BIOKEMISKA SEPARATIONSMETODER - EN ÖVERSIKT

BIOKEMISKA SEPARATIONSMETODER - EN ÖVERSIKT Jan-Christer Janson Institutionen för Kemi Uppsala Biomedicinska Centrum Uppsala Universitet Uppsala

INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1. INLEDNING... 3 2. ALLMÄNT OM SEPARATION AV MOLEKYLER... 4 3. GELMATERIAL FÖR SEPARATIONSÄNDAMÅL... 5 3.1. Varför gelmaterial?... 5 3.2. Molekylsiktande geler... 6 3.3. Makroporösa geler... 7 4. EXTRAKTION OCH FÖRBEREDANDE SEPARATION... 7 5. INTERMEDIÄRA OCH HÖGUPPLÖSANDE SEPARATIONSMETODER... 9 5.1. Separation efter molekylernas storlek och form... 10 5.1.1. Molekylsiktande elektrofores... 10 5.1.2. Molekylsiktande kromatografi: Gelfiltrering... 11 5.2. Separation efter molekylernas elektriska laddning... 13 5.2.1. Elektrofores... 13 5.2.2. Isoelektrisk fokusering... 14 5.2.3. Jonbyteskromatografi... 17 5.2.4. Kromatofokusering... 20 5.3. Separation efter molekylernas funktion... 21 5.3.1. Affinitetskromatografi av enzymer... 21 5.3.2. Immunosorption... 22 5.3.3. Affinitetskromatografi av glykoproteiner... 23 5.3.4. Exempel på affinitetskromatografi av transportproteiner och receptorer... 24 5.3.5. Bindning av IgG till Protein A från Staphylococcus aureus... 25 5.4. Hydrofob adsorptionskromatografi... 26 5.5. Kemisorption ("Kovalent kromatografi")... 27 5.6. Övriga separationsmetoder... 28 5.6.1. Metallchelataffinitetskromatografi... 28 6. REFERENSER... 29 2

1. INLEDNING "Den gren av kemin som syftar till ett utforskande av livsprocessernas mekanism - alltså biokemien - har haft och kommer alltid att ha som en av sina viktigaste uppgifter att ur biologiskt material isolera ämnen som på ett eller annat sätt spela en väsentlig roll i det komplexa fenomen som kallas för liv. Detta problem har kommit i förgrunden icke minst därför, att många av de ämnen det här gäller genom sin molekylstorlek, sin komplicerade byggnad och sin ömtålighet för vanliga kemiska operationer erbjuder alldeles speciella problem. Dessutom förekommer många av de viktigaste substanserna i ytterst små mängder". Ovanstående citat utgör inledningen till ett föredrag hållet av professor Arne Tiselius (Nobelpris 1948) i september 1961 (1) och är idag alltjämt lika aktuellt. Tiselius var elev till professor The Svedberg (Nobelpris 1926) och dessa båda vetenskapsmäns inflytande på den biokemiska forskningen vid flera svenska universitet kan knappast överskattas. De har dessutom haft ett avgörande inflytande på utvecklingen av den svenska biokemiskt inriktade industrin. Utan deras pionjärinsatser skulle vi idag knappast ha ett företag som GE Healthcare Biosciences AB i Uppsala. Detta företag betyder, med någon överdrift, för världens biokemister vad COOP eller ICA betyder för Sveriges dagligvarukonsumenter. Tiselius ägnade hela sin aktiva forskarkarriär åt att utveckla nya separationsmetoder för biomolekyler, främst äggviteämnen (proteiner) och var en av de ivrigaste förespråkarna för milda metoder, baserade mer på fysikalisk-kemiska skillnader mellan molekylerna än på de rent kemiska. Dit hör t.ex. skillnader i storlek och form samt skillnader i elektrisk laddning. Biokemisk separationsteknik används rutinmässigt av forskare inom de flesta livsvetenskapliga ämnesområden: Biokemi, molekylärbiologi, mikrobiologi, immunologi, genetik, farmakognosi etc.. De hämtar sina studieobjekt från levande celler eller deras utsöndringsprodukter. Förr var djurorgan eller växtmaterial de vanligaste utgångsmaterialen men idag är det främst rekombinanta proteiner producerade i mikroorganismer som studeras. Levande celler innehåller utomordentligt komplexa blandningar av tusentals olika substanser där de enstaka komponenterna sällan förekommer i en procentuell andel överstigande 0,01 % av den totala substansmängden. Rekombinanta proteiner däremot når ofta koncentrationer överstigande flera procent av den totala proteinmängden i utgångsmaterialet. Dock måste man komma ihåg att samma typ och antal av värdorganismens proteiner måste avlägsnas under den följande reningsprocessen oavsett uppnådd expressionsnivå. Ett typiskt biokemiskt forskningsprojekt har för många forskarstuderande inneburit att inledningsvis åtskilliga månader ägnats åt att utveckla ett förfarande för renframställning av det protein vars egenskaper, struktur eller funktion skall studeras. Det kan t.ex. gälla ett enzym eller ett hormon, ur ett organ, en körtel eller från en bakterie som Escherichia coli, eller en jästsvamp som Pichia pastoris, i de fall det handlar om ett rekombinant protein. Ofta har resultatet blivit något eller några få milligram rent protein som sedan undersökts. Ibland har syftet varit att undersöka proteinets biologiska funktion, ibland att bestämma dess tredimensionella struktur genom röntgendiffraktion efter kristallisering. Genom att sålunda studera de enskilda cellkomponenternas egenskaper hoppas man så småningom, steg för steg, kunna förstå hur den levande cellen fungerar. Många enzymer renas idag för att användas som verktyg av molekylärbiologer och mikrobiologer, t.ex. vid selektiv ned- 3

