MÄLARDALENS HÖGSKOLA Akademin för hållbar samhälls- och teknikutveckling Detektion av Endosymbionter hos insekter via PCR, kloning och sekvensering Shaheen Rahman Examensarbete, 15 hp Handledare: Carl Påhlson Examinator: Sven Hamp
Abstract The purpose of this work was to detect microorganisms that live in symbiosis with various insects and arthropods. This thesis also aimed to provide insight into the different methods used in the biomolecular field to detect parasites in living organisms. The methods used were DNA purification, nested PCR, electrophoresis, bacterial culture, cloning and sequencing. The acronym stands for PCR polymerase chain reaction, a method that was discovered by Karry Muller in 1988 and for which he received the 1993 Nobel prize. The DNA polymerase, which makes the method available is a thermo-stable enzyme from the bacterium Thermus aquaticus. PCR is a very popular method in the field of biochemistry because it is a relatively simple method that can be used to efficiently amplify a selected sequence. The principle of PCR amplification is based on a repetitive series of temperature changes. The result is that you get millions of copies that are identical to the original sequence. Nested PCR is a variation of traditional PCR, which requires two primerpairs. The second DNA fragment primerpair strengthens further by using the amplified sequence from the first primerpair as template. Nested PCR is a good method but sensitive to pollutants that can cause false positive results. MiniPrep of DNA are made to get as high DNA concentration as possible and to remove any inhibitory substances, thereby making the PCR run as successful as possible. Gel electrophoresis is a method used to separate molecules by getting them to walk and separated by size so that you then can interpret the fragment length. The molecules migrate at different speeds depending on the DNA fragment length, the short fragments migrate rapidly and the long hike slowly. DNA sequencing is done to identify different species and to compare species within different genera. If the similarity in DNA sequence between two different species is high, this means that they are closely related. Sequencing can also be used to analyze non-culturable microorganisms.
Sammanfattning Syftet med detta arbete var att detektera mikroorganismer som lever i symbios med olika insekter eller leddjur. Detta examensarbete syftade också till att ge en inblick i de olika metoder som används inom det biomolekylära området för att detektera parasiter i levande organismer. Metoderna som användes var DNA rening, nested PCR, elektrofores, bakterieodling, kloning och sekvensering. Förkortningen PCR står för polymerase chain reaction, en metod som upptäcktes av Karry Muller 1988 och för vilket han fick 1993 års Nobel pris. Det DNA polymeras som gör metoden möjlig är ett termostabilt enzym som kommer från bakterien Thermus aquaticus. PCR är en väldigt populär metod inom det biokemiska området eftersom att det är en relativt simpel metod som kan användas för att effektivt amplifiera en utvald gensekvens. Principen för PCR amplifiering bygger på en upprepad serie av temperaturförändringar. Resultatet blir att man får miljontals kopior som är identiska med den ursprungliga sekvensen. Nested PCR är en variation av traditionell PCR, där det behövs två primerpar. Det andra primerparet förstärker DNA fragmentet ytterligare genom att använda den amplifierade sekvensen från det första primerparet som templat. Nested PCR är en bra metod men samtidigt känslig för föroreningar som kan förorsaka falskt positiva resultat. Miniprep av DNA görs för att få så hög DNA koncentration som möjligt samt för att få bort eventuella inhiberande substanser,för att man vilket i slutändan får ett så bra resultat som möjligt. Gelelektrofores är en metod som används för att separera molekyler genom att få dem att vandra och separera efter storlek så att man på detta sätt kan tolka fragmentets längd. Molekylerna vandrar i olika hastighet beroende på DNA fragmentets längd, de korta fragmenten vandrar snabbt och de långa vandrar långsamt. DNA-sekvensering görs för att identifiera olika arter och jämföra arterna inom olika släkten. Om likheten i DNA-sekvens mellan två olika arter är hög, betyder det att dem är nära släkt. Sekvensering kan också användas för att analysera icke odlingsbara mikroorganismer. 4
