Tentamen med svarsmallar Biokemi BI0741, 10:e jan 2008, Max poäng = 81 p. Slutlig gräns för godkänd = 42 p (52 %).

Transkript

1 Tentamen med svarsmallar Biokemi BI0741, 10:e jan 2008, Max poäng = 81 p. Slutlig gräns för godkänd = 42 p (52 %). 1. a) Vad krävs för att en (kemisk) reaktion ska kunna ske spontant? (1p) b) Vad kallas den drivande kraften som gör att membraner hålls ihop och att proteiner veckar sig? Hur fungerar den? (1p) c) Vilka atomslag kan fungera som acceptor eller donor i vätebindningar i biologiska system? (1p) d) I ett protein upptäcker du en vätebindning mellan sidokedjan hos en glutaminsyra (Glu) och syret i en asparaginsidokedja. Vilken laddning har då Glu-sidokedjan? Rita en förklarande skiss! (1p) (4 p) a) Gibbs fria energi måste minska (1p), dvs produkterna måste ha lägre fri energi än utgångsämnena (!G =!H T!S < 0). b) Hydrofoba effekten (0.5p). Hydrofoba delar av lipider eller proteiner klumpar ihop sig för att undgå kontakten med vatten. (0.5p) c) Kväve, syre, (svavel). (1p) d) Syret i asparaginsidokedjan är ett karbonylsyre (dubbelbundet till kol) och där finns alltså inget väte. För att det ska kunna bli en vätebinding måste det då finnas ett väte i karboxylgruppen hos glutaminsyra som alltså måste vara protonerad och således oladdad. (1p) 2. Aminosyrors egenskaper a) Rita en fri aminosyra, vilken som helst, vid neutralt ph. (2p) b) Visa hur den reagerar med en andra aminosyra, balansera reaktionen. (1p) c) Vilken sorts förening bildas? (1p) a, b) H H 3 N C! R 1 COO H H 3 N C! R 2 COO (4 p) H 2 O H H 3 N C! R 1 C O H N C! R 2 COO H Sidan 1 av 10

2 c) Det bildas en dipeptid. Poängsättning: aminogrupp (0.5p), karboxylgrupp (0.5p), laddningar (0.5p), H 2 O spjälkas (0.5p), peptidbindning (1p), dipeptid (1p) 3. Fyra olika nivåer av proteinveckning kan särskiljas och varje nivå stabiliseras av olika typer av bindningar. Para ihop varje nivå med rätt sorts bindning(ar) med raka linjer. Observera att det kan finnas mer än en möjlig binding till varje nivå. Varje rätt svar ger 1 p och varje felaktigt svar ger minus 0.5 p. Max poäng 6 p. Primär struktur (aminosyrasekvens) Sekundärstruktur ("-helix, #-flak) Tertiärstruktur Hydrofoba kraften Jonbindning Peptidbindning Disulfidbindning Vätebindning Kovalent bindning Kvarternärstruktur van der Waals krafter (6p) Primärstruktur stabliseras av peptidbindning, som är en kovalent bindning. Sekundärstrukturen stabiliseras av vätebindningar. Den största stabiliserande effekten på tertiärstrukturen utövas av den hydrofoba kraften. Vätebindningar, jonbindningar och van der Waals-krafter bidrar också till stabiliteten av tertiärstrukturen. I förekommande fall kan disulfidbryggor förekomma. Dessa är kovalenta i sin karaktär. När det gäller kvarternärstrukturen varierar det från fall till fall vilka krafter/bindningar har den största bidraget till stabiliseringen. Rent allmänt inverkar samma krafter och bindningar som för tertiärstrukturen. I vissa fall är hydrofoba kraften betydande (t. ex. mellan L subenheterna i det dimera Rubisco från vissa fotosyntetiserande bakterier). I andra fall hålls kvarternärstrukturen ihop av ett litet antal jonbindningar. Vätebindningar kan också ha betydelse, och van der Waalskrafter är alltid att räkna med. I sällsynta fall även disulfidbryggor. Primär struktur (aminosyrasekvens) Sekundärstruktur ("-helix, #-flak) Tertiärstruktur Hydrofoba kraften Jonbindning Peptidbindning Disulfidbindning Vätebindning Kovalent bindning Kvarternärstruktur van der Waals-krafter Sidan 2 av 10