brytning och syntes av nukleinsyror. Det är då synnerligen angeläget att dessa inte är förorenade av andra typer av nukleinsyranedbrytande enzymer, och man driver därför reningen av sådana enzymer så långt tillgängliga analysmetoder tillåter. Det är här lämpligt att citera Nobelpristagaren Arthur Kornberg som vid ett seminarium vid Uppsala Biomedicinska Centrum hösten 1980 yttrade: "There is no point in wasting clean thinking on dirty enzymes", vilket kan fritt översättas: "Det är bortkastad tid att försöka tolka resultat som baseras på försök med orena enzymer". Andra områden där biokemisk separationsteknik används rutinmässigt är inom klinisk diagnostik, t.ex. vid analys av proteinsammansättningen i blodserum. och inom läkemedelsindustrin, t.ex. vid renframställning av insulin och humant serumalbumin. Proteinrening har traditionellt betraktats som ett mycket svårt forskningsområde och anses av många fortfarande vara mer en konst än en vetenskap. Kanske var det så för några decennier sedan, idag är situationen emellertid en helt annan. Det finns på marknaden ett stort antal instrument och andra hjälpmedel för renframställning och analys av proteiner och en mycket rikhaltig litteratur inom området står till biokemisternas förfogande. Med hjälp av datasökningsmetoder kan man på några minuter få fram en aktuell lista på artiklar som behandlar rening och isolering av ett speciellt protein, t.ex. ett enzym eller hormon. Saknas information i litteraturen om det protein man avser isolera, kan ofta värdefull vägledning i reningsarbetet erhållas från artiklar som beskriver isolering av närbesläktade proteiner. Vad gäller rekombinanta proteiner kan värdefull information, t.ex. rörande molekylvikten, primärstrukturen och den teoretiska isoelektriska punkten (det ph där proteinets nettoladdning är noll), erhållas ur den till en polypeptidkedja översatta cdna-sekvensen. Varför har proteinrening traditionellt betraktats som ett svårt forskningsområde? Den väsentligaste anledningen, och som redan delvis nämnts i inledningen, är att proteiner dels är utomordentligt olika till sina egenskaper, dels mycket instabila och känsliga för variationer i såväl den kemiska som fysikaliska miljön och dels att de har en tendens att binda sig till andra komponenter såsom nukleinsyror, kolhydrater och lipider. Dessutom binds de ibland till varandra under de betingelser de tvingas in i under reningsproceduren. 2. ALLMÄNT OM SEPARATION AV MOLEKYLER Molekyler i blandning kan separeras enligt flera olika huvudprinciper. Inom biovetenskaperna, där man arbetar med komplexa blandningar i vattenlösning, kan de flesta separationsmetoderna inordnas i någon av följande tre kategorier. Inom den första faller alla förfaranden som baseras på att miljön förändras så att vissa ämnen ej längre kan existera i lösning utan kristalliserar eller aggregerar. De bildade partiklarna kan sedan avlägsnas eller tillvaratas genom sedimentation eller filtrering. Hit hör de för alla biokemister välkända s.k. fällningsmetoderna där man stegvis ökar koncentrationen av ett neutral salt eller ett organiskt lösningsmedel. Till den andra kategorin hör metoder som utnyttjar skillnader i löslighet hos olika molekyler i de vätskor (lösningsmedel) som ingår i flytande två-fassystem, och som används i olika motströmsextraktionsprocesser. Den tredje och sista kategorin innefattar alla metoder som baseras på förutsättningen att två olika molekyler i lösning reagerar olika med avseende på rörelseriktning och/eller rörelsehastig- 4

het när de utsätts för ett yttre kraftfält. Till denna kategori hör de flesta moderna biokemiska separationsmetoder. De olika krafterna illustreras schematiskt i Fig. 1. Fig. 1. Krafter som kan utnyttjas för att påverka en molekyl i en separationskammare (utrymmet mellan de båda horisontella linjerna). Impelling force = framdrivande kraft. Retarding force = bromsande kraft. FFF står för Field-Flow Fractionation en teknik där man kombinerar en axiell framdrivande kraft med en radiell dito. Det finns flera sätt att åstadkomma riktad rörelse hos en molekyl. Ett av dessa gäller endast laddade molekyler och innebär att de placeras i ett elektriskt kraftfält. Beroende på typ och storlek av molekylernas laddning kommer de att röra sig i en viss riktning med en viss hastighet. På detta fenomen baseras en separationsteknik som kallas elektrofores. Ett annat innebär att molekylerna placeras i en flödande vätska som rör sig längs ett stillastående fast eller flytande ämne. Beroende på molekylernas olika förmåga att fördela sig mellan den flödande och den stillastående vätskan, eller att binda sig olika starkt till det fasta ämnet kommer de att transporteras av den flödande vätskan med olika hastighet. På detta fenomen baseras en teknik som kallas kromatografi. Ett tredje sätt innebär att molekylerna placeras i ett gravitationsfält, t.ex. i en ultracentrifug. Molekyler med höga molekylvikter kommer här att sedimentera snabbare än de med låga dito. Metoden har ej använts så mycket för isolering av proteiner i ren form. En fjärde metod utnyttjar molekylernas egenrörelse, diffusionen. Den kallas för dialys och innebär att små molekyler tillåts diffundera genom ett s.k. semipermeabelt membran, en tunn hinna som innehåller porer vars tvärsnitt är för litet för att tillåta passage av högmolekylära substanser, t.ex. proteiner. Ett specialfall av dialys är s.k. ultrafiltrering. Genom att applicera ett hydrostatiskt tryck på ena sidan av det semipermeabla membranet åstadkommer man här ett vätskeflöde genom detsamma som snabbare än diffusionen transporterar små molekyler och salter genom membranet. Metoden används mest för koncentrering av proteinlösningar. Med speciella membraner kan man emellertid separera proteiner i storleksklasser. 3. GELMATERIAL FÖR SEPARATIONSÄNDAMÅL 3.1. Varför gelmaterial? De viktigaste biokemiska separationsmetoderna är elektrofores och kromatografi. Båda kan betraktas som allmänna begrepp under vilka ett stort antal olika specialtekniker inryms. Gemensamt för alla (dock med ett par undantag) är att man för att förhindra att redan separerade molekyler åter blandas genom oönskade vätskeströmningar, s.k. konvektion, orsakade av skillnader i densitet i olika delar av separationsmediet, eller av virvelbildning, låter 5

