EULISA ANA Screen 8 IgG

Bruksanvisning EULISA ANA Screen 8 IgG Avsedd användning Enzymimmunoanalys för detektering av autoantikroppar IgG mot dsdna, RNP, Sm, Ro (SS-A), La (SS-B), Scl-70, CENP-B och Jo-1 Mikrotitrering, 96 brunnar Förvara kitet vid +2-8 C Endast för in vitro-diagnostik. Dokument nr E-23-0224-01 Januari 2013 EULISA ANA Screen 8 IgG Svenska 213896 96

Innehåll 1. Introduktion och bakgrund 2. Varningar och försiktighetsåtgärder 3. Testprincip 4. Kitets innehåll 5. Material som krävs men som inte ingår 6. Förvaring av kitet 7. Reagens- och provberedning / provkrav 8. Analysmetod 8.1. Manuell användning 8.2. Dynex DS2 automatiskt ELISA-system 9. Utvärdering och kvalitetskontroll 10. Tolkning av resultat / metodens begränsningar 11. Prestanda 11.1. Standardisering 11.2. Analytisk specificitet 11.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) 11.4. Homogenitet i fast fas 11.5. Linjäritet 11.6. Precision 11.7. Frekvensdistribution av ANA (IgG) 11.8. Manuell drift jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system 12. Garanti 13. Symboler 14. Referenser 15. Sammanfattande flödesschema Den produkt som beskrivs i detta dokument har tillverkats i enlighet med IVDdirektivet 98/79/EG. 2

1. Introduktion och bakgrund Cirkulerande autoantikroppar mot olika intracellulära antigener (antinukleära antikroppar, ANA) är typiska för systemiska autoimmunmedierade reumatiska bindvävssjukdomar (1, 2, 3, 4). Dessa består av systemisk lupus erythematosus (SLE), blandad bindvävssjukdom (MCTD- Mixed Connective Tissue Disease), Sjögrens syndrom (SS) A och B, progressiv systemisk skleros (PSS, sklerodermi)/crest-syndrom och polymyosit (PM). På grund av överlappande symtom är det ofta svårt att ställa diagnos på ovanstående sjukdomar och därför stöds diagnosen oftast av mätning av deras anknutna autoantikroppar. 8 antigener som specifikt känns igen av dessa antikroppar immobiliseras, rad för rad, på den fasta fasen i den aktuella enzymlänkade immunadsorbenta analysen (ELISA): fast antigen källa sjukdom ungefärlig fas autoantikroppsrad prevalens (5) A dsdna plasmid SLE 60-90 % B RNP (proteiner A, C, 68kDa) rekombinant MCTD 95 % SLE 30-40 % PM 14 % SS 4 % C Sm (proteiner B, B', D) bovin tymus SLE 12-39 % MCTD 7 % D SS-A/Ro bovin tymus SS 60-100 % SLE 45-50 % MCTD 15-30 % PSS 5-7 % PM 5-7 % E SS-B/La rekombinant SS 30-90 % SLE 15-30 % MCTD 5-15 % F Scl-70 (DNA-topoisomeras 1) rekombinant PSS 20-76 % G CENP-B (centromert protein B) rekombinant CREST 40-80 % H Jo-1 (Histidyl-tRNA-syntetas) rekombinant PM 20-40 % Testet är utformat för individuell kvalitativ bestämning av IgG-autoantikroppar i humant serum, riktade mot en av ovanstående antigener, som initial diagnos om någon av de anknutna sjukdomarna misstänks. Testet är snabbt (inkubationstid 30 / 30 / 30 minuter) och flexibelt (delbar fast fas för 1-12 analyser, reagenser som är klara att användas). En negativ och en positiv kontroll kontrollerar analysens prestanda. 3