3 4. Proteinrening a) När man isolerar proteiner är jonbyteskromatografi en ofta använd metod. Vilka principer bygger metoden på? Beskriv också kortfattat hur ett typiskt sådant experiment kan utföras. (2p) b) Proteinet Y har visat sig binda till en jonbytare med liganden DEAE (positvt laddad ligand) vid ph 6.4. Proteinet verkar dock av någon anledning vara något instabilt vid detta ph och du beslutar dig därför att byta till en buffert med ph 7.8. Tror du att Y som har en isoelektrisk punkt på 5.2 fortfarande binder till DEAE i detta fall? Varför? (1p) (3 p) a) I jonbyteskromatografi utnyttjar man förmågan hos laddade molekyler, i detta fall proteiner, att binda reversibelt till immobiliserade laddade grupper. Beroende på proteinets laddning vilket i sin tur beror av ph väljer man positivt eller negativt laddade ligander. (1.0 p) Ett experiment kan gå till på så sätt att man packar en kolonn med önskad jonbytare och jämviktar denna i en buffert med låg jonstyrka och lämpligt ph. Provet appliceras och kolonnen tvättas i ett första steg med bufferten med låg jonstyrka (c:a 2-3 kolonnvolymer) så att obundet material ska få tillfälle att tvättas bort från kolonnen. Bundet material kan därefter elueras genom att jonstyrkan höjs eller att ph ändras. (1.0 p) b) Ja, Y binder sannolikt till DEAE vid ph 7.8. Y som har en isoelektrisk punkt på 5.2 bör ha en negativ nettoladdning vid alla ph:n som överstiger detta värde. Y har alltså troligen en ännu större negativ nettoladdning vid ph 7.8. (1 p) 5. a) Definiera och beskriv kortfattat de tre stegen i molekylärbiologins "centrala dogma", flödet av den genetiska informationen. (3p) b) Varför kan man förutsäga ett proteins aminosyrasekvens om man känner genens nukleotidsekvens, men ej bestämma en gens nukleotidsekvens om man känner proteinets aminosyrasekvens? (2p) (5 p) a) DNA -> DNA = replikering (0.5p). DNA kopieras genom att varje kedja bildar mall för komplementär kopiering (0.5p). DNA -> RNA = transkription (0.5p). Vissa delar av DNA kopieras till RNA. En kedja i DNA är mall för komplementär kopiering (0.5p). RNA -> protein = translation (0.5p). mrna används som mall för syntesen av protein på ribosomen (0.5p). För varje aminosyra som inkorporeras i proteinet passas tre baser i mrna (kodonet) ihop med antikodonet på den trna-molekylen som för in aminosyran till peptidsyntesen. b) Varje kodon i gensekvensen svarar mot en enda aminosyra (1p), därför kan vi förutsäga proteinets sekvens från gensekvensen. Däremot så finns det mer än ett kodon för de flesta aminosyrorna (1p), dvs. flera alternativa sekvenser är möjliga. 6. Förklara kortfattat följande begrepp: a) Intron (1p) b) Restriktionsenzym (1p) c) cdna (1p) Sidan 3 av 10