separationen äga rum i ett poröst medium, en gel. En gel är en olöslig polymerprodukt vars förnämsta egenskap är dess förmåga att binda stora mängder lösningsmedel. En bra beteckning är att den sväller i lösningsmedlet. Torrsubstanshalterna i typiska svällda geler ligger normalt vid 2-10 %. Det viktigaste lösningsmedlet inom biokemin är naturligtvis vatten och detta leder till att det i första hand är hydrofila (vattenälskande) gelmaterial som kommer ifråga. Dessa är uppbyggda av polymerer som innehåller polära grupper, t.ex. hydroxylgrupper eller amidgrupper. Varför är nu gelmaterialen så viktiga inom biokemisk separationsteknik? Det finns flera, vitt skilda orsaker till detta. Den viktigaste är kanske den stora yta. som exponeras inuti ett gelmaterial och som ger en hög kapacitet per volymsenhet för de reversibla bindningsfenomen mellan till gelpolymeren kovalent kopplade, funktionella grupper och de olika molekyler från provblandningen som skall separeras. En annan viktig orsak är den stora volym av stillastående lösningsmedel, här alltså vatten, som tillåter utnyttjande av ett antal olika fysikaliska fenomen för separation utan störande inflytande från de svårkontrollerbara vätskerörelser molekyler utsätts för ute i en fri lösning. Vid gelelektrofores använder man en homogen gel och de molekyler som skall separeras befinner sig hela tiden inne i det tredimensionella polymernätverket. Vid kromatografi använder man en sedimenterad bädd av små gelpartiklar (ofta tillverkade i pärlform och med diametrar som varierar i storleksintervallet 0,005-0,1 mm) som packas i ett rör av glas, plast eller stål. Molekylerna som skall separeras transporteras med hjälp av en flödande vätska som rör sig i det fina kapillärsystemet mellan gelkornen. Separationen åstadkommes sedan genom att molekylerna genom sin egenrörelse (diffusionen) transporteras in i den stillastående vätskan i gelkornen, där olika mekanismer för olika kromatografiska tekniker leder till att vissa molekyler kvarhålles under ett längre tidsintervall än andra innan de åter kommer att diffundera tillbaka ut i den strömmande vätskan. Beroende på vilken teknik som tillämpas, används en av två principiellt helt olika geltyper. 3.2. Molekylsiktande geler Den ena geltypen är uppbyggd av tvärbundna (förnätade), linjära, hydrofila polymerer där graden av tvärbindning kan varieras och därmed porstorleken i det tredimensionella polymernätverket. Porstorleken hos dessa gelmaterial är av samma storleksordning som de molekyler som ska separeras vilket leder till molekylsiktningsfenomen som utnyttjas för separation i storleksklasser. När en sådan geltyp används vid elektrofores kommer större molekyler att röra sig långsammare genom gelén då de på grund av polymernätverket tvingas att vandra en längre sträcka än mindre molekyler. Vid kromatografi med sådana geler kommer tvärtom större molekyler att transporteras snabbare genom kolonnen på grund av att en mindre delvolym av vätskan i gelkornen är tillgänglig för dem än för mindre molekyler. Den viktigaste molekylsiktande geltypen för elektrofores av proteiner och nukleinsyrafragment är uppbyggd av tvärbunden polyakrylamid. Kromatografisk molekylsiktning brukar kallas gelfiltrering och de viktigaste gelmaterialen är baserade på tvärbundet dextran och/eller tvärbunden polyakrylamid samt agaros. De förra tillverkas av GE Healthcare Biosciences i Uppsala under benämningarna Sephadex och Sephacryl samt Sepharose, Superose och Superdex. 6

3.3. Makroporösa geler Den andra geltypen skiljer sig från den förra främst med avseende på porositet vilket framgår av den schematiska illustrationen av de båda geltyperna i Fig. 2. Det inom biokemisk forskning viktigaste makroporösa gelmaterialet är agaros, en naturligt gelbildande polysackarid som framställs ur agar som i sin tur extraherats från vissa marina rödalger. Agaros används både inom elektrofores och kromatografi i de fall man önskar ett icke siktande gelmaterial. T.ex. vid olika typer av immunoelektrofores och vid affinitetskromatografi. Vid agaroskoncentrationer i området 2-4 % erhålles geler vars porositet avsevärt överstiger diametrarna hos de flesta proteinmolekyler. För de mer högmolekylära nukleinsyrorna är sådana geler lämpliga för såväl siktande elektrofores som gelfiltrering. Fig.2. Schematisk framställning av skillnaderna mellan en siktande geltyp (vänstra skissen), uppbyggd av tvärbundna, linjära polymerer (typ Sephadex), och en makroporös geltyp, här exemplifierad av hur man tänker sig en agarosgel uppbyggd. (Figuren från Arnott, S. et al., J. Mol. Biol. 90(1974)269-284). 4. EXTRAKTION OCH FÖRBEREDANDE SEPARATION Ett försök till renframställning av ett protein, t.ex. ett enzym, kan indelas i fyra stadier, extraktion, förberedande separation (ofta kombinerat med koncentrering), intermediär separation och avslutande högupplösande separation (i engelskspråkig litteratur används ofta begreppen capturing, purification och polishing för de tre sistnämnda stadierna). Vart och ett av dessa stadier kan i sin tur inbegripa flera steg. Extraktionen är helt naturligt det inledande steget i reningsprocessen och syftar till att frigöra enzymerna från celler eller cellbeståndsdelar till vilka de uppvisar en starkt varierande bindningstendens. För intracellulära enzymer fordras som regel att cellvägg och cellmembran först sprängs fysikaliskt eller kemiskt. För animala och vegetabiliska celler utgör detta i allmänhet inget problem. Animala celler är särskilt lättsönderdelade och oftast räcker det med en passage genom en köttkvarn, följt av behandling i turmix, d.v.s. ett kärl med roterande knivar i botten. Det största problemet är närvaron av fettvävnad i utgångsmaterialet och för vissa lipidrika organ, t.ex. hjärna och lever, framställs ofta acetonpulver, dvs. den restprodukt som erhålles sedan de homogeniserade vävnaderna befriats från lipider genom extraktion med aceton vid låg temperatur. Vad beträffar vegetabilisk vävnad, utgör frömaterialen inget större problem om man undantar de oljerika fröerna. Det finns en rad olika typer av kvarnar i såväl laboratorie- som storskaleutförande. De oljerika fröerna klarar man ofta genom valsning och 7

