Grupp: Pyrola Sandberg, Hanna Norlin och Hanna Arvidsson Kurs: Biokemi VT 2003 Inlämningsdatum: 2003-06-03 Handledare: Hans Eklund
Innehåll Abstract Inledning Bakgrund Enzymlänkade receptorer Tillväxthormonet binder till receptorn Prolaktin Referenser
Abstract The purpose with this project was to learn more about growth hormone. Growth hormone is a signal substance which tells the body parts when its time to grow. The growth hormone binds to two receptors that send the signals forward to the adaptor protein. This project will take you deeper in how the growth hormone binds to its receptor and how the growth hormone binds to the prolactin receptor. Inledning Syftet med projektarbetet var att fördjupa sig i någon del som vi inte han gå in på under kursens gång. Vi valde att läsa mer om tillväxthormoner och om hur tillväxthormonet binder till sin receptor. Vi tar även upp prolaktin receptorn, ett hormon med egenskaper liknande tillväxthormonets. För att få en övergripande bild av tillväxthormonets signalväg är den här bilden bra att titta på. Bild 1 Tillväxthormoner är ett signalämne som talar om för de olika kroppsdelarna att de ska växa. Hos människor bildas det i hypofysen. Hypofysen producerar tillväxthormon (GH) som tas upp av tillväxthomon receptorn (GHR). Den aktiverade receptorn fosforylerar Grb-2. Grb-2 länkar fosforuleringen av EGF-receptorn till att stimulera cellväxt genom en kedja av proteinfosforyleringar. Grb-2 binder till en fosforylerad del av receptorn med domänen SH2. Grb-2 rekryterar ett protein, sos, som interagerar med Grb-2 genom två SH3-domäner. Sos i sin tur binder och aktiverar RAS, en mycket bra signalöverförare. Då Ras är aktiverat binder detta till andra komponenter som i sin tur leder till aktivering av specifika serin-treonin proteinkinaser. Proteinkinaserna fosforylerar specifika mål som ger upphov till cellväxt. Peptidhormoners receptorer är sensoriska maskiner som leder celler till t ex förökning eller död. Tillväxthormonets receptor tillhör klassen cytokin eller den hematopoietic superfamiljen för hormoners receptorer som medlar signaler från mer än 20 kända cytokin som tillexempel
interleukin, erythropoietin och prolaktin, såväl som växtfaktorer. Medlemmar av denna superfamiljs receptor har en tredomäns organisation inkluderat en extracellulär ligandbindningsdomän bestående av 250 aminosyror, ett ensamt transmembransegment och en intracellulär domän bestående av 350 aminosyror som skiljer sig i sekvens bland familjemedlemmarna. Likt andra hormoner i klassen cytokines har tillväxthormon en hopbuntad fyra-helix struktur.tillväxthormonet är ett monomeriskt protein bestående av 217 aminosyror. Tillväxthormonets receptor består av 638 aminosyror. Två utav _-helixarna, A och D, är långa (runt 30 aminosyror ) och de andra två, B och C, är runt 10 aminosyror kortare. Likt andra buntade fyra-helix strukturer är den inre kärnan av bunten gjord av nästan bara hydrofoba rester. Topologin av fyra-helixen är upp-upp-ner-ner med två överkorsande förbindelser från ena änden till den andra änden av bunten, länkande helix A med B och helix C med D. Två korta helixar finns i den första överkorsande förbindelsen och ytterligare en i loopen som förbinder helixarna C och D. Bakgrund Humant tillväxthormon var det första läkemedel som tillverkades industriellt med genteknik och det skedde hos det svenska läkemedelsföretaget Kabi-Vitrum. Somliga människor föds utan förmåga att själva kunna tillverka tillräckligt med växthormon och drabbas då av så kallad hypofysär dvärgväxt. För att hjälpa dem utvecklade Kabi-Vitrum i början av 1970-talet en metod att preparera fram tillväxthormon från hypofysen från avlidna, men de mängder man fick fram kom aldrig i närheten av att täcka efterfrågan. Därför fick den som behandlades med preparatet hormoner från ett stort antal olika avlidna människor, och man var orolig för att få kontamination av prioner, som orsakar Creutzfelts-Jacobs sjuka, den mänskliga varianten av galna ko -sjukan. I mitten av 1970-talet isolerade några amerikanska forskare genen för tillväxthormon. Kabi- Vitrum köpte då genen, förde in bakterier som innehöll genen och odlade upp dem i stora fermentationsbehållare där bakterierna bildade tillväxthormon. Bakterierna slogs sönder och hormon renades fram som efter en tid kunde börja säljas. Enzymlänkade receptorer Tillväxthormonreceptorn och prolactinreceptorn tillhör båda gruppen tyrosinkinas-associerade receptorer, som i sin tur tillhör gruppen enzymlänkade receptorer. Det finns fem stycken grupper med enzymlänkade receptorer; (1) receptortyrosin-kinaser fosforylerar specifika tyrosin aminosyror; (2) tyrosinkinas-associerade receptorer associeras med proteiner som har tyrosinkinas aktivitet; (3) receptortyrosin fosfataser, tar bort fosfatgrupper från tyrosin på specifika intracellulära signalproteiner; (4) transmembranreceptor serin/treonin kinaser, tillsätter fosfatgrupper till sidokedjorna på serin och treonin på målproteiner (target proteins) och (5) transmembran guanyl cyclaser som katalyserar produktionen av cyklisk GMP (guanosin monofosfat) i cytosolen. Den andra gruppen har domäner i cytosolen som saknar definierade katalytiska funktioner. Det är en stor heterogen grupp som innehåller receptorer