4 d) Rekombinant genexpression (1p) e) PCR, Polymerase chain reaction (1p) (5 p) a) Intron: Bitar av eukaryota gener som inte översätts till protein (1p) utan klyvs bort under processning av RNA till mrna, som sedan används som mall för proteinsyntes. b) Restriktionsenzymer känner igen sekvenser i dubbelsträngat DNA, och klyver båda strängarna på ett specifikt ställe i den igenkända sekvensen. (1p) c) cdna: 'complementary DNA', "omvänd" DNA-kopia av ett mrna som görs med hjälp av enzymet omvänt transkriptas ('reverse transcriptase'). (1p) d) Rekombinant genexpression: Att olika DNA-bitar, gener eller delar av gener, kombineras ihop på ett nytt sätt och sätts in i en organism där genen uttrycks (1p). Oftast menas med expression att proteinet produceras som genen kodar för. (Men det kan också vara en genkonstruktion där den funktionella produkten är RNA, t.ex. "antisense"-rna som basparar komplementärt med ett mrna och hindrar att det translateras.) e) PCR är förkortning av 'Polymerase Chain Reaction' som är en teknik för att mångfaldiga en bestämd DNA-sekvens (1p). Bygger på att man använder ett termostabilt DNA-polymeras som klarar av att man hettar upp provet till 95 grader för att separera DNA-strängar. Med hjälp av syntetiska oligonuklotider, 'primers', styr man att ett visst sekvens-avsnitt av DNA replikeras och mångfaldigas. 7. Hemoglobin. a) Vilken prostetisk grupp finns i hemoglobin? (0.5p) b) Syre binder till en metalljon i denna grupp. Vilken metalljon? (0.5p) c) Beskriv kortfattat vad positiv kooperativitet innebär, hur det uppkommer hos hemoglobin och vad mekanismen kallas. (2p) d) Myoglobin är mycket likt hemoglobin, men uppvisar inte positiv kooperativitet i binding av syre. Varför? (1p) e) Cytokrom C innehåller samma prostetiska grupp som hemoglobin och myoglobin, men kan inte binda syre. Varför? (1p) (5p) a) Hemoglobin har heme/hem/häm som prostetisk grupp (0.5p). b) Syret binder till en järnjon som sitter i heme-gruppen (0.5p). c) Positiv kooperativitet innebär att affiniteteten (bindningsstyrkan) för syre ökar med ökad koncentration av syre (0.5p). Hemoglobin består av fyra subenheter. De kan anta två olika former, en som binder syre starkt (R) och en som binder svagare (T). Bindingen mellan subenheterna styr dem att anta samma form. När syre binds till en av subenheterna så stabiliseras R-formen, även hos de andra subenheterna, så att de lättare binder syre (1p). Mekanismen kallas för allosteri (0.5p). d) Myoglobin består bara av en subenhet (1p). e) I hemoglobin (och myoglobin) binder syret till en ledig ligandplats på järnet i heme-gruppen, men i Cytokrom C finns ingen plats för syrebindindning eftersom den upptas av en extra ligand till järnet, en metionin-sidokedja. (1p) Sidan 4 av 10

5 8. Enzymet E som följer Michaelis-Menten-kinetik har K m = 40 µm (mikromolar). Initiala reaktionshastigheten v 0 är 10 µm/min (mikromolar/minut) vid en substratkoncentration på 20 mm (millimolar) och enzymkoncentrationen [E] tot 2 nm (nanomolar). Vad blir den initiala hastigheten v 0 a) om vi dubblar substratkoncentrationen vid samma enzymkoncentration, [S] = 40 mm (millimolar)? (0.5p) b) om substratkoncentrationen [S] är 40 µm (mikromolar) vid samma enzymkoncentration? (0.5p) c) om substratkoncentrationen [S] är 10 µm (mikromolar) vid samma enzymkoncentration? (0.5p) d) om vi istället dubblar enzymkoncentrationen vid samma substratkoncentration, ([S] = 20 mm, [E] tot = 4 nm)? (0.5p) e) om vi tillsätter 0.1 mm av en kompetitiv inhibitor med K i = 0.1 mm, ([S] = 20 mm, [E] tot = 2 nm, [I] = 0.1 mm, K i = 0.1 mm)? (0.5p) f) om vi tillsätter 0.1 mm av en icke-kompetitiv inhibitor med K i = 0.1 mm, ([S] = 20 mm, [E] tot = 2 nm, [I] = 0.1 mm, K i = 0.1 mm)? (0.5p) g) Hur påverkar enzymets K m respektive k cat förhållandet mellan koncentrationerna av substrat och produkt vid jämvikt? (1p) (4p) När [S] = 20 mm gäller [S] >> K m (substratkonc är mycket större än K m ), och alltså är v 0 = Vmax = 10 µm/min a) v 0 = 10 µm/min (0.5p). För varje substratkoncentration större än 20 mm gäller fortfarande att v 0 = Vmax = 10 µm/min. b) v 0 = 5 µm/min (0.5p). När [S] = K m gäller att v 0 = Vmax/2, eller 5 µm/min. c) v 0 = 2 µm/min (0.5p). Eftersom K m och V max är kända, kan Michaelis-Menten ekvationen användas för att beräkna v 0 vid varje substratkoncentration: v 0 = V max [S] / ( K m + [S] ). För [S] = 10 µm gäller: v 0 = (10 µm/min) (10 µm) / (40 µm + 10 µm) = 100/50 µm/min = 2 µm/min. d) v 0 = 20 µm/min (0.5p). Hastigheten är proportionell mot enzymkoncentrationen. Dubbelt så hög enzymkoncentration ger dubbel hastighet. e) v 0 = 10 µm/min (0.5p). En kompetitiv inhibitor konkurrerar med substratet om att binda till enzymet, men i detta fall är substratkoncentrationen så hög att inhibitorn inte kan konkurrera märkbart med substratet om bindning till enzymet. f) 5 µm/min (0.5p). En icke-kompetitiv inhibitor binder till enzymet och inhiberar reaktionen oberoende av hur hur hög substratkoncentrationen är. I det här fallet är [I] = K i och inhibitorn binder till och inhiberar hälften av enzymmolekylerna. g) Inte alls (1p). Förhållandet mellan koncentrationerna av substrat och produkt vid jämvikt bestäms av den termodynamiska skillnaden i fri energi mellan substrat och produkt, medan K m och k cat är uttryck för förhållanden mellan hastighetskonstanter. 9. Enzymreglering. a) Fosfofruktokinas 1 (PFK-1) är ett enzym i glykolysen som katalyserar fosforyleringen av fruktos-1-fosfat till fruktos-1,6-bisfosfat. Varifrån kommer 6- fosfat-gruppen? (1p) Sidan 5 av 10