skonsam oljeextraktion, t.ex. med n-hexan. Gröna växtdelar går ej att sönderdela i normala kvarnar eftersom dessa snabbt kloggar ihop. I laboratorieskala använder man ofta en turmix. Den numera kanske viktigaste råvarukällan för enzymer är mikroorganismer av olika slag, t.ex. bakterier, jäst och mögelsvampar. Många enzymer av praktiskt intresse, t.ex. tvättmedelsenzymerna, är extracellulära, d.v.s. de utsöndras av mikroorganismerna i det omgivande odlingsmediet och behöver oftast bara koncentreras innan de används. De flesta mikrobiella enzymer av intresse som verktyg för forskning, t.ex. de s.k. restriktionsendonukleaserna som används för specifik klyvning av DNA-molekyler inom rekombinations-dna-teknologin, är emellertid intracellulära och för att komma åt dem måste cellväggarna slås sönder. Detta åstadkommes t.ex. med hjälp av u1traljudbehandling eller genom skakning tillsammans med små glaspärlor. I större skala används ofta modifierade mjölkhomogenisatorer (t.ex. av fabrikatet APV-Gaulin). Den tillförda energin omvandlas i samtliga fall huvudsakligen i värme varför det är viktigt att kyla ned suspensionen före och efter behandlingen så att inte känsliga substanser, t.ex. enzymer, förstörs (denatureras). Efter extraktionssteget, vilket oftast sker i närvaro av en lämplig buffertsaltlösning, eventuellt med tillsats av löslighetsbefrämjande ämnen, t.ex. vissa detergenter, vidtar ett tekniskt viktigt steg, nämligen avskiljandet av de extraherade fasta cellbeståndsdelarna. Detta sker i laboratorieskala oftast med hjälp av kylda snabbcentrifuger med hastigheter upp till c:a 25.000 varv per minut. Fibrösa material filtreras oftast genom en silduk, eventuellt i en s.k. korgcentrifug (liknar en vanlig tvättcentrifug), varefter filtratet befrias från mindre partiklar genom snabbcentrifugering. I vissa fall är det mycket svårt att uppnå helt partikelfria extrakt. Det gäller t.ex. för aceton-pulverhomogenat, bakteriehomogenat och jästautolysat. Sådana extrakt kan i de flesta fall ej direkt användas till kolonnkromatografiska försök utan förbehandling, d.v.s. man sätter in ett eller flera förberedande fraktioneringssteg. Det klassiska inledande steget vid proteinrening är utfällning med neutralsalt, särskilt ammoniumsulfat, (NH4)2SO4. Andra proteinfällningsreagens med vidsträckt användning är etanol samt polymerer som polyetylenglykol och polyetylenimin. Andra klassiska inledande fraktioneringssteg är värmedenaturering, utfällning genom tillsats av syra samt utfällning av nukleinsyror med hjälp av spermin, streptomycinsulfat eller protaminsulfat. En preparativ teknik för initial provbehandling är adsorption i expanderade partikelbäddar ( Expanded Bed Adsorption, EBA ). Denna teknik baseras på en ny typ av kolonn och nya typer av adsorbentmaterial. Tekniken baseras på användning av adsorbentpartiklar av sfärisk tvärbunden agaros vars densitet höjts genom tillsats av kvartspartiklar eller av partiklar av en inert metallegering. Adsorbentpartiklarnas storleksfördelning ger upphov till en stabil, expanderad svävbädd när dessa utsätts för ett homogent linjärt flöde underifrån genom kolonnen. I den expande-rade bädden kommer de största partiklarna i fördelningen att anrikas vid kolonnens botten-platta och de minsta att anrikas i den svävande bäddens toppskikt. Varje adsorbentpartikel finner sin plats i storleksgradienten där det föreligger en jämvikt mellan dess tendens att sedimentera och att lyftas av vätskeflödet. Det stora avståndet mellan de svävande partik-larna gör att det är möjligt att använda prover som innehåller hela celler eller cellfragment. Det lösliga målproteinet i provet kommer att bindas vid adsorbentpartiklarna under dess transport upp genom den svävande bädden medan hela celler, cellfragment och icke bundna substanser kommer att tvättas ut genom kolonnens övre utlopp. När uttvättningen är klar packas bädden och de adsorberade proteinerna kan frigöras från adsorbentpartiklarna genom att en förträngande 8

buffertsaltlösning pumpas in i kolonnen uppifrån. Detta kan utföras antingen stegvis eller med hjälp av en koncentrationsgradient. Mer att läsa i ref. (5). Som sista steg bland de förberedande separationerna har det blivit allt vanligare att använda avsaltning genom gelfiltrering snarare än dialys. Avsaltning är en sammanfattande term för den operation där man överför proteiner i en ny miljö med känd sammansättning. Man kan således byta buffertsaltlösning för att nå lämplig jonstyrka och lämpligt ph som förberedelse för de intermediära och högupplösande separationsstegen under det sista stadiet av reningsproceduren. I de fall ändringar i saltkoncentration och/eller ph leder till utfällning av vissa proteiner i provet, är avsaltning genom dialys att föredra framför gelfiltrering eftersom de utfällda proteinerna annars fastnar i gelfiltreringskolonnen och hindrar det normala vätskeflödet. 5. INTERMEDIÄRA OCH HÖGUPPLÖSANDE SEPARATIONSMETODER De viktigaste reningsstegen utgörs som regel av kromatografiska tekniker. Vid en klassificering av dessa är det lämpligt att utgå från de egenskaper hos molekylerna som varierar tillräckligt mycket för att kunna utgöra en bas för deras separation. Alla proteiner är polypeptider, uppbyggda av ett tjugotal olika aminosyror. Proteinernas molekylvikter, d.v.s. summan av de ingående aminosyraresternas molekylmassor, varierar starkt (från c:a 10.000 upp till c:a 1.000.000) liksom de olika proteinernas form. Eftersom aminosyrorna kan vara såväl positivt som negativt laddade, eller neutrala, kommer antal och typ av laddade grupper, liksom fördelningen av dessa, på proteinernas yta att variera starkt. Skillnader i elektrisk laddning och andra egenskaper, t.ex. graden av hydrofobicitet och biologisk funktion, utgör basen för de separationsmetoder som kommer att beskrivas nedan. De presenteras översiktligt i Tabell 1. Tabell 1. SEPARATIONSMETODER INOM BIOKEMIN Skillnader i egenskaper mellan olika molekyler som kan utnyttjas för separationsändamål. Molekylstorlek och form... Nettoladdning... Isoelektrisk punkt... Biologisk funktion... Hydrofobicitet... Innehåll av fri -SH-grupp... Löslighet... Metall bindande förmåga... Förmåga att bilda charge-... transferkomplex Gelfiltrering, ultrafiltrering, ultracentrifugering, porgradientgelelektrofores, SDS-gelelektrofores Jonbyteskromatografi Zonelektrofores i agarosgel Isoelektrisk fokusering Kromatofokusering Affinitetskromatografi Affinitetsfördelning Hydrofob adsorptionskromatografi, omvänd-fas kromatografi (RPC) Kemisorption ("kovalent kromatografi") Utfällning med t.ex. (NH 4)2SO 4, etanol eller polyetylenglykol, kristallisering Metallchelatkromatografi (IMAC),(16) Charge-transferkomplexkromatografi (17} 9

