfat som är i jämvikt med varandra via enzymet triose-fosfat-isomeras. DH reduceras vidare (1p) till glycerol-3- fosfat enligt: Dihydroxyacetonfosfat + NDH + H + glycerol-3-fosfat + ND +. 10. Vilken av följande aminosyror spelar en avgörande roll i transporten av ammoniumjoner från perifiära vävnader till levern? (1p) a. Serin b. Metionin c. lutamin d. rginin c. lutamin (1p) (1p) Sidan 6 av 12
11. Varför bildas laktat (mjölksyra) i musklerna vid kraftig fysisk ansträngning? Vad händer med laktatet? Varför kvarstår en ökad syreförbrukning/ökat syrgasbehov även en viss tid efter att den fysiska ansträngningen har upphört? (6p) Vid kraftig fysisk ansträngning räcker inte syret till för att ta om hand om allt puryvat från glykolysen (1p), via omvandling till acetyl-o, vidare oxidering i citronsyracykeln och andningskedjan. Istället omvandlas (reduceras) pyruvatet till laktat. Laktatet transporteras från musklerna till levern (1p) där det via glukoneogenesen omvandlas till glukos (1p) som transporteras ut i blodet och tillbaka till musklerna (ori-cykeln) (1p). Laktatet produceras dock i snabbare takt än det hinner tas om hand i ori-cykeln, och överskottet tas om hand efter att ansträngningen har upphört (1p). Det blir ett fortsatt högt syrgasbehov, eftersom det krävs mycket energi för att omvandla laktat till glukos (1p) (i form av P, 6 mol per mol laktat). 12. Du har försovit dig och rusar iväg på seminarieredovisning utan att äta frukost. Vid ett-tiden på dagen känner du att det börjar bli svårt att koncentrera sig och du får huvudvärk etc. Förklara kortfattat vilket samspel som råder mellan lever, muskel och fettvävnad vid ovan nämda situation. nge endast huvuddragen i de metaboliska vägarna (max. 1sida inkl. eventuell figur). (10p) Under natten har levern använt en stor del av sitt glykogen till att bibehålla glukoshalten i blodet. Fram emot lunch börjar leverglykogenet ta slut (1p). Blodsocker-halten sjunker och man blir trött och får koncentrationssvårigheter. Muskelproteiner börjar brytas ned (1p). lanin transporteras till levern för syntes av glukos via glukoneogenesen (1p), glukos transporteras ut i blodet (1p). Fettsyror från fettvävnad frisätts (1p) och transporteras ut i blodet för att användas som energi i muskel och lever (1p). lycerol från triaylglycerolerna transporteras till levern (1p) för syntes av glukos (1p). Brist på oxalacetat i levercellerna medför att ketonkroppar produceras och utsöndras i blodet (1p). Ketonkropparna används av bl.a. musklerna till energi (1p). Ketonkroppar bär åtminstone en del av skulden till att man får huvudvärk. 13. Varför produceras mindre P av det NDH som genereras i cytosolen och sedan transporteras in i mitokondrierna via glycerolfosfat-skytteln jämfört med det NDH som produceras i mitokondrierna (2p)? Hur mycket energi i form av P erhålls (1p)? (3p) NDH-ekvivalenter från cytosolen transporteras in som glycerolfosfat i mitokondrierna (1p). lycerolfosfat omvandlas till dihydroxyaceton av det membranbundna Sidan 7 av 12
enzymkomplexet glycerolfosfatdehydrogenas där två elektroner överförs till FD (1 p) som då reduceras till FDH 2, som i sin tur lämnar över elektronerna till Q i andningskedjan. Endast 1.5 P bildas vid oxidationen av FDH 2 (1p) medan oxidation av NDH som bildats i mitokondrien ger 2.5 P. 14. Fotosyntes. a) Illustrera med en skiss huvudkomponenterna i fotosyntesens ljusreaktion (5p). Besvara sedan följande frågor: b) Var sker fotosyntesens ljusreaktion hos växter? (1p) c) Vad heter den vanligaste ljusinfångande komponenten hos växter? (1p) d) Varifrån tas elektronerna? (1p) e) Vilken är den slutliga elektron-mottagaren? (1p) (9p) a) I figuren ska finnas fotosystem II (PS II, P680) (1p), cytokrom bf-komplex (1p) och fotosystem I (PS I, P700) (1p). Max 2p till för: antennkomplex eller LH (light harvesting complex) (0.5p), syre-genererande komplex eller Z (0.5p), plastokinon-pool (0.5p), plastocyanin (0.5p), ferredoxin (0.5p), P-syntas (0.5p), ferredoxin-ndpoxidoreduktas (0.5p). b) Fotosyntesen sker i kloroplasternas tylakoidmembran (1p). c) Klorofyll (1p). d) Från vatten (1p). e) NDP + (1p). Sidan 8 av 12