6 b) PFK-1 aktiveras av bl.a. AMP och inhiberas av bl.a. citrat. Med vilken typ av regleringsmekanism? (1p) c) Förutom PFK-1 så är ytterligare två enzymer i glykolysen reglerade, nämligen hexokinas och pyruvatkinas. Vad har dessa tre steg i glykolysen gemensamt som gör att de är hårt kontrollerade? (1p) d) En annan reglermekanism används ofta vid hormonell kontroll, t.ex. för att styra nedbrytning och syntes av glykogen genom att enzymerna glykogen-syntas och glykogen-fosforylas sätts på eller stängs av. Vad kallas mekanismen som stänger av/sätter på enzymerna, och vad innebär den? (2p) e) En tredje mekanism som vi stött på kontrollerar aktiviteten hos serin-proteaserna från bukspottkörteln, trypsin, kymotrypsin och elastas, som används i matsmältningen. Vad kallas denna mekanism och hur fungerar den? (2p) (7p) a) Fosfatgruppen kommer från ATP. (1p) b) Allosterisk reglering. (1p) c) Dessa tre steg förbrukar ATP och frigör mycket energi (stort negativt delta-g) och kan betecknas som metaboliskt irreversibla steg. Sådana steg är oftast hårt reglerade för att inte ATP ska förbrukas och energi frigöras i onödan. (1p) d) (Protein-)fosforylering (1p). Enzymet stängs av eller sätts på genom att en fosfatgrupp sätts på eller tas av från ett speciellt fosforyleringsställe på enzymet (1p). e) Proteolytisk aktivering (1p). Enzymet syntetiseras som ett inaktivt pro-enzym (zymogen), och aktiveras genom att en eller flera peptidbindingar i proteinet hydrolyseras av ett proteas (1p). 10. Membrantransport och signaltransduktion a) Vad är skillnaden mellan aktiv och passiv transport av små molekyler genom lipidmembraner? (1p) b) Hur sitter en G-proteinkopplad receptor 'fast' i cellmembranet? (1p) c) Redogör för hur en G-proteinkopplad receptor och dess G-protein kan ta emot en extracellulär signal och vidarebefordra signalen intracellulärt (2p). d) En viktig funktion i all cellsignalering är att aktivering snabbt kan bytas mot inaktivering, detta för att en signalväg inte skall vara 'påslagen' för länge. Hur blir vanligtvis ett G-proteins alfasubenhet inaktiverat? (1p) (5 p) a) Aktiv transport sker över/genom ett membran mot en koncentrationsgradient (koncentrationen m.a.p. den typ av molekyl som skall transporteras) och kräver energi (0.5p). Passiv transport sker med en koncentrationsgradient, dvs koncentrationsutjämnande, och utnyttjar den lagrade energin i gradienten (0.5p). b) En G-protein-kopplad sk. 7TM-receptor sitter integrerad i cellmembranet med sju stycken membrangenomspännande alfa-helixar. (1p) c) 1. Receptorn akiveras av yttre stimuli, beroende på receptortyp kan det t.ex. vara ett hormon, ljus eller luktämnen (0.5p) 2. GDP sitter bundet i det inaktiva G-proteinets alfa-subenhet. När receptorn akiverats kan GDP bytas ut mot GTP. (0.5p) 3. G-proteintrimeren dissocierar då i en alfasubenhet och en beta/gammasubenhet.(0.5p) Sidan 6 av 10

