Detektion av mrna från en cytokrom c gen belägen i genklustret för kloratmetabolism i Ideonella dechloratans

Faculty of Technology and Science Chemistry Pontus Sundin Detektion av mrna från en cytokrom c gen belägen i genklustret för kloratmetabolism i Ideonella dechloratans Detection of mrna from a cytochrome c gene located in the gene cluster for chlorate metabolism in Ideonella dechloratans Kemi C-uppsats Datum/Termin: Handledare: Examinator: VT-2012 Maria Rova Thomas Nilsson Karlstads universitet 651 88 Karlstad Tfn 054-700 10 001 Fax 054-700 14 60 Information@kau.se www.kau.se

Abstract In previous experiments with the bacterium Ideonella dechloratans a probable sequence coding for a cytochrome c protein (cyt c) was observed, the sequence is assumed to have a function in the bacterial respiratory chain. Detection attempts have been made to try to find this protein, but have not succeeded. The purpose of this project is to detect the expression of mrna associated with the cytochrome c. And if it is detected, it will also be investigated if there is any difference in expression of the mrna due to aerobic or anaerobic environment. Total RNA was purified from cultures grown under aerobic and anaerobic conditions. cdna was then synthesized using reverse transcriptase and subsequently amplified with the specific primers in a qrt-pcr. qrt-pcr testing showed a distinct amplification of primer product, confirming that I. dechloratans expresses mrna coding for the cyt c protein. Since the protein has not been observed in attempts to purify c cytochromes from I. dechloratans this indicates that the detection efforts of the protein failed or that the regulation of the protein is strongly inhibited after the transcription step. The tests suggest that a possible difference in expression between aerobic and anaerobic culture conditions may occur, but more and better-optimized tests are needed to confirm this. 2

Sammanfattning Vid tidigare experiment med bakterien Ideonella dechloratans observerades en sekvens troligtvis kodande för ett cytokrom c protein (cyt c) som antas ha en funktion i bakteriens andningskedja. Detektionsförsök har gjorts för att försöka hitta detta cytokrom c protein, men har inte lyckats. Syftet med detta projekt är att detektera uttrycket av mrna tillhörande detta c cytokrom. Samt om det detekteras; även undersöka om det finns någon skillnad i uttryck av mrna beroende på aerob eller anaerob miljö. TotalRNA renades fram från kulturer odlade under aeroba respektive anaeroba förhållanden. cdna syntetiserades sedan med hjälp av omvänt transkriptas och därefter amplifierades det med specifika primrar i en qrt-pcr. qrt-pcr testerna visade en tydlig amplifiering av primerprodukten, vilket bekräftar att I. dechloratans uttrycker mrna kodande för cyt c proteinet. Då proteinet hittills inte observerats i försök att rena fram c cytokromer från I. dechloratans tyder det på att detekteringsförsöken av proteinet misslyckats eller att regleringen utav proteinet är starkt inhiberat efter transkriptionssteget. Testen tyder på att en eventuell skillnad i uttryck mellan aeroba och anaeroba odlingsbetingelser kan förekomma, men fler och bättre optimerade tester behövs för att bekräfta detta. 3

Innehållsförtekning Abstract... 2 Sammanfattning... 3 Förkortningar... 5 Inledning... 6 Oxoklorater... 6 Ideonella dechloratans... 6 Nedbrytning av oxoklorat... 6 Genkluster för kloratmetabolism... 7 Cytokrom c... 7 qrt-pcr... 8 Syfte... 9 Material och metod... 9 Odling och extrahering av RNA... 9 Kontroll av RNA... 10 cdna syntes... 10 Primerdesign... 11 qrt-pcr... 11 Resultat och diskussion... 12 Kontroll av primrar.... 13 Kontroll av RNA-preparationer... 14 Detektion av cyt c mrna... 15 Effektivitetstest... 16 Uttrycket av cyt c under olika odlingsförhållanden... 18 Slutsats... 19 Referenser... 19 Bilaga 1... 21 Bilaga 2... 22 Bilaga 3... 23 4

Förkortningar bp Baspar Cld Kloritdismutas Clr Kloratreduktas C T Cytc dntp Cykel tröskelvärde Cytokrom c Deoxinukleosidtrifosfat E. coli Escherichia coli I. dechloratans Ideonella dechloratans OD Optisk Densitet PCR Polymerase Chain Reaction qrt-pcr quantitative Real-time PCR 5