för så väl cytokines som för vissa hormoner, t ex tillväxthormoner och prolaktin som beskriv nedan. Tillväxthormonet och dess receptorer Tillväxthormonreceptorn sitter i cellmembranet med en extracellulär domän, en helix i membranet och en intracellulär domän. Den extracelluära delen består i sin tur av två domäner. Dessa båda domäner kallas N-terminal och C-terminal tillsammans består de av 250 aminosyror. Den intracellulära domänen består av 350 aminosyror. När inget tillväxthormon är bundet till receptorn rör den sig över cellmembranet i form av en monomer. Receptorns extracellulära domäner innehåller ett visst antal loopar som binder till varandra och bildar tillsammans ytan där tillväxthormonet binder. Vid bindandet av hormonet används tre av looparna i N-termnalen: A-B, C-D och E-F samt två stycken av looparna i C-terminal domänen: B-C och F-G. Dessa loopar liknar varandra både i aminosyrasekvens och i den tredimensionella strukturen. De två receptorerna binder till hormonet med samma loopområde, medan hormonet binder med totalt olika ytor till de båda receptorerna. Hormonets bindningsytor består av aminosyror från _-helix A och D till den ena receptorn och till den andra receptorn binder hormonet med aminosyror från _-helix A och C. Det finns inga strukturella likheter mellan ytorna. Bindningsytan för A-C är platt medan bindningsytan för A-D är konkav. Inte heller några likheter mellan aminosyrorna finns i dessa bindningsytor. Bild 2 Tillväxthormonet (röd) binder till två stycken receptorer (blå). Varje receptor består av två extracellulära domäner (ljus- respektive mörkblå), samt en intracellulär domän (ej i bild). Receptorernas bindningsyta är looparna markerade med gult. Tillväxthormonet binder till den extracellulära domänen på receptorn med sin A-D-yta och bildar ett första komplex med en receptor. I och med det förändras strukturen hos hormonet vilket gör att en bindning till ytterliggare en receptor favoriseras. Därför kommer hormonet till att binda till ytterligare en extracellulär domän på en annan receptor då den kommer tillräckligt nära med sin A-C aktiva yta och ett andra komplex har bildats. Det andra komplexet har formen av en dimer. Dimeren besår alltså av två receptorer som binder till ett hormon. (se bild 1) Hormonet binder således till två receptorer som ser likadana ut men
hormonet kommer binda med två helt skilda ytor till de båda receptorerna. Den andra bindningen underlättas genom interaktionen mellan C-terminaldomänerna i de två receptorerna. I och med att de två extracellulära domänerna sammanlänkas till ett hormon kommer även de två intracellulära delarna hos receptorerna till att interagera med varandra. Det är det som gör att signalen kan föras vidare i cellen. Det sker genom att proteiner som finns i de intracellulära domänerna aktiveras. Bild 3 Schematisk bild över hur tillväxthormonet fäster till tillväxthormonsreceptorn. Trots att tillväxthormonets bindningsytor är olika binder de likväl till samma plats på receptorn. Skillnaden blir att de får olika bindningsstyrkor. Receptorn täcker 1300 Å 2 av hormonets A-D-bindningsyta medan den täcker 850 Å 2 av hormonets A-C-bindningsyta. Det gör att bindningen med A-D är betydligt starkare. Bindningsstyrkan beror på de specifika interaktionerna som är involverade i bindningen. Men det finns alltså även ett samband mellan bindningsytans storlek och bindningens styrka när proteiner interagerar. Prolaktin receptorn Prolaktin (PRL) är ett hormon som påminner mycket om tillväxthormonet (GH). Antagligen härstammar de från en och samma gen. Deras användningsområden skiljer sig dock betydligt. Prolaktin har flera olika användningsområden hos olika vertebrater. Hos däggdjur så styr prolaktin mjölkproduktionen, hos sötvattenfiskar reglerar det vattenbalansen och saltkoncentrationen och hos fåglar regelerar prolaktin fettmetabolismen. Att prolaktin har så många användningsområden hos de olika arterna tyder på att de har utvecklats under evolutionens gång. Tillväxthormon och prolaktin räknas som skilda hormon bland annat för att de har olika receptorer. Båda receptorerna tillhör samma klass av cytokineser och de liknar varandra mycket. De liknar varandra framförallt i deras vikning medan deras sekvens bara är identisk i 28 %. Domänernas struktur och de aktiva ytorna påminner mycket om varandra men förhållandet mellan domänerna skiljer sig åt mellan tillväxthormon receptorn (GHR) och prolactin receptorn (PLR). Trots det kan tillväxthormonet binda och aktivera även prolaktin receptorn. Tilläxthormonet kommer här bara att binda till en receptor och inte som då hormonet binder till två stycken tillväxthormonreceptorer(ghr) (se bild 3). Hormonet binder till PLR med samma aktiva yta som den skapar den starkare bindningen till GHR. Alltså till den aktiva ytan A-D på tillväxthormonet. Hormonets struktur förändras mycket lite beroende om den binder till GHR eller till PLR. Hur är det då möjligt för hormonet att binda till receptorn trots att förhållandet mellan domänerna skiljer sig åt och att inte alla rester är identiska vid aktiva ytorna?