5.1. Separation efter molekylernas storlek och form Separation av molekyler i storleksklasser kan åstadkommas både genom elektrofores och genom kromatografi. Den förra tekniken utnyttjas huvudsakligen för analys av proteiner medan den senare i första hand är en preparativ metod. 5.1.1. Molekylsiktande elektrofores Vid elektrofores används oftast en homogen polyakrylamidgel som framställts i form av en platta, ett tunt skikt eller en smal cylinder. Provlösningen med proteinblandningen läggs på gelén vid dess ena kant och proteinerna får vandra in i gelén som ett tunt band. Separationen sker inuti gelén genom att större molekyler kommer att vandra långsammare då de på grund av polymernätverket tvingas att vandra en längre sträcka än mindre molekyler. Man brukar säga att molekylerna vandrar med en hastighet som är omvänt proportionell mot deras molekylvikter. Det senare gäller speciellt i det fall man förbehandlat proteinmolekylerna med natriumdodecylsulfat, ett ämne som binder sig till dessa och gör dem starkt negativt laddade. I engelskspråklig litteratur används ofta benämningen SDS-PAGE för denna teknik. Porgradientelektrofores innebär att separationen får äga rum i en polyakrylamidgel vars siktande egenskaper, d.v.s. porstorleken, förändras i proteinernas vandringsriktning. Olika storleksklasser av proteinmolekyler kommer att anrikas vid vissa pordiametrar där de inte har möjlighet att tränga fram med samma hastighet som tidigare. Fördelen med en sådan porgradientgel är att proteinerna efter infärgning framträder som mycket tunna band, d.v.s. upplösningsförmågan är mycket hög, och att deras vandringssträcka är korrelerad till molekylvikten. En kalibreringskurva kan framställas med hjälp av proteiner med kända molekylvikter. I Fig. 3 (a) och 3 (b) visas principen för gelelektrofores och i Fig. 4 visas ett exempel på porgradientelektrofores av serum proteiner. Mer att läsa om gelelektrofores finner Du i referenserna (2) och (6). Fig.3(a). Principen för gelelektrofores. Vid elektrofores i homogen gel (vänstra skissen) vandrar små molekyler snabbare än de större, då de i mindre grad bromsas av polymernätverket (de svarta punkterna). Vid porgradientgelelektrofores (högra figuren) fångas molekylerna upp av polymernätverket vid vissa gelkoncentrationer varvid deras vandringshastighet starkt reduceras. Detta leder till smala zoner (hög upplösning). 10

Fig.3(b) Gelkoncentrationsgradientens form påverkar upplösningsgraden vid porgradientgelelektrofores. Fig.4. Porgradientgelelektrofores av humant serum (olika patientsera). 5.1.2. Molekylsiktande kromatografi: Gelfiltrering Kromatografisk separation av molekyler efter storlek brukar kallas gelfiltrering. I engelskspråklig litteratur används ofta även benämningen Size Exclusion Chromatography ( SEC ) för denna teknik. De nämnda siktande geltyperna används då i form av små sfäriska partiklar med diametrar i området 0,05-0,2 mm. Gelpartiklarna blandas med en lämplig buffertsaltlösning och packas till s.k. kolonnbäddar i rör av glas eller plast. Kolonnrören är som regel försedda med adaptorer så att man lätt kan tillföra provlösning och samla upp den vätska som passerat igenom gelpartikelbädden. I ett typiskt gelfiltreringsförsök i laboratorieskala används en kolonn med längden 60-90 cm och med en diameter på en till fem centimeter. Provvolymen är normalt en till tre procent av gelbäddens total volym och vätskeflödet genom kolonnen brukar ligga från tre till trettio milliliter per kvadratcentimeter kolonntvärsnittsyta per timme. Normalt hålls flödet konstant med hjälp av en slangpump eller kolvpump. Provet kommer att pumpas in i gelpartikelbädden som en smal zon, omgiven av flödande buffertsaltlösning. De molekyler i provet som på grund av sin storlek inte kan tränga in i gelpartiklarna kommer att transporteras oseparerade genom kolonnen med samma hastighet som buffertsaltlösningen och kommer att lämna kolonnen efter en volym lika stor som kolonnvätskevolymen mellan gelpartiklarna, den s.k. voidvolymen. De molekyler som är tillräckligt små för att kunna tränga in i den stillastående vätskan mellan polymerkedjorna i gelpartiklarna kommer alltså att kunna fördela sig en större volym i varje gelbäddsegment. Ju mindre molekylerna är, desto större blir den tillgängliga vätskevolymen för dem inuti gelén och desto större andel av det totala antalet molekyler av varje molekylslag kommer att befinna sig i den stillastående vätskan i gelkornen, och desto mindre andel kommer att befinna sig i vätskan mellan gelkornen, som ju hela tiden rör sig med konstant hastighet. För varje molekylslag gäller att de kommer att lämna kolonnen efter att en vätskevolym har passerat som är lika stor som summan av vätskan mellan gelpartiklarna, V0, och den vätskevolym inuti gelpartiklarna som är tillgänglig för molekylslaget i fråga, Vr. Oavsett 11

hur små molekylerna är kan de inte lämna kolonnen efter en volym som är större än summan av vätskan mellan gelpartiklarna och den totala vätskevolymen i gelpartiklarna, Vt. Om en molekyl lämnar kolonnen efter en volym som är större än kolonnens sammanlagda vätskevolym är det ett tecken på att den på ett eller annat sätt står i bindningsjämvikt med polymerkedjorna och/eller tvärbindningsbryggorna i gelmaterialet. Tvärbundet dextran, Sephadex, har en tendens att svagt binda molekyler med aromatiska grupper. Graden av bindning kan man påverka genom att variera t.ex. ättiksyrakoncentrationen (3). Fig. 5 visar principen för gelfiltrering och Fig. 6 en schematisk skiss över en typisk kromatografi uppställning. Fig. 7 visar separationsmönstret för blodserum efter gelfiltrering på Sephacryl S-300. Detaljerad information om gelfiltrering erhålls i referenserna (2) och (4). Fig 5 Principen för gelfiltrering. De små molekylerna ( ) tränger in i de molekyl siktande gelpartiklarna och fördröjs relativt de större molekylerna (O). Pilarna till höger symboliserar vätskeflödet genom kolonnen, vars "tvärsnitt" avbildats vid försökets start och efter två olika långa tidsintervall därefter. Prov Buffert Pump Kolonn Fraktionssamlare Fig.6. Skiss över en typisk apparatuppställning för kromatografi. Vid gelfiltrering med små provmängder brukar provpåsättningsventilen placeras efter den peristaltiska pumpen, ofta i kombination med en s.k. loop. 12

200 250 300 ml Fig.7. Gelfiltrering av humant serum på Sephacryl S-300 Superfine. Kolonn: 2.6 x 94 cm, provvolym: 2 ml, elueringsbetingelser: buffert 0,1 M Tris-HCI ph 8.0 innehållande 0.5M NaCl, flöde: 2.3 ml/cm 2 /tim. 5.2. Separation efter molekylernas elektriska laddning De viktigaste separationsmetoderna där man utnyttjar skillnader i storlek och typ av elektrisk laddning hos molekylerna är elektrofores och jonbyteskromatografi. 5.2.1. Elektrofores Elektrofores innebär laddade partiklars och molekylers vandring i ett elektriskt fält. Den elektroforetiska vandringshastigheten är direkt proportionell mot laddningens storlek och omvänt proportionell mot molekylradien. Ett normalvärde för proteiner är 5-10 -5 cm/s vid fältstyrkan en volt per centimeter. Antal och typ av laddade grupper på proteinernas yta varierar starkt och har lett till att man talar om sura, neutrala och basiska proteiner, beroende på vid vilket ph-värde proteinerna har sin isoelektriska punkt,(pi), dvs. det ph-värde där nettoladdningen är noll och proteinet således ej vandrar i ett elektriskt fält. Fig. 8 visar hur vandringshastigheten i ett elektriskt fält med styrkan 1 V/cm, mobiliteten, för ett antal olika serumproteiner ändras med ph-värdet hos den lösning där proteinerna befinner sig. PROTEINERS ELEKTROFORETISKA MOBILITET SOM FUNKTION AV ph Fig.8. Mobiliteten för olika serumproteiner som funktion av ph. Skärningspunkten vid mobiliteten noll är identisk med proteinernas pi. 13