Innehållsförteckning Inledning 4 Syfte 5 Material 6 Provmaterial 6 Kemikalier 6 Utrustning 6 Instrument 6 Metoder 7-8 Rickettsia Wolbachia Resultat 9-11 Rickettsia Wolbachia Diskussion 12 Referenser 13
Inledning Endosymbiosis är ett grekiskt ord, endo betyder inre, sym betyder samman och biosis betyder levande. Endosymbionter är mikroorganismer som hjälper sin värd antingen genom att producera de näringsämnen som värden inte kan producera själv eller genom att metabolisera sin värds avfallsprodukter till säkrare form. Det är väl känt att vissa organeller i eukoryota celler, speciellt mitokondrierna uppstod via bakteriell endosymbiosis. Den ryska botinisten Konstantin Merechkowki formulerade denna teori (1905) och den kallas för endosymbiotic theory. I många fall är endosymbionter och deras värdceller beroende av varandra, med andra ord de kan inte överleva utan varandra, t.ex. Gutless havsborrmasker av släktet Riftia, som får näring från sina endosymbiotiska bakterier. Andra exempel är bladlössymbionter, Buchnera, som tillverkar viktiga aminosyror som bladlössen själva inte kan tillverka. De här bakterierna lever i en speciell sorts celler i bladlössens kropp och överförs från en generation till en annan genom att packas in i bladlössens ägg. 1 4
Syfte Syftet med detta examensarbete var att detektera endosymbionter som lever i insekter genom olika biomolekylära metoder. Vi detekterade två olika mikroorganismer som kan leva inuti olika insekter. Den ena är Wolbachia, en gramnegativ bakterie som upptäcktes av Marshall Hertig och Simeon Burt Wolbach i myggarten Culex pipiens 2. Den andra mikroorganismen är en Rickettsia som också är en G- bakterie och som infekterar däggdjur via vektorer av leddjur eller insekter. 5
Material Provmaterial 1 silverfisk, Lepisma saccharina² (LS) 1 gråsugga, Oniscus asellus² (OA) Kemikalier TBE-buffert Etidiumbromid (10 mg/ml) Chemically competent E. coli TOP 10, Invitrogen Kloningsvektor, pcr 2.1-TOPO Vector Agarose NA, GE Healthcare 17-0554-02 Agarplattor med ampicilin 50 µg/ml DNA storleksmarkör, Fermentas GeneRuler, 1 kb (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 bp) Ready to go beads, Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads 27-9557-01 Formamid loading dye, GE healthcare, batch 341122 Utrustning Ordinarie laboratorieutrustning. Ordinarie elektroforesutrustning Instrument PCR-maskiner: Biometra, T3 thermocycle och Hybaid PCR Express Centrifug: Hermle Z383K Sekvenseringsmaskin: ALF-express, serienr. 001664, Pharmacia biotech Inkubator: Gallencamp, Labassco UV-kamera: Variable-intensity transilluminator, 212 nm UV, model TVL-312 A, Spectroline, Spectronics Corporation 6
Metoder Rickettsia En nested PCR-assay gjordes för att detektera Rickettsia med ytterprimerparet P2/P3 och innerprimerparet P4/P5. Första steget var att preparera insekterna för att rena fram deras DNA, vilket skedde enligt manual för kitet DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen). DNA:t användes som templat för PCR amplifiering med ytterprimerparet P3/P2. Mastermixen för denna assay ses i tabell 1. Samtliga primers användes med koncentrationen 1 OD. Tabell 1. PCR reaktion för primers P3/P2. PCR reaktion (µl) Mastermix 5X (µl) Primer P2 1 5 Primer P3 1 5 Dest. vatten 22 110 Templat 1 5x1 Total volym 25 120 Provet från PCR amplifieringen med P3/P2 användes som templat för nested PCR med primrar P5/P4. Önskad fragmentstorlek var 213 bp. Samma mängd som i första steget användes men undantaget var att templat togs med en ögla för att undvika kontamination. När nested PCR körningen var klar var det dags för elektrofores för att studera DNA fragmentens storlek. För att köra elektrofores blandades agarosgel med procenthalten 1,5 i TBE buffert. Då PCR med innerprimerparet P4/P5 blev negativt gjordes en spädning av templatet 100X och sedan kördes provet om. Dock med samma negativa resultat för gråsuggan. Silverfisken blev däremot positiv vid ny körning med båda Rickettsia primers. Se figur 1. Bilden visar att med primer P4/P5 amplifieras även ett extraband på ca 300 bp. För att undvika detta utfördes gelextraktion och därefter en ny PCR med färre cykler och specifik amplifiering. 7