Bild 4 Hormonet binder bara till en prolactin receptor och inte till två som då den binder till växthormonreceptorn. Faktum är att det som man kan tro ska vara en nackdel, skillnaden i förhållandet mellan domänerna här är en fördel. Receptorernas sekvens vid de aktiva ytorna är nästan identiska men det finns vissa kritiska skillnader. Det är samma loopar hos både växthormon receptorn och prolaktin receptorn som utgör bindningen till hormonet. En av de skillnader som finns är placerad i de fyra första resterna i en av bindningsytorna. Hos GHR är dessa retser: Ser-Val-Asp-Glu. Hos PLR är motsvarande rester: Asp-Val-Thr-Tyr. Det finns ytterligare sju rester som interagerar i den här bindningen men de är identiska hos GHR och PLR och är därför inte särskilt intressanta i den här jämförelsen. Då hormonet binder till GHR så är det en arginin hos hormonet som bildar en saltbrygga till glutamat 127 hos GHR. Hos PLR sitter det en tyrosin 127 istället för glutamat 127. Det är omöjligt för hormonets arginin att bilda en saltbrygga med tyrosins hydroxidjon. Eftersom förhållandet mellan domänerna inte ser likadant ut för PLR som för GHR kommer aspartat 124 kunna komma upp och ta tyrosins plats och därmed kan en saltbrygga bildas mellan homonet och receptorn. Bild 5 Växthormonets Arg 167 bildar en saltbrygga till Glu 127 hos växthormonreceptorn men till Asp 124 hos prolactin receptorn. En annan viktig skillnad mellan de båda receptorerna finns i början på F-G-loopen i C-terminaldomänen. Hos GHR lyder sekvensen Arg-Asn-Ser och de aminosyrorna tar inte någon aktiv del i bildandet av bindningar mellan hormonet och receptorn. Hos prolaktin receptorn finns det tre andra rester: Asp-His-deletion. De interagerar med histidin 18 och glutamat 174 hos hormonet. Tillsammans bildar de en mycket stark bindningsplats för zink.
Då ett zink binder i den här ytan kommer bindningen mellan hormonet och receptorn till att bli mycket stark. Finns det inget zink kan ingen bindning uppstå här. Det är alltså zink som blir den bindande faktorn mellan växthormonet och prolaktin receptorn och i närvaro av zink ökar affiniteten mellan hormonet och prolactin receptorn med 10000 gånger. Zink har ingen effekt för affiniteten mellan hormonet och växthormon receptorn. Bild 6 Om zink är närvarande kommer affiniteten mellan prolactin receptorn och hormonet öka med 10 000 gånger. Zink har ingen effekt på bindningen mellan hormonet och växthormon receptorn. De båda exemplen ovan visar på vikten av sekvensskillnader och skillnaden i relationen mellan domäner för att bindningen ska kunna uppstå mellan växthormonet och de båda receptorerna. Genom att förstå hur det fungerar underlättar man byggandet av modeller för andra aktiva ytor hos andra receptorer och dess hormoner. Det har i sin tur stor betydelse för läkemedelsforskningen. Genom att förstå hur hormoner binder till receptorer, vilka de aktiva ytorna är och hur hormonet och receptorn interagerar med varandra. Samt förstå hur sekvensskillnader kan förändra strukturen och därmed skapa nya bindningsytor och föra fram nya rester till den aktiva ytan och hur domäners förhållande till varandra kan skapa nya bindningar kan nya läkemedel tillverkas. Det gäller inte bara hormoner och deras receptorer utan även smärtreceptorer och alla andra receptorer som finns hos männniskor och djur. Referens
Carl Branden & John Tooze. Introduction to protein structure, 2nd ed. 1999. Garlan Publishing Inc, New York. Jeremy Berg, John Tymoczko, Lubert Stryer, Biochemistry, 5th ed. 2002. W.H. Freeman and Company, New York. Henrik Brändén. Molekylär biologi. 1:a upplagan. Studentlitteratur, Lund.