I föregående stycke beskrevs elektrofores i polyakrylamid och den molekylsiktande egenskapen hos denna geltyp. Elektrofores användes där enbart som ett sätt att "transportera" molekylerna. Separationen åstadkoms av polymernätverket. I ren elektrofores, där separationen beror på skillnader i vandringshastighet betingad av skillnader i nettoladdning mellan olika molekyler, väljer man en icke siktande geltyp, t.ex. agarosgel av låg koncentration (2-4 %). Elektrofores i agarosgel har framför allt blivit en viktig klinisk analysmetod för proteiner i t.ex. blodserum och ryggmärgsvätska. En intressant utveckling av metoden innebär att man efter avslutad elektrofores låter de separerade proteinerna elektroforetiskt vandra, i 90 graders riktning mot den ursprungliga, in i ett agarosgelskikt som innehåller en lösning av antikroppar mot alla eller vissa proteiner i provet. Allteftersom de vandrande proteinerna möter sina antikroppar så kommer de, där koncentrationsförhållandet är optimalt, att reagera med dessa och bilda en olöslig fällning. Detta inträffar i koncentrationsgradienten i kanten på den vandrande proteinzonen och leder till att den successivt minskar i omfattning för att till sist helt försvinna i spetsen på den mer eller mindre Gausskurveformade linje som utfällningslinjerna bildade längs båda sidorna på den vandrande proteinzonen. Ytan innanför utfällningslinjen är ett mått på mängden protein i zonen. Metoden kallas korsad immunoelektrofores och resultatet av ett sådant försök med blodserum som prov visas i Fig. 9. En mer detaljerad beskrivning av denna och andra agarosgelelektroforetiska analysmetoder återfinns i boken "Plasmaproteiner", se (18). Ingående presentationer av elektroforetisk teori och praktik finner Du i referenserna (2) och (6). Fig.9. Korsad immunoelektrofores av humant serum i agarosgel innehållande kaninantikroppar mot helt humanserum. Provet (2u1) sattes på gelén i den lilla runda brunnen till höger i bildens nedre kant. 5.2.2. Isoelektrisk fokusering En annan viktig elektroforetisk separationsmetod som främst används analytiskt i polyakrylamidgel är isoelektrisk fokusering. Metoden bygger på det i början av detta stycke omnämnda förhållandet att många biomolekyler, främst proteinerna, är amfolyter (d.v.s. de kan vara både positivt och negativt laddade) med väl definierade isoelektriska punkter, d.v.s. ph-värden där de ej vandrar i ett elektriskt fält. Vid ph-värden under den isoelektriska punkten är amfolyterna positivt laddade och vandrar mot den negativt laddade 14

elektroden, katoden. Vid ph-värden över isoelektriska punkten är amfolyterna negativt laddade och vandrar mot den positiva elektroden, anoden. Om man skapar en stabil phgradient mellan de båda elektroderna, så kommer en amfolyt med en väldefinierad isoelektrisk punkt, oavsett var den placeras i gradienten, att vandra mot och stanna vid motsvarande ph-värde. Principen framgår av skissen i Fig. 10. Fig.10. Principen för isoelektrisk fokusering. I läge A är proteinet negativt laddat och vandrar mot anoden. I läge B är proteinet positivt laddat och vandrar mot katoden. Vid pi är nettoladdningen noll och proteinzonen skärps stationärt. Den heldragna linjen visar den stabila ph-gradienten. Stabila ph-gradienter kan erhållas med hjälp av s.k. bäraramfolyter, dvs. lågmolekylära substanser med hög buffertkapacitet vid sina isoelektriska punkter. En bra bäraramfolytblandning skall dessutom ha jämn elektrisk ledningsförmåga över hela ph-intervallet. Avsnitt med låg ledningsförmåga kan ge överhettningsproblem och begränsar den totala effekt man annars skulle kunna tillföra hela separationskammaren. Avsnitt med hög ledningsförmåga ger spänningsfall och dålig fokusering. Det finns flera olika fabrikat av bäraramfolyter på marknaden. De ger i de flesta fall fullt likvärdiga resultat. Skillnader kan upptäckas först när man pressar betingelserna, t.ex. när de används i mycket tunna gelskikt och med fältstyrkor upp till 300 volt/cm. Orsaken till att höga fältstyrkor är önskvärda inom isoelektrisk fokusering beror på att det föreligger ett direkt samband mellan zonbredden hos ett "fokuserande" protein och den elektriska fältstyrkan. Sambandet framgår av följande formel: = mått på zonskärpan, motsvarar c:a 1/4 av proteinets zonbredd D = diffusionskoefficienten för proteinet E = fältstyrkan (V/cm) du/dph = lutningen hos mobilitetskurvan vid proteinets pi dph/dx = lutningen hos ph-gradienten Bland dessa variabler är D och du/dph inneboende egenskaper hos det speciella proteinet, varför endast E och dph/dx kan varieras experimentellt. En ökning av dph/dx skärper visserligen proteinzonen men leder samtidigt till att zoner tillhörande olika proteiner i prover kommer närmare varandra, varför nettoupplösningen ej påverkas i praktiken. Fig. 11 visar separationsmönstret efter isoelektrisk fokusering av olika muskelproteiner i ett tunt polyakrylamidgelskikt. Fig. 12 visar ett exempel på 2-dimensionell gelelektrofores där isoelektrisk fokusering använts i första dimensionen och SDS polyakrylamidgelelektrofores 15

i den andra dimensionen. Konsultera referenserna (2), (6), (7) och (8) för ytterligare information om isoelektrisk fokusering. Fig.11. Isoelektrisk fokusering i tunnt polyakrylamidskikt. Prover från vänster: muskelproteiner från gädda, linslektin (isolektiner), muskelproteiner från regnbågsforell och betalaktoglobulin. Samma prover återkommer sedan till höger i gelen. Försöksbetingelser: Bäraramfolyt Pharmalyte 3-10, fältstyrka 300 V/cm. Fig. 12. 2-dimensionell elektrofores av bagerijästproteiner (Saccharomyces cereviciae) i ett tunt skikt av polyakrylamidgel. Första dimensionen: IEF i närvaro av urea. Andra dimensionen: SDS-porgradientgelelektrofores. Vänstra gelen färgad med Coomassie Brilliant Blue. Högra gelen färgad med silver-reagens som ger c:a 10 ggr högre känslighet än färgning med Coomassie Brilliant Blue. 16