Inledning Oxoklorater Oxoklorater innefattar bland annat klordioxid ClO 2, klorit, klorat och perklorat. Dessa molekyler är vattenlösliga och finns naturligt i miljön men har nu på senare tid uppmärksammats på grund av spridningen via bl.a. ogräsmedel [1], raketbränsle och blekningsmedel. Intagandet av oxoklorater har visat sig hälsofarligt för människor då t.ex. perklorater kan agera som kompetitiv inhibitor vid transportprocessen av jod till sköldkörteln [3] vilket bl.a. kan resultera i struma, hypotyrodism och störningar i kroppens ämnesomsättning. Klorat är även giftigt för växter t.ex. tomatplantor[3] och brunalger[4]. Ideonella dechloratans För att förhindra spridningen utav oxoklorater används biologisk rening i form av bakterieodlingar som tar hand om oxokloraterna. Detta sker med hjälp av bakterier som använder sig av oxoklorater som elektronacceptor i sin andningskedja. Bakterien Ideonella dechloratans är en av många gramnegativa β-subklass proteobakterier[5] med förmågan att bryta ner oxoklorater under anaeroba förhållanden. I. dechloratans är en fakultativt anaerob bakterie som kan växa via reduktionen av klorat, dock klarar den inte av att reducera perklorater. Nedbrytning av oxoklorat Nedbrytningen av oxoklorater kan ske i en trestegsreaktion eller en tvåstegsreaktion beroende på om bakterien har förmågan att bryta ner perklorater eller inte. Perkloratnedbrytning sker via enzymet perkloratreduktas som bryter ner perklorat till klorit. Tvåstegsreaktionen sker hos organismer som saknar förmågan att bryta ner perklorater och använder sig av enzymet kloratreduktas för att bryta ner klorat till klorit. I. dechloratans använder sig i sin anaeroba andningskedja av två stycken enzymer: kloratreduktas och kloritdismutas, som befinner sig i bakteriens periplasma. Kloratreduktas reducerar klorat till klorit med hjälp av cytokrom c proteiner som donerar elektroner[5]. Kloritdismutas katalyserar sedan nedbrytningen av klorit till klorid och syre. I. dechloratans bryter ner klorater på följande vis: klorat till klorit via enzymet kloratreduktas, sedan katalyseras klorit 6

till klorid och syre via kloritdismutas, ClO 3 - ClO 2 - O 2 + Cl -, där syret sedan används av ett membranbundet respiratoriskt oxidas. Genkluster för kloratmetabolism I. dechloratans genkluster för kloratmetabolism sekvenserades av Danielsson Thorell et al [6] och Bohlin et al[7]. Figur 1 visar genklustret tillhörande I. dechloratans samt 2 liknande genkluster tillhörande bakterierna Dechloromonas agitata och Alicycliphilus denitrificans. En gensekvens som med stor sannolikhet kodar för ett cytc protein finns omedelbart nedströms om generna för kloratreduktas subenheter (clra-c) hos I. Dechloratans och A. denitrificans [8] [cyt; GenBankID: EU768872] markerat röd i figur 1 (samt bilaga 2). I försök att rena c cytokromer från I. dechloratans så har inget sådant hittats med en aminosyrasekvens som stämmer överens med gensekvensen från cyt c genen i klustret. I. dechloratans ISIde1 clra clr B clr D clr C Cytc mobb D. agitata pcr cld pcr A pcr B pcr D C A. denitrificans clra clrb clrc Cytc mobb Figur 1 Jämförelse av kloratmetabolismkluster I. dechloratans, D. agitata och A. denitrificans. Kloritdismutas (Cld), kloratreduktas (Clr A-D), (per)kloratreduktas (pcr A-D), insättningssekvens (ISIde1), cytokrom c (Cytc) sekvensen som undersöks markerat i rött, gen kodande för molybdenum kofaktor biosyntes (mobb). Cytokrom c Cytokrom[9] c är proteiner med kovalent bundna hem-grupper med egenskapen att acceptera eller donera elektroner via oxidering eller reducering av järn i hem-gruppen. I. dechloratans använder sig av denna typ av protein för att transportera elektroner till 7

