Tentamen med svarsmallar Biokemi KE7001p3, 22:e mars 2005, 09 00-15 00. Max poäng = 70 p. Preliminär gräns för godkänd = 37 p (53 %). 1. a) Vad är avståndet mellan två kovalent bundna kolatomer? (0.5p) b) Vilka atomslag kan fungera som acceptor eller donor i vätebindningar i biologiska system? (0.5p) c) Hur långt är det typiskt mellan donor och acceptor i en vätebindning? (0.5p) d) Ange ett typiskt intervall för avståndet mellan två kolatomer i van der Waalskontakt. (0.5p) e) I ett protein upptäcker du en vätebindning mellan sidokedjan hos en glutaminsyra (Glu) och syret i en asparaginsidokedja. Vilken laddning har då Glu-sidokedjan? Rita en förklarande skiss! (1p) f) Vad kallas den drivande kraften som gör att membraner hålls ihop och att proteiner veckar sig? Hur fungerar den? (1p) (4 p) a) 1.54 Å (0.5p), b) kväve, syre (0.5p) (svavel), c) 2.4-3.5 Å (0.5p) (2.7-3.2 Å vanligast), d) 3.5-4.5 Å (0.5p), e) Syret i asparaginsidokedjan är ett karbonylsyre (dubbelbundet till kol) och där finns alltså inget väte. För att det ska kunna bli en vätebinding måste det då finnas ett väte i karboxylgruppen hos glutaminsyra som alltså måste vara protonerad och således oladdad. (1p) f) Hydrofoba effekten (0.5p). Hydrofoba delar av lipider eller proteiner klumpar ihop sig för att undgå kontakten med vatten. (0.5p) 2. Vad krävs för att en (kemisk) reaktion ska kunna ske spontant? (1 p) Gibbs fria energi måste minska (1p), dvs produkterna måste ha lägre fri energi än utgångsämnena (ΔG = ΔH TΔS < 0). 3. Aminosyrornas sidokedjor har olika egenskaper. Para ihop aminosyresekvenserna (1-4) med dess troliga plats i en globulär proteinstruktur (A-D). 1. Arg-Asn-Lys A. Begravt i proteinet 2. Pro-Pro-Gly B. Exponerat på proteinytan 3. X-Serin-X C. I aktiva ytan på en grupp proteaser 4. Trp-Gly-Phe D. I en loopregion (X=variabel) Svar: 1B, 2D, 3C, 4A Totalt 2p (0,5p per rätt delsvar) 4. Rita upp den generella formeln för en dipeptid vid fysiologiskt ph. Sidan 1 av 8
Rita bindningar och ev. laddningar. Markera N- och C-terminal, phi, psi och peptidbindning och visa vilka som kan rotera. Peptidbindning - kan inte rotera N-terminal + H 3 N Roterbara bindningar R1 R2 O α α C C N C φ H ψ H φ H ψ φ = Phi-vinkel ψ = Psi-vinkel C O O C-terminal Totalt 3p (1p för rätt formel, 0,5p för laddning, 0.5p för rätt bindningar, 0.5p för roterbara, 0.5p för N- och C-terminal) 5. Du har isolerat ett nytt protein som du kallar Q vilket du vill försöka karaktärisera. Bland annat så vill du bestämma molekylvikten hos Q. a) Föreslå en metod att experimentellt bestämma molekylvikten hos protein Q i dess nativa (oförstörda) form. Beskriv kortfattat principen för metoden och hur man kan utföra ett sådant experiment. b) En kollega bestämmer aminosyrasekvensen för protein Q och finner att det består av 2273 aminosyror. Hon tror sig veta att man från detta teoretiskt även kan beräkna den ungefärliga molekylvikten men är lite osäker på hur man gör och kommer därför upp med flera förslag: 25.000 Dalton, 250.000 Dalton eller 100.000 Dalton. Vilken av molekylvikterna är troligen rätt? (1 p) c) Det visar sig vidare att Q har förmåga att binda till glukos. Hur kan man utnyttja detta för att rena Q? (1 p) (5 p) a) Använd gelfiltrering där separation sker efter storlek hos