2. Varningar och försiktighetsåtgärder Testkitet är endast avsett för in vitro diagnostiskt bruk och får inte användas i eller på människor eller djur. Använd inte reagenser efter angivet utgångsdatum. Vi rekommenderar starkt att protokollet följs. Provbuffert och kontroller innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Tvättbufferten innehåller bromnitrodioxan och konjugatet innehåller metylisotiazolinon/bromnitrodioxan som konserveringsmedel. Substratet innehåller 3, 3', 5, 5'-tetrametylbenzidin (TMB) och väteperoxid (H2O2). Stopplösningen, 0,5 M svavelsyra (H2SO4), är sur och frätande. Ovan angivna reagenser kan vara giftiga vid förtäring. Iakttag rutinmässiga försiktighetsåtgärder vid hantering av farliga kemikalier. Undvik all kontakt med kroppen, använd handskar och skyddsglasögon. Skölj grundligt med vatten, om någon av reagenserna kommer i kontakt med hud eller slemhinnor. Pipettera aldrig med munnen. Kassera i enlighet med lokala/nationella föreskrifter. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparrör och bilda explosiva metallazider. Spola med stora mängder vatten vid kassering för att undvika ansamling av azider. Kontroller innehåller komponenter med humant ursprung. De har visat negativa resultat vid tester för humant immunbristvirus (HIV)-ag, hepatit B yt-(hbs)-ag, HIV 1/2-ak samt hepatit C-virus (HCV)-ak, i tester som uppfyller FDA:s krav eller kraven i EU:s direktiv 98/79/EG. Det finns emellertid inga kända tester som kan garantera att produkter som härleds ur humant blod är fria från smittämnen. De måste därför hanteras som om de är smittbärande och kasseras på lämpligt sätt. Läs CDC:s (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andra lokala/nationella riktlinjer beträffande laboratoriesäkerhet och dekontamineringsrutiner. 3. Testprincip Brunnarna i den fasta fasen bestryks med en balanserad blandning av de autoantigener som anges ovan. På denna yta kommer följande immunologiska reaktioner att äga rum: 4

1:a reaktionen: Antigen-specifika antikroppar i provet binder till det immobiliserade antigenet och bildar ett antigen-antikroppskomplex. Därefter tvättas obundna provkomponenter bort från den fasta fasen. 2:a reaktionen: En andra antikropp, riktad mot humana IgG-anti kroppar och konjugerad med HRP (pepparrotsperoxidas) tillsätts. Detta konjugat binds till komplexet. Därefter tvättas överflödigt konjugat bort från den fasta fasen. 3:e reaktionen: Det enzymmärkta komplexet omvandlar det färglösa substratet till en blå produkt. Graden av färgutveckling reflekterar koncentrationen av antigen-specific -antikroppar (IgG) i provet. 4. Kitets innehåll a. 1 mikrobrunnsplatta som belagts med balanserad blandning av de autoantigener som anges ovan och förpackats hermetiskt i en folielaminatpåse tillsammans med en påse med torkmedel. Plattan består av 12 remsor som var och en kan delas upp i 8 enskilda brunnar. b. Provbuffert, 100 ml, klar att användas, orange. Innehåller trisbuffrad koksaltlösning (TBS), bovint serumalbumin (BSA), tween och natriumazid. c. Tvättbuffert, 100 ml, 10x-koncentrat, blå. Innehåller TBS, tween och bromnitrodioxan. d. Negativ och positiv kontroll,3,0 ml vardera, klara att använda, grön respektive röd. Innehåller TBS, BSA, tween och natriumazid. e. Anti-humant IgG HRP-konjugat, 14 ml, klart att använda, rött. Buffrad lösning som innehåller stabiliseringsprotein, metylisotiazolinon samt bromnitrodioxan. 5

g. Substratlösning, 14 ml, klar att använda, färglös. Innehåller en buffrad lösning av TMB och H2O2 i en flaska som är ogenomtränglig för ljus. h. Stopplösning (0,5 M H2SO4), 14 ml, färglös, klar att användas. Varning: Svavelsyra är frätande. i. Bruksanvisning j. Lot-specifikt analyscertifikat 5. Material som krävs men som inte ingår a. Avjoniserat eller destillerat vatten b. Graderad cylinder, 1 000 ml c. Rör för provspädning (överföringsrör i mikrobrunnsplattans format rekommenderas) d. Pipetter för 10, 100 och 1 000 µl (pipetter med 1 och 8 kanaler rekommenderas) e. Tvätt för mikrobrunnsplatta (tillval) f. Fotometer för mikrobrunnsplatta, försedd med ett 450 nm filter g. ELISA utvärderingsprogram (rekommenderas) 6. Förvaring av kitet Förvara kitet vid 2-8 C. Det är stabilt fram till det utgångsdatum som anges på kartongens etikett. Använd inte kitet efter utgångsdatumet. 6