7 4. Den aktiva alfasubenheten kan diffundera iväg och aktivera (eller i vissa fall inhibera) sina målproteiner, t.ex. adenylatcyklas, fosfodiesteras eller fosfolipas C. (0.5p) d) G-proteiner har vanligtvis en egen GTPas-aktivitet, inte en särskilt effektiv sådan men ändå betydligt snabbare än en spontan hydrolys av GTP. När GTPaset hydrolyserat GTP till GDP + fosfat är alfasubenheten inaktiv och kan åter associera med en beta/gamma-subenhet till en G-protein-trimer. (1p) 11. Råa ägg innehåller proteinet avidin som hindrar upptaget av B-vitamin, speciellt vitaminet biotin. Vilka två metaboliska vägar nedan påverkas av att avidin reducerar biotins medverkan i metaboliska processer (2p; fel alternativ ger minuspoäng)? Motivera svaret. (1p) a. Laktat! Glukos b. Fumarat! Malat c. Alanin! Glukos d. Propionyl-CoA! Succinyl-CoA (3 p) Reaktion a och c påverkas (2p; varje rätt alternativ ger +1p, varje fel -1p; minimum 0p). Glukos bildas från dessa ämnen via karboxylering av pyruvat till oxaloacetat. Den reaktionen katalyseras av enzymet pyruvat-karboxylas som kräver biotin som prostetisk grupp för karboxyleringsprocessen (1p). 12. Glykolys sker i cytoplasman medan fettsyranedbrytningen sker i mitokondrien. Nämn två metaboliska vägar som sker delvis i både mitokondrien och cytoplasman? (2 p) Ureacykeln (1p) och glukoneogenesen (1p). 13. Vid ett friidrottspass uppmättes mjölksyrahalten i blodet, före under och efter ett 400- meters sprintlopp (se diagram nedan). a) Vad orsakar den snabba ökningen i mjölksyra-koncentrationen i blodet? (1p) b) Vad orsakar nedgången av mjölksyra efter avslutat lopp? (1p) (2 p) Före Lopp Efter Koncentration av mjölksyra i blod,!m Tid, min Sidan 7 av 10

8 a) En kraftig glykolys under anaeroba förhållanden.(1p) b) När syretillgången ökar sker omvandling av laktat till glukos via glukoneogenes i levern. (1p). 14. Vilka effekter har var och en av dessa gifter på elektrontransporten och ATPproduktionen? a) Rotenon b) Antimycin A c) KCN d) Di-nitrofenol e) Kolmonooxid (5 p) a) Rotenon blockerar elektrontransporten och utpumpandet av protoner vid komplex 1 (NADH-Q oxidoreductase) i andningskedjan. (1p) b) Antimycin A blockerar elektronstransporten och utpumpandet av protoner vid enzymkomplex III (Q-cytochrome c oxidoreductase). (1p) c) KCN blockerar elektrontransporten och utpumpandet av protoner vid komplex IV (cytochrome c oxidase). (1p) d) Elektronflödet påverkas inte, men ingen ATP produceras eftersom di-nitrofenol frikopplar andningskedjan (förstör protongradienten, endast värme bildas). (1p) e) Kolmonooxid blockerar elektrontransporten och utpumpandet av protoner vid komplex IV. (1p) 15. Ange tre olika utgångssubstrat som används för glukoneogenes. Glycerol, laktat och aminosyror. (3p) (3 p) 16. Aspartataminotransferas är det aminotransferas som uppvisar den högsta aktiviteten av alla aminotransferaser i levern hos de flesta landlevande däggdjur. Förklara varför, dvs. i vilken rekationsväg detta enzym deltar och som gör att det är viktigt med hög aktivitet. (2 p) I ureacykeln överförs den andra aminogruppen från aspartat som genereras genom att glutamat transamineras till oxalacetat, en reaktion som katalyseras av aspartataminotransaminas. Detta medför att ca 50% av alla aminogrupper som utsöndras som urea måste passera igenom aspartataminotransferas-reaktionen. (2p) 17. Efter några dagars svält ökar nivån av ketonkroppar i blodet. a) Varifrån härrör dessa substanser? (1p) b) Vad är den biokemiska orsaken till att de bildas? (2p) c) Hur och var utnyttjas dessa metaboliter? (2p) Sidan 8 av 10