kloratreduktas och till terminal oxidaset som utför reduceringen av syret som bildas vid nedbrytningen av klorit. Den ovannämnda cytc genen (figur 1) som befinner sig i kloratmetabolism genklustret tillhörande I. dechloratans misstänks inneha en funktion vid dess kloratnedbrytning (Fig 1). qrt-pcr För att undersöka uttrycket av detta c cytokrom användes qrt-pcr för att mäta förekomsten samt skillnaden av mrna-nivån vid olika odlingsbetingelser. Metoden gjordes i 2 steg där cdna syntesen gjordes separat som sedan användes i qrt-pcren. Realtids PCRen mäter amplifieringen under hela körningen via fluorescens mätningar, i detta fall användes SYBR green reagens för att skapa fluorescens. Obundet SYBR green fluorescerar i ytterst liten grad, men när det icke-specifikt binder till dubbelsträngat DNA ökar fluorescensen avsevärt. Med hjälp av detta kan amplifieringen av en primerprodukt mätas efter varje PCR cykel då den fördubblas efter varje cykel vid 100% effektivitet. Amplifieringen i PCR-reaktionen sker enligt ekvationen: = (1 + ) [1] Där X n är mängden targetmolekyler vid cykeln n av reaktionen. X 0 är start mängden targetmolekyler som fanns ifrån början. E är effektiviteten av. Som mått på ursprungsmängden templat används ofta antalet cykler (C T ) som behövs för att producera en bestämd mängd (tröskelvärdet X T ) produkt: = (1 + ) [2] X T är tröskelvärdet för targetmolekyler, ju lägre C T värde desto större mängd av RNA fanns ifrån början. Ett exempel på en amplifieringskurva kan ses i bilaga 3 figur 5. Eftersom metoden är väldigt känslig är jämförelser mellan små skillnader av prover möjlig och utnyttjas i detta experiment. Genom att jämföra cykeltröskelvärden för olika prover kan skillnaderna i deras ursprungliga mrna nivåer beräknas. Om man antar att mängden targetmolekyler är lika i två prover (X 1 och X 2 ) vid en given fluorescensnivå så fås X T1 =X T2 och av det följer ekvationen: = ( ) ( ) [3] Om E är lika i de båda proverna fås att kvoten mellan ursprungsnivåerna av RNA = (1 + ) [4] För att jämföra de ursprungliga mängderna RNA i två prover på ett tillförlitligt sätt behöver 8

man relatera mängden targetmolekyler för den gen man önskar mäta till en referensgen. Referensgenens utryck ska inte förändras med de betingelser som man vill jämföra. Vid en effektivitet nära 100% kan då kvoten mellan normaliserade värden för mrna-nivåer för två prover man vill jämföra beräknas med hjälp av[11]: = ( ) ( ) ( ) ( ) [5] Där R står för C T värden tillhörande referensgenen. Syfte Syftet med detta arbete är att försöka detektera mrna tillhörande en trolig cytc sekvens som befinner sig i genklustret för kloratmetabolism. Och om det går att detektera också jämföra uttrycket av genen i bakteriekulturer som odlats under aeroba respektive anaeroba förhållanden. Material och metod Odling och extrahering av RNA Ideonella dechloratans odlades upp i övernattkulturer, 15 µl från fryskultur ympades till 5 ml PC-medium i ett 15 ml falconrör. Alla odlingar i detta experiment inkuberades i 37 C med 200 rpm skakning. Se bilaga 1 för medium recept. Från övernattkulturen togs 1 ml och fördes direkt över till en 250 ml e-kolv med ca 50 ml PC-medium för aerob odling. För den anaeroba odlingen så togs 4 ml av övernattkulturen och centrifugerades i 4500 x g i 10 minuter. Supernatanten dekanterades av och pelleten sköljdes sedan med anoxmedium, efter resuspendering i anoxmedium centrifugerades röret igen. Efter avhällningen av supernatant resuspenderades pelleten i residualvätskan och pipetterades över till en 50 ml e-kolv fylld med anoxmedium och 10 mm klorat. E-kolven förslöts med en gummipropp, för extrahering av bakterielösning användes en 10 ml spruta och kanyl. 120 µl kvartskyvetter användes för spektrofotometriska mätningar. Efter ca 3-4 timmar skördades de aeroba bakterierna då de hade ett OD 600 mellan 0,4-0,6. Ett antagande har gjorts om att koncentrationen Ideonella bakterier är densamma mängd som E. coli skulle ha vid uppmätta OD: OD600= 1 ger 1*10 9 celler/ml. Qiagen RNAprotect TM 9