7. Reagens- och provberedning / provkrav Komponenter från olika kit får inte bytas ut mot varandra eller slås samman, på grund av eventuella varierande frakt- eller lagringsförhållanden. a. Innan påsen mikrotiterplattan öppnas måste den ha uppnått rumstemperatur. Ta ut de mikrobrunnar som inte behövs ur ramen och lägg omedelbart tillbaka dem i påsen, tillsammans med påsen med torkmedel. Återförsegla påsen hermetiskt och förvara den i kylen för framtida användning. b. Späd ut tvättbufferten (10x-koncentrat [100 ml, blå]) med 900 ml avjoniserat vatten. Blanda noga. Den utspädda bufferten är stabil i flera veckor vid förvaring i kylskåp (2-8 C). c. Beredning av proverna: Hantera patientproverna som om de kan överföra smittämnen. Förbered sera med vedertagna laboratoriemetoder och späd 1/100, t.ex. 10 µl serum + 990 µl provbuffert. Blanda noga. För snabb dispensering under analysen rekommenderas att kontroller och prover förbereds i överföringsrör för mikrobrunn. Detta möjliggör användning av en pipett med 8 kanaler under analysen. Om proverna inte analyseras omedelbart ska de förvaras vid 2-8 C och analyseras inom 3 dagar. Vid längre förvaring rekommenderas en temperatur på -20 C eller lägre. Upprepad frysning och upptining av sera bör undvikas. Upptinade prover måste blandas före spädning. Provkrav: Sera med hög fetthalt eller sera som är hemolyserat eller mikrobiellt kontaminerat kan ge felaktiga resultat och bör undvikas. 8. Analysmetod 8.1. Manuell användning Innan analysen påbörjas måste alla komponenter i kitet ha uppnått rumstemperatur (23 ± 3 C). För bästa resultat, d.v.s. maximalt förhållande mellan specifik signal och bakgrundssignal, är noggrann tvätt avgörande (steg a, c och e). Det är av yttersta vikt att tvättlösningen avlägsnas helt och hållet. För detta ändamål torka ordentligt plattan mot flera lager av absorberande papper. Automatiska tvättar måste verifieras mot resultat som uppnås med manuell tvätt. 7

a. Precis före användning ska mikrobrunnanrna tvättas en gång: fyll brunnarna med 350 µl tvättbuffert i varje, vänta i cirka 10 sekunder och avlägsna. b. Dispensera kontrollerna 3,0 ml i varje, klara att användas, grön och röd) samt de utspädda proverna snabbt i mikrobrunnarna; 100 µl per brunn. Mätningar i duplikat rekommenderas. Inkubera plattan i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). c. Tvätta brunnarna 4 gånger som i steg a. d. Dispensera konjugatet (14 ml, klart att användas, rött) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. e. Upprepa tvättmomentet i steg c. f. Dispensera substratlösningen (14 ml, klar att användas, färglös, svart flaska) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. Eftersom substratet är ljuskänsligt bör exponering för intensivt ljus undvikas (t.ex. direkt solljus) under inkubationen. g. Dispensera stopplösningen (14 ml, klar att användas, färglös. Varning: frätande!) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 100 µl per brunn. Använd samma sekvens som för substratet. Färgen ändras från blå till gul. Skaka plattan, företrädesvis på en orbital skakapparat i cirka 10 sekunder. h. Läs omedelbart av absorbansen i mikrobrunnsplattans fotometer vid 450 nm. Förvara kvarstående reagenser i kyl (2-8 C) om de ska användas igen. 8.2 Dynex DS2 automatiskt ELISA-system Denna produkt har validerats för användning med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system. En lämplig programfil för genomförande och utvärdering av analys tillhandahålls på begäran. Parametrarna i detta program är endast ett förslag och kan behöva anpassas av användaren till kraven i den faktiska analysen. Vi har generellt försökt att hålla oss så mycket som möjligt till protokollet vid en manuell användning, enligt ovan. Emellertid, på grund av en högre temperatur inuti DS2 bör inkubationstiden för substratet förkortas. Paragraf 11.8. innehåller en prestationsjämförelse mellan manuell analys och DS2 ELISA-systemet. 8