Figur 1. Ny PCR med P2/P3 och P4/P5. Brunn 1-5: PCR med P2/P3. Brunn 6-11: PCR med P4/P5. I figuren ses: Brunn 1) Storleksmarkör 1 kb 2) Positiv kontroll 3) Negativ kontroll 4) Utspädd OA 5) LSk 6) Storleksmarkör 1 kb 7) Positiv kontroll 8) Utspädd OA 9) LS 10) Negativ kontroll 11) Storleksmarkör 1 kb Wolbachia Den andra PCR-analysen utfördes för detektion av Wolbachia och kördes med WSP forward/wsp reverse med alla insekternas DNA som templat. PCR kördes enligt samma princip som föregående analys. WSP-genen som är templat i denna PCR är ytterligt specifik och endast Wolbachia bör amplifieras. Kloning gjordes enligt manualen för kitet TOPO TA Cloning Kit for sequencing, pcr 2.1- TOPO Vector. För Rickettsia testades 8 kloner med primers M13/T7 varav 5 hade fragment av rätt storlek (391 bp, varav 213 bp är fragmentet och 178 bp är kloningsvektorn.) Motsvarande fragmentstorlek för Wolbachia bör vara 788 bp. Cykelsekvensering med primern T7 utfördes med kitet BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing enligt manual. 3 8
Resultat Rickettsia I figur 2 visas DNA fragmentet för silverfisk och gråsugga som amplifierades med primerpar P3/P2 och P5/P4. Resultatet för gråsuggan med P3/P2 är ett starkt och tydligt band som stämmer med förväntad storlek på 370 bp. Trots att gråsuggans DNA gav ett kraftigt band med ytterprimerparet blev det negativt med nested primers. Ett svagt band kan urskiljas men är av samma storlek som amplifikatet från PCR1. Trots utspädning var resultatet fortfarande negativt. Figur 2. Bilden visar resultatet för primrar P3/P2 och P5/P4 för silverfiskens samt gråsuggans DNA. Brunn: 1) Storleksmarkör 1 kb 2) Negativ kontroll 3) P2/P3 med OA DNA som templat 4) P2/P3 med LS DNA som templat 5) P4/P5 med LS 6) P4/P5 med OA 7, 8) Negativa kontroller 9) Storleksmarkör 1 kb Efter gelextraktion och ny PCR erhölls ett fint och tydligt band från silverfisken. Fragmentstorleken stämmer överens med den förväntade. Se figur 3. Kloner från kloning med detta fragmentet ses i figur 4. Figur 3. Ny PCR med specifik amplifiering för LS DNA.. Brunn 1) Storleksmarkör 1 kb 2) LS DNA som templat 3) Storleksmarkör 1 kb 9
Figur 4. Kloner från kloning med Rickettsia fragmentet från silverfisken. I brunn 4, 5, 6, 7 och 8 ses de positiva kloner som sekvenserades. Sekvensering av utvalda kloner och sökning i databasen BLAST 4 bekräftade att vi hade lyckats amplifiera 17 Kda yttre membranprotein genen och att den art som gav bäst överenstämmelse var Rickettsia helvetica. Wolbachia Resultatet med WSP forward/reverse visar att ett fragment av rätt storlek. Figur 4. PCR med Wolbachia forward/reverse. Brunn 1) Storleksmarkör 1 kb 2) Negativ kontroll 3) Silverfiskens DNA 4) OA DNA 5) Storleksmarkör 1 kb 10
Resultatet stämmer bra med den teoretiska Wolbachia fragmentstorleken (610 bp). Positiv amplifiering erhölls endast med LS DNA. M13/T7 amplifiering av kloner från kloning med Wolbachia ses i figur 5 på nästa sida. Tyvärr kunde inget sekvenseringsresultat erhållas. Figur 5. Figuren visar kloner från kloning med Wolbachia fragmentet från LS. Storleksmarkör 1 kb användes. I brunn 1, 2, 3 och 6 ses kloner med rätt fragmentstorlek. 11
Diskussion En period på 10 veckor är en relativt kort tid för att sätta upp och optimera metoder för PCRdetektion via kloning, amplifiering och sekvensering av icke-odlingsbara mikroorganismer. Här har vi lyckats få fram preliminära bevis på att Rickettsia kan förekomma i LS där de aldrig tidigare påvisats. Att vi inte fick något sekvenseringsresultat med Wolbachia kan bero på många olika faktorer. Det kan bero på kontamination, kemikalier eller på att det kanske inte alls fanns några Wolbachia gensekvenser. Man kan få funderingar över de fragment som motsvarade Wolbachias fragmentstorlek. Svaret kan bli att det var LSs egna DNA som gav fel` bildresultat. Det är bara en teori. 12
Referenser 1. Welburn, S.C., Maudlin, I. & Ellis, D.S. 1987, In vitro cultivation of rickettsia-likeorganisms from Glossina spp. Ann. Trop. Med. Parasitol., vol. 81, sidor 331-335 2. Hertig, Marshall; Wolbach, S. Burt, "Studies on Rickettsia-like microorganisms in insects", Journal of Medical Research, 1924, vol. 44, sidor 329 74 3. Manual, BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit, Applied Biosystems 4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/sequence-analysis/, National Center for Biotechnology Information, 2009-11-20 13