15. Vilket av följande alternativ är en korrekt beskrivning av nukleinsyror? a) Ett antal nukleotider sammanhållna med N-glykosidbindningar. b) Polymerer av nukleotider sammanlänkade med 3' 5' fosfodiesterbindningar. c) De är alltid dubbelsträngade molekyler. d) Polymerer av nukleotider sammanlänkade med eterbindingar. lternativ b) är korrekt. (1p) (1p) 16. Vilka av följande påståenden gäller för nukleotiden tymidin? a) Kan baspara med adenin i DN. b) Ersätts av uridine i RN. c) Har en metylgrupp som kan delta i hydrofoba interaktioner. d) Har samma koncentration som adenin i DN. e) lla påståenden ovan är korrekta. lla påståenden är korrekta. (1p) (1p) 17. Skriv RN sekvensen som syntetiseras vid transkription av nedanstående DN (2p). Markera 5 -respektive 3 -ände på RNt (1p). ntag att initieringen av translationen sker på ert RN vilket är det första (start) kodonet (1p)? 5 3 3 5 5 UUUUU 3 1p för sekvensen. 1p för U istället för. 1p om 3 och 5 ändar är rätt markerade. U = start codon 1p (4p) Sidan 9 av 12
18. I bakterier kan transkriptionen av vissa gener starta under speciella förhållanden, t.ex. när bakterien värms upp ('heat-shock'-gener induceras) eller vid t.ex. sporulering. ener som uttrycker s.k. 'housekeeping'-proteiner är dock påslagna hela tiden. Beskriv hur RN-polymeraset hos bakterier, som består av olika subenheter/faktorer, kan känna igen olika typer av gener d.v.s. när de skall uttryckas eller vara tysta. (2p) Olika sigmafaktorer (1p) binder till olika promotor-sekvenser (1p) och dirigerar därmed RN polymeraset till rätt gen. 19. PR är en mycket användbar metod för att kopiera DN. a) Beskriv, gärna med bild, hur PR reaktionen fungerar (3p). b) Varför är det viktigt att använda DN-polymeras från termofila organismer, dvs organismer som växer vid hög temperatur, vid PR? (Skulle metoden fungera med humant DN-polymeras?) (1p) (4p) a) Ingredienser primer 1. denature 95 º 3. copy DN polymeras 2. anneal 50 º 72 º new cycle DN templat i) 'Denaturation' (denaturering): DN-strängarna i templatet denatureras (separeras från varandra) vid hög temp ~95 º (1p). ii) 'nnealing': emp sänks till runt 50 º då korta DN-oligos (primers) binder till komplementära sekvenser i ändarna av det DN-avsnitt man vill amplifiera (1p). iii) 'Extension' (elongering): emp. höjs till ca 72 º då DNpolymeraset (aq) aktiveras och börjar syntesen av komplementära strängar vilket resulterar i två kopior av ursprungs DNt (1p). Hela processen upprepas flera gånger vilket medför att DNt kopieras exponentiellt. En tydlig bild med all info räcker som svar. b) PR fungerar enbart med DN-polymeraser som är aktiva vid elongeringstemperaturen, dvs ofta vid 72 º. Dessutom måste polymeraset överleva vid Sidan 10 av 12
temperaturer över 95 º (då DN strängarna smälts isär). Därför används DNpolymeraser som isolerats från bakterier som lever vid höga temperaturer, t.ex. i varma källor (1p). Det går ej att använda humant DN-polymeras eftersom polymeraset förstörs vid höga temperaturer (endast 37 º i våra kroppar). 20. Du har en samarbetspartner i Ungern, som är väldigt duktig men lite slarvig. Hon har satt in genen som du är intresserad av i en plasmid, och skickat den till dig. yvärr har hon blandat ihop plasmid innehållande genen och plasmid B utan gen, så de skickas i samma eppendorfrör. a) Du är bara intresserad av plasmid, eftersom den innehåller din gen. Det är för liten mängd plasmider i röret för att du ska kunna använda gel-elektrofores för att isolera plasmid. Hur gör du för att skilja på plasmiderna, med hjälp av de metoder du lärt dig på laborationerna? (2p) b) Du måste också kontrollera att du har fått de rätta plasmiderna. Du har kartor över de två plasmiderna, och ser där vilka restriktionsenzym som klipper var. Du vet också att genen innehåller 1500 baspar, hela plasmid 5000 baspar, och plasmid B följaktligen ungefär 3500 baspar. Hur använder du den informationen för att kontrollera att du har fått de rätta plasmiderna? (1p) (3p) a) ransformera in plasmiderna i kompetenta bakterier (0.5poäng). Sprid ut de transformerade bakterierna på plattor innehållande IP och Xgal (0.5p) och ampicillin (0.5p). Plocka sen en en vit koloni som bör innehålla plasmid, och en blå koloni som bör ha plasmid B. Sätt övernattskulturer av var och en och rena fram plasmiderna (0.5p). b) Klipp båda plasmiderna med restriktionsenzymen Sac1 och HindIII (eller nån annan lämplig blandning). Separera DN-fragmenten med agaros-gel-elektrofores, uppskatta deras storlek och jämför med förväntade värden. (1p) Med Sac1 och HindIII blir det två band med båda plasmiderna. Det ena bandet ska vara exakt lika stort, ca. 3500 baspar. Det andra bandet kommer med plasmid att vara ca. 1500 baspar, medan det är pyttelitet med plasmid B. Det kan också fungera att klippa med bara ett restriktionsenzym (det Sidan 11 av 12
svaret ger också 1p). Då får man bara ett band med varje plasmid, som kommer att vara olika stora, ca 5000 baspar med plasmid och ca. 3500 med plasmid B, men ju större DN-fragmenten är desto närmare hamnar de på gelen och uppskattningen av storleken blir mer osäker. Sidan 12 av 12