9. Utvärdering och kvalitetskontroll Testet utvärderas kvalitativt, absorvansen av proverna jämförs med cut-off absorbansen. Vid kvalitativ testutvärdering jämförs absorbansen hos proverna med gränsabsorbansen (= cut-off). Den fastställs enligt följande formel: absorbansgränsvärde = absorbanspositiv kontroll x faktor Faktorn beror på kit-loten och anges i det lotspecifika analyscertifikatet som medföljer varje testkit. Exempel: absorbanspositiv kontroll = 1 250 mod faktor = 0,35 absorbansgränsvärde = 1 250 mod x 0,35 = 438 mod För att få en uppskattning om graden av ett provs reaktivitet, beräknas kvoten mellan provets och gränsvärdets absorbans: kvot = absorbansprov / absorbansgränsvärde Exempel: Absorbansgräns = 438 mod absorbansprov = 1 480 mod kvot = 1 480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontroll: Den positiva och negativa kontrollen kontrollerar analysens prestanda. Deras auktoriserade värden respektive godkända intervall anges i det lotspecifika analyscertifikatet. Kontrollernas värden måste falla inom de angivna intervallen, annars är analysresultaten ogiltiga. 10. Tolkning av resultat / metodens begränsningar Med utgångspunkt från mätning av en blodgivare och ett urval positiva sera (se nedan), föreslår vi för analys av patientsera: kvot normalt (negativt) intervall < 0,82 cut-off 1,00 gränsintervall range 0,82-1,20 positivt intervall > 1,20 9

Dessa specifikationer anges endast som en indikation. För att kontrollera exaktheten bör varje analys inkludera parallella prover av normala sera. Ett negativt testresultat indikerar att patienten inte har förhöjda nivåer av IgGantikroppar mot IgG till de antigen som listas i i början. Därför är systemisk rheumatisk sjukdom ganska osannolik men kan ändå inte uteslutas. Ett positivt resultat bör betraktas som indikation på en av dem ovan uppräknade sjukdomarna. Som uppföljning av diagnos bör specificitetetn hos den orsakande autoantikroppen och följjaktligen identiteten hos den autoimmuna sjukdomen bestämmas. Detta kan uppnås med hjälp av differentierande profil ELISA. Prover som uppvisar resultat inom gränsintervallet angivet ovan bör betraktas som osäkra och rapporteras som sådana. Det rekommenderas att ytterligare prov tages två veckor senare och analyseras parellellt med första provet för att dokumentera en eventuell förändring i antikroppstitern. I likhet med alla serologiska analyser bör resultaten tolkas mot beaktande av patientens symtom och andra diagnostiska kriterier. 11. Prestanda 11.1. Standardisering Testet är standardiserat med en renad serumberedning som innehåller IgGantikroppar som är specifikt inriktade mot vardera av immobiliserade antigener. Denna beredning utgör råmaterial för båda kontrollerna i testet. Proportionen av antikropparna är anpassad på så sätt att vardera bidrar med lika stor del till den totala signalen. Serumberedningen är kalibrerad mot en uppsättning monospecifikt positiva sera reserverad för enbart detta ändamål. Graden av provets reaktivitet uttrycks som en total kvot som beskrivits ovan. 11.2. Analytisk specificitet Testet medger specifik bestämning av humana IgG-antikroppar, riktade mot de antikroppar som refereras a section 1. Testet har blivit validerat (bland annat) med humant serum från Center of Disease Control (CDC;Atlanta, USA) som är kommersiellt tillgänglig. Följande resultat (kvotvärden) är typiska: 10