5.2.3. Jonbyteskromatografi Jonbyteskromatografi är en separationsmetod som bygger på användningen av gelpartiklar som innehåller kovalent bundna laddade grupper. Dessa laddade grupper är införda genom en kemisk reaktion i en från början neutral, porös gel. Varje laddad grupp i gelen neutraliseras med hjälp av en jon med motsatt laddning, en motjon, som hålls kvar i dess närhet på grund av elektrostatisk attraktion. Motjonen är alltså ej bunden utan rörlig och kan lätt bytas ut mot en annan jon med samma laddning. Kloridjonen, Cl -, är en vanlig motjon till en positivt laddad jonbytargel och natriumjonen. Na +, är en vanlig motjon till en negativt laddad jonbytare. Positivt laddade jonbytare brukar kallas anjonbytare och negativt laddade jonbytare katjonbytare. Man brukar dessutom skilja mellan svaga och starka jonbytare. En svag jonbytare innehåller laddade grupper vars laddning är beroende av den omgivande lösningens ph-värde. En stark jonbytare är laddad vid alla ph-värden. Exempel på svaga jonbytare är de som innehåller karboxylgrupper. De blir oladdade, och således oanvändbara vid ph-värden under c:a 5. Jonbytare innehållande tertiära aminogrupper, t.ex. dietylaminoetyl (DEAE-) förlorar sin laddning genom protolys vid ph-värden över c:a 8-9. Exempel på starka jonbytare är de som innehåller sulfonsyragrupper och kvaternära ammoniumgrupper. Fig. 13 visar exempel på olika typer av jonbytande grupper. Fig. 13. Exempel på jonbytande grupper i moderna jonbytare för proteiner. En jonbytare befinner sig i dynamisk jämvikt med jonerna i sin omgivning och är mycket känslig även för små skillnader i protolyseringsgrad hos olika motjoner. Detta förhållande insågs mycket tidigt av forskare framförallt i USA och den kanske elegantaste praktiska tillämpningen av detta fenomen kom i början på 1950-talet i form av aminosyraanalysatorn, 17

en maskin som bygger på användningen av starka katjonbytare och noggrant utprovade buffertsaltlösningar. Jonbyteskromatografi av proteiner ställer stora krav på gelmaterialets egenskaper. Proteiner har utvecklats i en vattenmiljö och deras struktur är ofta mycket känslig för påverkan av hydrofoba grupper. De första användbara jonbytarna för proteinseparation var därför tillverkade av hydrofila gelmaterial baserade på cellulosa, tvärbundet dextran (Sephadex ) och agaros (t.ex. Sepharose Fast Flow). Under de senaste decennierna har emellertid nya jonbytare utvecklats som bygger på syntetiska organiska polymerer såsom polystyren-divinylbensen. Dessa har högre rigiditet än de ovan nämnda materialen och kan därför tillverkas med avsevärt mindre partikeldiametrar. Vissa av dessa har framställts i monodispers pärlform (se Fig. 14). Den hydrofoba polystyrenytan har först hydrofiliserats och sedan substituerats med laddade grupper. En viktig faktor vid proteinkromatografi är jonbytarmaterialets porositet. Makroporositet ger hög bindningsförmåga per volymsenhet för proteiner och dessutom snabb jämviktsinställelse, d.v.s. effektivare separation. Agarosbaserade jonbytare har här stora fördelar framför de som baseras på siktande geltyper; speciellt för högmolekylära proteiner. Även för nukleinsyror, oligonukleotider och nukleotider är idag jonbyteskromatografi en ofta använd separationsmetod. Fig. 14. Monodispersa gelmaterial baserade på polystyren-divinylbensen. Används av GE Healthcare Biosciences i Uppsala som utgångsmaterial för framställning av olika typer av jonbytare för proteinseparation. Det finns två principiellt olika förfaranden vid jonbyteskromatografi. Vid det ena anpassar man betingelserna med avseende på saltkoncentration och ph så att de komponenter som skall separeras aldrig helt fastnar på jonbytaren utan alla molekylerna rör sig samtidigt på samma sätt som beskrevs i föregående kapitel för gelfiltrering. D.v.s. för varje molekylslag existerar en unik jämvikt mellan bundna och fria molekyler och där proportionen fria molekyler bestämmer den hastighet med vilken molekylslaget rör sig genom jonbytarkolonnen. De molekyler som är för stora för att ens penetrera gelpartiklarna och som ej visar någon tendens att binda till de laddade grupperna vandrar snabbast och bland dessa molekyler sker ingen separation alls. De molekyler som helt penetrerar gelpartiklarna (icke siktande geltyp) men ej binds till de laddade grupperna i gelen vandrar också tillsammans oseparerade från varandra men långsammare än, och således separerade från, de förra. Alla övriga molekyler, d.v.s. de som mer eller mindre starkt binder till de laddade grupperna kommer mer eller mindre fullständigt att separera från varandra under sin vandring genom jonbytarkolonnen. Ju längre kolonnen är, desto bättre separation får man. Dock blir inte separationen dubbelt så bra med dubbelt så lång kolonn. Enligt den grundläggande kromatografiteorin blir separationen endast kvadratroten ur 2, d.v.s. c:a 1,4, gånger så bra vid en fördubbling av kolonnlängden vid den här speciella varianten av jonbyteskromatografi. Vid den andra jonbyteskromatografiska metoden väljer man betingelser där den kompo- 18

nent man vill renframställa (alternativt, i vissa fall föroreningarna), fastnar på jonbytaren och inte lossnar förrän man på något sätt förändrat sammansättningen hos den buffertsaltlösning som provet och jonbytaren från början befann sig i. Genom att ändra t.ex. saltkoncentrationen eller ph i buffertsaltlösningen stegvis eller kontinuerligt (gradienteluering) kommer de olika komponenterna att lossna en efter en och transporteras av den flödande vätskan genom och ut ur kolonnen. Vid denna typ av kromatografi är man oftast ej betjänt av långa kolonner, tvärtom får man i de flesta fall bättre separation ju kortare kolonnerna är. I Fig. 15 visas resultatet av en jonbyteskromatografisk separation av proteinerna i giftet av kungskobra och i Fig. 16 visas resultatet av jonbyteskromatografisk renframställning av humant serumalbumin i stor skala. Jonbyteskromatografi, eller oftast endast adsorption av proteiner till en jonbytargel som blandas med provet och sedan frånskiljs genom filtrering, har blivit en mycket viktig teknik för renframställning av proteiner i industriell skala av vissa kliniskt viktiga proteiner, t.ex. serumalbumin, gammaglobulin och olika blodkoaguleringsfaktorer. Närmare information om detta kan inhämtas i boken "Plasmaproteiner", se (18). Ytterligare referenser till jonbyteskromatografiska arbeten kan extraheras ur referenserna (2) och (9). Fraktionsnummer Fig.15. Jonbyteskromatografi med gradienteluering av kobragift på CM-Sephadex C-50. Fig.16. Jonbyteskromatografi med stegvis eluering av humant serumalbumin från ett försök med DEAE- Sepharose CL-6B i stor skala (16 liter gel i en 37 cm diameter och 15 cm hög kolonn, Pharmacia KS370/15) utgående från 16 liter humanserum. 19