9 (5 p) a) Ketonkroppar kommer från fettsyra-nedbrytningen (1p). b) Vid svält finns för lite oxaloacetat tillgängligt i citronsyracykeln (i levern). Istället slås acetyl-coa ihop och bildar ketonkroppar. (2p) c) Ketonkropparnas klyvs tillbaka till acetyl-coa och utnyttjas som energisubstrat i muskler och nervvävnader. (2p) 18. Skelettmuskeln är den vävnad som kvantitativt utgör det största glykogenförrådet i kroppen (3/4).Trots detta är det huvudsakligen levern som svarar för regleringen av blodglukosnivån. Ge en förklaring till varför inte glykogen från skelettmuskeln används till att reglera blodglukosnivåerna. (2 p) Muskeln saknar enzymet glukos-6-fosfatas som spjälkar bort fosfatgruppen och bildar fritt glukos. Muskeln använder därför sitt upplagrade glykogenförråd själv. (2p) 19. Fotosyntes a) Visa schematiskt principen för fotofosforylering (fotosyntetisk ATP-syntes). Förklara också med ett par meningar principen. (4p) b) Hur skiljer sig den cykliska fotofosforyleringen från den icke-cykliska? (Ledning: vilken väg tar elektronerna och vilken/vilka föreningar bildas?). (2p) (6 p) a) Solljuset driver en elektrontransport i tylakoidmembranet (1p). Detta driver en samtidig transport av protoner från stroma till tylakoidens lumen (1p), som ger upphov till en protongradient (1p). Gradienten utjämnas genom transport av protoner tillbaka till stroma genom enzymet ATP-syntas (1p), varvid ATP syntetiseras från ADP och Pi. Skissen kan naturligtvis vara mer detaljerad och innehålla två fotosystem, cytokrom b/fkomplex, etc., men detta är inte nödvändigt då endast principen efterfrågas. b) Cyklisk elektrontransport leder till syntes av ATP utan samtidig reducering av NADP + till NADPH medan icke-cyklisk elektrontransport producerar både ATP och reducerat NADPH (1p). I cyklisk elektrontransport förs elektroner från ferredoxin till plastoquinonpoolen, vidare till cytokrom b/f-komplexet, till fotosystem I och tillbaka till ferredoxin (d.v.s PSII deltar inte och NADP + reduceras inte) (0.5p). Protongradienten bildas genom transport av protoner genom cytokrom b/f-komplexet (0.5p). Sidan 9 av 10

10 20. Redogör för enzymet Rubiscos roll i a) fotosyntetisk kolfixering (1p) och b) det globala kolkretsloppet (1p). c) Vilken egenskap hos Rubisco gör att utbytet från fotosyntesen kan variera avsevärt? (1p) (3 p) a) Enzymet Rubisco katalyserar den reaktion i vilken atmosfäriskt koldioxid (CO 2 ) fixeras i organiska föreningar (1p). (CO 2 binds först till ribulos-1,5-bisfosfat, som spjälkas till (2 molekyler) 3-fosfoglycerat. Den senare föreningen omvandlas vidare i Calvincykeln till socker eller stärkelse). b) Rubisco katalyserar den enda betydande reaktion där atmosfäriskt kol binds i organiskt kol (1p). Detta betyder att allt kol i kretsloppet någon gång har besökt enzymets aktiva yta. c) Rubisco katalyserar en konkurrerande reaktion, där luftens syre binds till organiska föreningar (1p). Produkten från denna oxygeneringsreaktion, fosfoglycerat, omvandlas i flera steg i fotorespirationen. Sidan 10 av 10