Serum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CDC- ds- SS-B -- U1- Sm -- SS-A -- Scl- Joresultat DNA /La RNP /Ro 70 1 Immun- homo- speck- speck- -- -- nuc- -- centro- -- -- fluoresc. gen led led leolar mere kvot 5,0 11 9,4 3,8 9,2 1,2 6,6 5,9 6,6 9,4 Notera: Motsvarande ANA Profile 8 ELISA som särskiljer mellan de olika antigenen visar att serum # 6 ger kvotvärden 1 mot alla enskilda antigener. 11.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) Detektionsgränsen definieras som den koncentration av analytet som motsvarar genomsnittlig absorbans av provbuffert plus 3-faldig standardavvikelse (s). Det fastställdes som < 0,3 (ratio; n = 24). Rekommenderat mätintervall: 0,4 < ratio < 6 11.4. Homogenitet i fast fas Mätning av homogenitet i fast fas är en normal del av kvalitetskontrollen av varje produktionslot. Det bestäms genom 288-falding mätning av ett IgG-positivt prov som inte är saturerande på 3 valda plattor. Kriterium för godkännande: mod-variationskoefficient (cv) över plattorna < 8 %. Bilden nedan visar ett typiskt utdrag (fast fas lotnr. 2404G) av en sådan analys. plate early (n/10) late (9n/10) row 1 2 6 7 11 12 1 2 6 7 11 12 mean cv% line a 843 866 859 851 871 878 870 861 875 879 877 895 869 1,6 line b 868 869 855 839 844 878 867 874 880 875 838 887 865 1,9 line c 816 855 866 846 848 864 830 873 872 860 837 885 854 2,3 line d 816 868 870 818 853 881 855 872 872 845 847 878 856 2,5 line e 853 855 850 810 844 870 859 847 837 857 851 850 849 1,7 line f 845 853 837 803 834 873 853 856 829 855 852 871 847 2,3 line g 845 860 838 806 846 872 857 860 838 846 858 879 850 2,2 line h 825 852 850 837 862 871 859 853 874 863 877 886 859 2,0 mean 839 860 853 826 850 873 856 862 860 860 855 879 856 cv% 2,2 0,8 1,4 2,3 1,4 0,6 1,4 1,2 2,4 1,4 1,8 1,6 2,2 11

mod 450nm line a line b line c line d line e line f line g line h 0 250 500 750 1000 mod 450nm 1000 750 500 250 0 1 2 6 7 11 12 1 2 6 7 11 12 early / late plate, row no. 19111FE00.FED/FphHomV0312J 11.5. Linjäritet För att bedöma testets dos-responsförhållande, flera omgångar av individuella serum med heterogen reaktivitet mättes i seriell 2-faldig spädning. Ett typiskt resultat visas nedan. Det ungefärliga linjära förhållandet mellan prov koncentration och resultatkvoten är begränsat till värden < 2. Detta beror på den kvalitativa utvärderingsmodellen (se section 9) och kontrast ELISAs som är utvärderade kvantitativt genom en standard kurva.. 12

ratio 6 4 sera pool 1 sera pool 2 sera pool 3 2 0 0 200 400 600 800 1000 nl sera pool / well 1911FE00.FED/LinearV0312J 11.6. Precision För att bedöma testets precision fastställdes resultatens variabilitet under följande förhållanden: a. inom 1 analys och mellan 3 analyser, b. mellan 3 operatörer och c. mellan 2 kit-loter. a. Variabilitet inom analys och mellan analyser (n = 24 respektive 72) prov kvot variabilitet (cv, %) inom analys mellan analyser 1 1,4 1,9 2,1 2 2,4 2,0 2,1 3 4,0 1,4 1,7 b. Variabilitet mellan operatörer (n = 12) prov kvot variabilitet(cv, %) 1 1,4 2,5 2 2,4 1,8 3 4,0 2,9 13

c. Variabilitet mellan 2 kit-loter (n = 6) prov kvot variabilitet (cv, %) 1 1,3 4,9 2 2,3 5,3 3 3,8 3,8 11.7. Frekvensdistribution av ANA (IgG) Detta analyserades i sera från blodgivare, jämnt fördelat mellan kön och ålder och från sera som befunnits positiva genom oberoende metoder (tex monospecific, CE-compliant reference ELISAs, immune fluorescence assays (IFA)) där åtminstone en parameter var kliniskt fastställd. Följande fördelning av analyt observerades (S=standard avvikelse): blodgivarsera positiva sera n: 160 n: 83 medelvärde: kvot = 0,64 medelvärde: kvot = 7,5 medelvärde + s: kvot = 1,08 medelvärde - s: kvot = 4,9 medelvärde+ 2s: kvot = 1,53 medelvärde - 2s: kvot = 2,4 median: kvot = 0,54 median: kvot = 8,2 95 th percentilen: kvot = 1,14 5 th percentilen: kvot = 2,5 ROC-analys av dessa data användes för att bestämma gränsvärdet som ANA Screen 6 ELISA according to (6). De data som visas här visar på en diagnostisk specificitet och sensitivitet hos denna ELISA på cirka 91 respektive nästan 100 %. Dessa värden gäller endast analyserade sera; andra typer av provsamlingar kan ge andra resultat. 14