molekylerna. Systemet består av två faser en fast och en mobil. Den fasta fasen består av porösa kulor och den mobila är oftast en buffert. Separationen beror av molekylernas förmåga att tränga in kulornas porer. Små molekyler vandrar långsammare än stora. (1.5 p) För att bestämma molekylvikten får proteiner av känd molekylvikt först passera genom en kolonn med gel och då deras elueringsvolymer är proportionella mot molekylvikten kan en standardkurva konstrueras från dessa data. Låt därefter Q passera genom samma kolonn och använd standardkurvan för att beräkna molekylvikten (1.5 p). b) 250.000 Dalton, då varje aminosyra i genomsnitt väger c:a 110 Dalton. (1p) c) Konstruera någon typ av affinitetsgel till vilken glukos irreversibelt binds. Därefter kan man packa en kolonn med denna gel som vidare används för att binda upp Q. (1p) 6. Definiera och beskriv kortfattat de tre stegen i molekylärbiologins "centrala dogma", flödet av den genetiska informationen. Sidan 2 av 8
DNA -> DNA = replikering (0.5p). DNA kopieras genom att varje kedja bildar mall för komplementär kopiering (0.5p). DNA -> RNA = transkription (0.5p). Vissa delar av DNA kopieras till RNA. En kedja i DNA är mall för komplementär kopiering (0.5p). RNA -> protein = translation (0.5p). mrna används som mall för syntesen av protein på ribosomen (0.5p). För varje aminosyra som inkorporeras i proteinet passas tre baser i mrna (kodonet) ihop med antikodonet på den trna-molekylen som för in aminosyran till peptidsyntesen. 7. Varför kan man förutsäga ett proteins aminosyrasekvens om man känner genens nukleotidsekvens, men ej bestämma en gens nukleotidsekvens om man känner proteinets aminosyrasekvens? Varje kodon i gensekvensen svarar mot en enda aminosyra (1p), därför kan vi förutsäga proteinets sekvens från gensekvensen. Däremot så finns det mer än ett kodon för de flesta aminosyrorna (1p), dvs. flera alternativa sekvenser är möjliga. 8. Redogör med hjälp av den s.k. "transition state"-teorin hur enzymer accelererar kemiska reaktioner (för full poäng krävs både text och förklarande figur(er)!). Korrekt figur med S, P, TS, aktiveringsenergi markerade ger 1p. Hos (de flesta) enzymer finns en ficka (aktiv yta, eng active site ) där den reaktion som katalyseras sker. Fickan är specifikt konstruerad för att binda till substrat och de övergångsformer som passeras på vägen till produkt(er). Genom att fickan är konstruerad så att den binder starkast till övergångsformer ( transition states ) stabiliseras dessa mer än t.ex. substrat och produkter (1p). Puckeln mellan substrat och produkt i energidiagrammet som motsvarar aktiveringsenergin blir då lägre och då sker det fler reaktioner per tidsehnhet, d.v.s. reaktionen går snabbare (1p). aktiveringsenergi 9. Hur fungerar proteolytisk aktivering? Ge två exempel på viktiga biokemiska processer som regleras genom proteolytisk aktivering. Proteolytisk aktivering sker genom enzymkatalyserad hydrolys (klyvning) (0.5p) av (en eller några) peptidbindingar i icke-aktiva prekursorer som kallas zymogener eller proenzymer (0.5p). Klyvningen leder till konformationsförändringar som i sin tur leder till att den aktiva ytan formas (1p). Exempel: aktiveringen av matsmältningsenzymer (0.5p) som trypsin, eller av enzymerna i blodlevringskaskaden (0.5p). Sidan 3 av 8