5.2.4. Kromatofokusering En intressant variant av jonbyteskromatografi är kromatofokusering. Tekniken bygger på användningen av en speciell jonbytare vars grupper har hög buffertkapacitet över ett brett ph-intervall. Närvaron av kvaternära ammoniumgrupper garanterar proteinbindningskapacitet även vid höga ph-värden. Eluering sker med ph-gradient. Jonbytaren jämviktas med en lämplig buffertsaltlösning vid det högre ph-värdet i det valda intervallet. Provlösningen, som innehåller proteiner med isoelektriska punkter inom det valda intervallet är som regel jämviktad vid samma ph eller i elueringsbuffert. Efter provpåsättningen pumpas en speciell elueringsbuffert, kallad "Polybuffer", in i kolonnen. Polybufferlösningens ph är justerat till det lägsta värdet i intervallet. Polybufferlösningen har jämn och hög buffertkapacitet över hela det valda intervallet vilket leder till att en jämn och stabil ph-gradient kommer att utvecklas i den flödande vätskan i kolonnen på grund av att Polybufferlösningen långsamt kommer att titreras av jonbytaren. Proteinerna i provet är vid försökets början adsorberade som ett smalt band vid kolonnens övre del. I och med att Polybufferlösningen börjar pumpas in i kolonnen sjunker sakta ph-värdet i vätskan kring de adsorberade proteinerna. När ph-värdet sjunker under den isoelektriska punkten för ett visst protein lossnar det från jonbytaren och transporteras nedåt i kolonnen med den flödande Polybufferlösningen. Polybufferlösningens ph i det volymavsnitt där proteinet befinner sig är emellertid inte konstant utan ändras kontinuerligt genom titrering på grund av jonbytargruppernas höga buffertkapacitet. Efter en kort stund har ph-värdet passerat proteinets isoelektriska punkt igen men nu från andra hållet, proteinet blir negativt laddat och fastnar på jonbytarens positivt laddade grupper. Gradienten rör sig emellertid hela tiden nedåt i kolonnen och samma procedur upprepas om och om igen. Resultatet blir att varje protein kommer att anrikas, fokuseras, till en mycket smal zon som kommer att lämna kolonnens utlopp vid ett ph-värde nära dess isoelektriska punkt. I kolonnen utbildas således en stabil ph-gradient som hela tiden rör sig framåt, men, vilket har avgörande betydelse, med en hastighet som är c:a 10 gånger lägre än den hos den flödande vätskan. Fig. 17 visar schematiskt principen för kromatofokusering och i Fig. 18 visas resultatet av kromatofokusering av ett älgmuskelproteinextrakt. Mer information om kromatofokusering kan inhämtas i referenserna (2) och (10). Fig.14. Den fokuserande effekten vid kromatofokusering beror på att vätskeflodet genom kolonnen (den långa pilen) är avsevärt högre än den hastighet med vilken ph-gradienten, och således en amfolyt med isoelektrisk punkt inom gradienten, rör sig genom kolonnen (den korta pilen). Figuren är hämtad ur (10). 20

Fig.18. Kromatofokusering av ett proteinextrakt från älgmuskel. Kolonn: 1 x 45 cm PBE 94, prov: 5 ml, elueringsbetingelser: startbuffer 0.025M etanolamin-hci ph 9.4, elueringsbuffert: 0.0075 mmol/ph-enhet/ml Polybuffer 96, flöde: 20 m1/cm 2 /timme. (Ur referens (10)). 5.3. Separation efter molekylernas funktion 5.3.1. Affinitetskromatografi av enzymer Alla proteiner har en specifik biologisk funktion. Den största gruppen är enzymerna, biokatalysatorerna, som ombesörjer att alla de tusentals olika kemiska reaktionerna i en levande cell kan fortgå vid de låga fysiologiska temperaturerna. Karakteristiskt för enzymerna är deras ofta höga specificitet, d.v.s. de katalyserar reaktioner mellan endast enstaka eller ett fåtal s.k. substrat. På enzymernas yta finns s.k. aktiva ytor där själva katalysen äger rum. Vid katalystillfället binds substratet till den aktiva ytan, för att omedelbart efter reaktionen frigöras. Vissa substanser har stor likhet med substratet, men kan inte omsättas av enzymet. De fortsätter således att vara bundna till den aktiva ytan och förhindrar substratet att nå fram. Dessa substanser kallas för hämmare eller inhibitorer och bindningen mellan dem och enzymet kan utnyttjas för separationsändamål under förutsättning att bindningen är reversibel. En stor grupp enzymer behöver för sin funktion s.k. cofaktorer. Även co-faktorerna binds vid katalystillfället tillsammans med substratet till enzymets aktiva yta för att omedelbart därefter frigöras. Det har visat sig att substanser som liknar co-faktorer också fungerar som hämmare och kan således utnyttjas för separationsändamål. Sättet att utnyttja biologisk parbildning for separationsändamål kallas för affinitetskromatografi och tillgår så att den ena molekylen i paret, i exemplet ovan hämmaren, kemiskt kopplas till en bärare, oftast en makroporös gelpartikel t.ex. 4 % agaros. Gelpartiklarna innehållande bundna hämmare packas till en bädd i ett rör av glas eller plast varefter en provlösning innehållande det enzym man vill renframställa pumpas igenom bädden. Endast det enzym eller de enzym som hämmas av den bundna molekylen kommer att fastna i gelbädden, de övriga tvättas ut ur densamma med en lämplig buffertsaltlösning. Genom att sedan ändra sammansättningen hos buffertsaltlösningen, t.ex. genom att sätta till en substans som binder till samma ställe på enzymet som hämmaren d.v.s. substratet eller cofaktorn, eller genom att ändra lösningens ph, kommer enzymet att lossna och kan tas tillvara från den lösning som lämnar kolonnen. På denna princip bygger ett mycket stort antal effektiva isoleringsförfaranden för olika enzymer som publicerats sedan tekniken 21