< 0,1 0,118-0,139 0,164-0,193 0,228-0,268 0,316-0,373 0,439-0,518 0,611-0,72 0,848-1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 relative frequency (%) < 0,1 0,118-0,139 0,164-0,193 0,228-0,268 0,316-0,373 0,439-0,518 0,611-0,72 0,848-1 1,18-1,39 1,64-1,93 2,28-2,68 3,16-3,73 4,39-5,18 6,11-7,2 8,48-10 relative frequency (%) blood donor sera 40 30 20 cut-off 10 0 ratio positive sera 40 30 20 cut-off 10 0 ratio 1911FE00.FED/HäufgPlotV0312J 15

Dynex DS2 (ratio) 11.8. Manuell förfarande jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISA-system Variabilitet: Genom att använda prover från en och samma kit-lot, jämfördes analysresultatens variabilitet mellan manuell användning och Dynex DS2 automatiskt ELISA-system: manuell användning Dynex DS2 variabilitet inom analys medelvärde cv = 1,3 % medelvärde cv = 2,1 % (n = 16) variabilitet mellan analyser medelvärde cv = 2,8 % medelvärde cv = 4,3 % (n = 48) Korrelation: 6,00 4,00 y = 0,963 x r = 0,999 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 manual operation (ratio) 1911FE00.FED/KorrDynexDS2V0312J 16

12. Garanti Euro Diagnostica AB garanterar att levererad produkt har testats grundligt för att säkerställa att de egenskaper som specificeras här har uppfyllts. Inga ytterligare garantier lämnas. De prestationsdata som presenteras här erhölls med användning av angiven metod. Eventuell modifikation av metoden kan påverka resultaten varvid Euro Diagnostica AB friskriver sig från alla garantier, såväl uttryckliga som underförstådda eller lagstiftade. Euro Diagnostica AB bär inte heller något ansvar för eventuella skador, vare sig direkta, indirekta eller efterföljande som uppstår till följd av felaktig användning eller förvaring av produkten. 13. Symboler Katalognummer Satsnummer Innehåller tillräcklig mängd för <n> tester Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik Conformité Européenne Skyddas från solljus 17

Temperaturgränser Hållbar till Varning Biologiska risker Tillverkare 18

14. Referenser 1. Nakamura, R. M., Tan, E. M.: Update on autoantibodies to intracellular antigens in systemic rheumatic diseases. Clin Lab Med 12 (1992), 1-23 2. Guma, M., Keil, L. B.: Autoantibodies to cellular antigens in systemic autoimmune diseases. J Clin Immunoassay 17 (1994), 98-107 3. Fritzler, M. J.: Clinical relevance of autoantibodies in systemic rheumatic diseases. Mol Biol Rep 23 (1996), 133-145 4. Hietarinta, M., Lassila, O.: Clinical significance of antinuclear antibodies in systemic rheumatic disease. Ann Med 28 (1996), 283-291 5. Messinger, M.: Autoantikörper bei systemischen entzündlich-rheumatischen Erkrankungen (Kollagenosen). In: L. Thomas (ed.): Labor und Diagnose (2005), TH-Books-Verlags-Gesellschaft, Frankfurt/Main, 1139-1161 6. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), 86-92 19

15. Sammanfattande flödesschema a. Späd sera i 1/100 i provbuffert (100 ml, klar att användas, orange) och blanda. b. Späd tvättbufferten (10x-koncentrat [100 ml, blå]) med vatten och blanda. c. Tvätta brunnarna en gång med 350 ul tvättbuffert vardera. Dispensera 100 ul av kontrollerna (3,0 ml i varje, klara att användas, grön och röd) samt de utspädda proverna i den fasta fasens brunnar. Mätningar i duplikat rekommenderas. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). d. Tvätta brunnarna 4 gånger med 350 ul tvättbuffert vardera. e. Dispensera 100 µl av konjugatet (14 ml, klart att använda, rött) i brunnarna. Inkubera som i steg c. f. Upprepa tvättmomentet i steg d. g. Dispensera 100 µl av substratlösningen (14 ml, klar att använda, svart flaska) per brunn. Inkubera som i steg c och tillsätt därefter 100 µl stopplösning (14 ml, klar att använda, färglös) per brunn och skaka plattan en kort stund. h. Mät omedelbart absorbansen vid 450 nm. i. Utvärdering: Bestäm gränsabsorbansen genom att multiplicera absorbansen i den positiva kontrollen med den faktor som anges i analyscertifikatet. Beräkna därefter provernas kvot genom att dela deras absorbans med gränsabsorbansen. 20