10. Enzymet E som följer Michaelis-Menten-kinetik har ett Km på 1μM (mikromolar). Initiala hastigheten är 0.1 μm/min (mikromolar/min) vid en substratkoncentration på 1000 μm (mikromolar). Vad är den initiala hastigheten när [S] är lika med a) 2 mm (millimolar) (1p) b) 1 μm (mikromolar) (1p) c) 3 μm (mikromolar)? (1p) När [S] = 1000 μm så gäller [S] >> K m, och alltså är v 0 = V max = 0.1 μm/min a) för varje substratkoncentration större än 1000 μm, v 0 = V max = 0.1 μ M/min (1p) b) [S] = K m så v 0 = V max /2, eller 0.05 μm/min (1p) c) Eftersom K m och V max är kända, kan Michaelis-Menten ekvationen användas för att beräkna v 0 vid varje substratkoncentration: v 0 = V max [S] / ( K m + [S] ) För [S] = 3 μm: v 0 = (0.1 μm/min) (3 μm) / (1 μm + 3 μm) = 0.3/4 μm/min = 0.075 μm/min (1p) 11. Rita Lineweaver-Burke-plotten för a) ett enzym i frånvaro och i närvaro av en kompetitiv inhibitor (1.5p) b) ett enzym i frånvaro och i närvaro av en icke-kompetitiv (non-competitive) inhibitor (1.5p) Förklara hur de två typerna av inhibitorer fungerar, och hur Vmax och Km påverkas av inhibitorerna. Ange i figurerna hur man får ut Vmax och Km, och glöm inte att namnge axlarna! a) b) 1/Vmax -1/Km a) korrekt figur (samma skärningspunkt 1/V-axeln) samma Vmax, men högre Km i närvaro av inhibitor (1p); inhibitor och substrat konkurrerar om aktiva ytan (0.5p) b) korrekt figur (samma skärningspunkt 1/[S]-axeln) samma Km, men lägre Vmax i närvaro av inhibitor (1p); binder till regulatorisk yta och påverkar aktiva ytan genom konformationsförändringar (jmf heterotrop alloster effekt) (0.5p) 12. Illustrera i figur hur reaktionshastigheten varierar som funktion av substratkoncentrationen för a) ett allosteriskt enzym (0.5p), och b) ett enzym som följer Michaelis-Menten kinetik (0.5p). Sidan 4 av 8
Glöm inte att märka axlarna! c) Aspartatkarbamoylas katalyserar omvandlingen av aspartat och karbamoylfosfat till karbamoylaspartat. Enzymet aktiveras kooperativt av båda substraten. En bisubstratanalog, PALA, inhiberar enzymet vid höga koncentrationer, men aktiverar enzymet vid låga koncentrationer. Förklara detta fenomen! (3p) (4 p) a) b) a) Figur med sigmoidal kurva (0.5p). b) Figur med hyperbol kurva (0.5p) c) Aspartatkarbamoylas är ett allosteriskt enzym som består av flera subenheter. PALA binder starkt till aktiva ytan (bisubstratanalog). Vid höga halter binder PALA till samtliga aktiva ytor och blockerar dessa (kompetitiv inhibering) (1p). Samtidigt skiftar PALA aspartatkarbamoylas från den inaktiva (T) till den aktiva (R) formen (1p). Vid låga halter av PALA förblir en del aktiva ytor fria samtidigt som enzymet aktiveras allostert (1p). 13. Vid fysisk ansträngning används stora mängder av ATP av skelettmusklerna. För att tillgodose musklernas energibehov används olika substrat för produktion av ATP beroende på den fysiska aktivitetens varaktighet. Markera i figuren nedan vilka substrat som används (1.5p) och ange om de används vid aerob eller anaerob metabolism (1.5p). glukos creatinfosfat fettsyror Punktlinje: creatinfosfat (0.5p); streckad: glukos (0.5p); streckad med punkt: fettsyror (0.5p). De två första används vid anaerob metabolism 0,5 + 0,5 p) och fettsyror vid aerob metabolism (0,5p). Sidan 5 av 8
14. Vid en partiell svällt tillförs ingen näring utifrån, beskriv kortfattat vad som händer i levern ( i biokemiska termer), efter flera timmars frånvaro av föda Samt varifrån respektive metabolit härstammar ifrån (max 1 sida). a. Glukos bildas från Leverglykogen. 1p b. Glukos bildas från laktat, från skelettmuskler. 1p c. Glukos bildas från glycerol, från lipolys i fettväven där glycerol och fria fettsyror bildas triacylglycerol. 1p d. Glukos bildas från glukogena aminosyror som kommer huvudsakligen från musklerna. 1p e. Fettsyra förbränningen (β-oxidationen) ökar, fettsyror från fettväven. 1p f. Brist på glukos leder till brist på oxalacetat vilket resulterar i en ökad ketonkroppsproduktion. 1p (6 p) 15. Aspartataminotransferase har den högsta enzymaktiviteten av alla transaminaser i levern hos människa och däggdjur. Förklara varför? I ureacykeln överförs den andra aminogruppen från aspartat (1p). Aspartat genereras genom transaminering av glutamat och oxalacetat till aspartat och alfa ketoglutarat, en reaktion som katalyseras av apartat-aminotransaminas (1p). Detta medför att ca 50% av alla aminogrupper som utsöndras som urea måste passera igenom apartataminotransferas-reaktionen. 16. Du har fått arbete på ett biokemiskt utvecklingsföretag som arbetar med att kartlägga förekomsten av bioaktiva ämnen i mervärdesmat (functional food). En av de hetaste substanserna för tillfället utgörs av det anticarcinogena ämnet genistein (återfinns i bl.a. Soja) vilket inhiberar tyrosinkinas. Men misstanke finns att genistein även inhiberar andningskedjan. Din uppgift blir att ta reda på om, och var, denna substans inhiberar andningskedjan. Beskriv kortfattat hur du går tillväga och vilken utrustning och reagenser du använder. Till ditt förfogande har du den utrustning som ni använt under era laborationer i biokemi. (5 p) Utrustning: syrgaselektrod med förstärkare och skrivare. 1p Mitokondrier, tre olika substrat som lämnar sina elektroner vid de tre olika komplexen (Glutamat, succinat, ask/tmpd) samt ADP (eller ATP + glukos + hexokinas) och syremättad buffert. 2p Utförande: Till glaskärlet tillsätts buffert, mitokondrier, substrat (glutamat) ADP. Syreförbrukningen registreras. Tillsätt genistein, registrera syrgasförbrukningen. Om syreförbrukningen avtar inhiberar genistein andingskedjan. 1p Men var? Tillsätt ett substrat som lämnar sina elektroner vid complex 2 (succinat). Upprepa med askorbat/tmpd för även det sista komplexet. 1p 17. Pentosfosfat-shunten: Vilket påstående är rätt? Pentosfosfat-shunten Sidan 6 av 8
a) Består av en serie reaktioner som inte har något samband med någon annan metabolisk reaktionsväg. b) Genererar NADH som reducerande ämne i biosyntes-reaktioner. c) Producerar ribos-5-fosfat. d) Kräver arabinos-5-fosfat. c) är rätt svar (1p) (1 p) 18. Citronsyracykeln: Vilket påstående är rätt? Om pyruvat skall oxideras vidare i citronsyra cykeln a) måste pyruvat omvandlas till oxalacetat b) måste pyruvat omvandlas till acetyl-coa genom oxidativ dekarboxylering. c) måste pyruvat binda kovalent till ett litet enzym som katalyserar reaktionen. b) är rätt svar (1p) (1 p) 19. Vilken av följande aminosyror spelar en avgörande roll i transporten av amoniumjoner från perifiära vävnader till levern? a) Serin b) Metionin c) Glutamin d) Arginin c) Glutamin (1p) (1 p) 20. Merparten av allt lagrat glykogen återfinns i skelettmuskeln. Trots detta används inte muskelgykogen till att balansera blodglukosnivån. Vad används istället och varför utnyttjas inte muskelgykogen? I muskeln saknas enzymet glukos6-fosfatas vilket medför att glukosgruppen inte kan spjälkas bort och därmed exportera ut glukos ut ur cellen (1p). I levern däremot finns ovanstående enzym och därmed regleras blodglukosnivån huvudsakligen genom att leverglykogen bryts ned till glukos som transporteras ut i blodet. (1p) 21. Visa med en enkel skiss huvudkomponenterna i fotosyntesens ljusreaktion hos växter. (5 p) Huvudkomponenterna är: 1. Ett vattenspjälkande komplex (0.5p) 2. Ett reaktionscenter, fotosystem II (PS II) proteiner + pigment, t.ex. klorofyll (1p) 3. Ett proteinkomplex som binder elektrontransportörer (0.5p) 4. Ytterligare ett reaktionscenter, fotosystem I (PS I) (1p) Sidan 7 av 8
5. Ytterligare ett proteinkomplex som binder elektrontransportörer (0.5p)och en slutlig elektronmottagare (NADP+) (0.5p) 6. ATP syntetas, ett enzym som syntetiserar ATP och som drivs av and protongradient (ph-gradient) (1p) Ev. kan man också ta med antennkomplex och mobila elektronbärare som plastokinon och plastocyanin Fotosystem II Cytokrom bf -komplex Fotosystem I ATPsyntas 22. Kolmetabolism a) Beskriv kolets kretslopp med en enkel skiss (1p) b) Till skillnad från däggdjur (t. ex. människan) kan växter tillgodose sitt behov av kolhydrater genom nysyntes från oorganiskt kol. Vad kallas processen och vilken är den primära reaktionen i processen? (2p) c) Vad heter enzymet som katalyserar denna reaktion som är unik för växter (och andra fotosyntetiserande organismer)? (1p) d) På vilket sätt påverkar luftens syre flödet och energiutbytet i reaktionen? (2p) (6 p) Svar: a) Se skiss. Autotrofer fixerar luftens koldioxid (CO2) som omvandlas till kolhydrat (CH2O)n och spjälkar vatten (H2O) till syre (O2). Processen drivs av solljusenergin. Heterotrofer livnär sej på kolhydrater som producerats av autotrofer och använder syre till förbränning, varvid vatten bildas. (1p) b) Processen är kolfixering (Calvin-cykeln, reduktiva pentosfosfatcykeln, eller mörkerreaktionen). Luftens koldioxid binds till (fixeras i) ribulos-1,5-bisfosfat, varvid triosfosfat/hexoser bildas.(2p) c) Ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylas/oxygenas eller Rubisco. (1p) d) Luftens syre konkurrerar med koldioxid i Rubisco's aktiva yta. Oxygenering av ribulos-1,5-bisfosfat leder till bildning av en molekyl 3-fosfoglycerat (3PGA) och en molekyl 2-fosfoglycerat (i stället för två 3PGA), d.v.s. inget CO2 fixeras. Nedbrytning/omvandling av 2-fosfoglycerat som bildas, fotorespiration, är en Sidan 8 av 8
energikrävande process (kräver extra ATP och NADH), som resulterar i att kol avlägsnas ur Calvincykeln genom att koldioxid i stället avges. (2p). 23. Molekylära motorer som skall förflytta sig en längre sträcka behöver ett spår att följa. Proteinerna actin och myosin som är de huvudsakliga aktörerna i vårt muskelarbete är ett exempel på detta. a) Vilken av dessa proteiner är motorn och vilken är spåret? b) Vilket NTP måste binda till motorn för att den skall kunna förflytta sig? a) Myosin-motor, actin-spår. b) ATP. Totalt 2p (1p på varje) Sidan 9 av 8