Bacteria Reagent användes enligt tillverkarens (Qiagen) instruktioner, detta reagens tillsattes till de skördade bakterierna. Aerob odlingen med OD 600 =0,479 gav ca 4,5-5*10 8 celler/ml, 500 µl togs för RNA protect, dvs. 2,5*10 8 celler. Till 500 µl bakterielösning tillsattes 1000 µl RNA protection reagens. RNA extraherades med Qiagen RNeasy med metoden för mekanisk sönderslagning av cellerna enligt tillverkarens instruktioner tillsammans med de två möjliga DNAse stegen. Antal bakterier per kolonn beräknades vara mindre än 5 x 10 6 bakterier. Kontroll av RNA För att undersöka förekomst samt koncentrationen RNA gjordes en spektrofotometrisk mätning av absorbansen vid 260 och 280 nm med 2 µl per prov och TE buffert som blankt prov. Ett spektrum mellan 400-230 nm gjordes även för att se att det bara finns DNA/RNA i provet. För att påvisa renheten av provet gjordes även en gelelektrofores (2 % agarosgel) med det renade RNAt. För ett positivt experiment är det förutsatt att 16S och 23S banden skall synas utan smear för att indikera onedbrutet RNA. cdna syntes cdna syntesen på de preparerade RNA proverna skedde via High capacity cdna reverse transcription kit nr 4368813 från Applied biosystems 1000 reaktioner. Recept per reaction:10 x RT buffert 2 µl, 25x dntp mix 0,8µl, Multiscribe reverse transcriptase 1 µl, 4,2 µl Nuklease-fritt vatten. 10 µl utav ovanstående mastermix pipetterades ihop med 1 µg RNA justerat till 10 µl för att ge en totalvolym på 20 µl. Negativa cdna kontroller gjordes även enligt recept där Multiscribe reverse transcriptase bytts ut mot nukleas-fritt vatten. Syntesen gjordes enligt: 25 C 10 min, 37 C 120 min, 85 C 5 min, 4 C min. 10

Primerdesign Programmet Lasergene DNA star användes på cytokrom sekvensen [cyt; GenBankID: EU768872] samt bilaga 2. För att undvika ospecifik primerbindning uteslöts hem-gruppens position[7]100-111 i sekvensen. För att undersöka cytc primrarnas effektivitet kördes primrarna i en vanlig PCR med annealing temperaturen 57 C tillsammans med Taq polymeras och genomiskt DNA som templat (19ng/µl) där 1 µl användes för PCR. 10x Taq Buffert 5 µl, dntp mix 2 mm av varje 5 µl, forward primer 1 µm 2,5 µl, Reverse primer 1 µm 2,5 µl, templat DNA 1 µl, nuklease-fritt vatten 37 µl, total volym 50 µl. Programmet kördes enligt: 5 min 94 C, 1 min 94 C, 1min 57 C, 1 min 72 C. Från beräknade smälttemperaturer från Lasergene DNA Star och produkt specifikationerna från Cybergene AB valdes(värden ej visade) en annealing temperatur till 57 C. qrt-pcr qrt-pcr recept per reaktion som användes för alla experiment: 12,5 µl Brilliant SYBR Green mix artikelnummer: #600828, 0,2 µm 1 µl UP primer, 0,2 µm 1 µl LP primer, 4 µl utspätt templat, 6,5 µl Nuklease-fritt vatten. För amplifiering användes ett Real-Time PCR Applied Biosystems StepOnePlus instrument. Alla prover gjordes som triplikat. En spädningsserie på 1 ng, 0,5 ng, 0,2 ng och 0,05 ng med aeroba samt anaeroba prover och 1 ng negativ cdna kontroll utan omvänt transkriptas testades för undersökning av lämplig provmängd för de designade cytc primrarna (tabell 2) (här används 57 C). Från resultatet av detta test bestämdes koncentrationen för nästkommande körningar till 2 ng templat och Tm 57 C för prover med cytc primrar och 16S rrna primrar (referensgen). Uppsättningen av de fortsatta experimenten gjordes med aerobt och anaerobt cdna templat med cytc primrar och 16S rrna (119 bp produktlängd) primrar (tabell 1). Tabell 1 Designat primerpar för 16S rrna med sekvens i riktning från 5 mot 3. 5' -> 3' Position Tm ( C) Fragmentlängd (bp) Upper primer CATCGGAACGTGCCCAGTAGTG 86-107 59,0 Lower primer TGACATCGGCCGCTCCAATAG 204-184 59,5 119 Som negativa kontroller användes reaktionblanding där omvänt transkirpats uteslutits, samt 11

vatten. För att undersöka effektiviteten av amplifieringen gjordes även ett effektivitetstest med koncentrationerna 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, 0,01 ng aerobt och anaerobt templat med cytokrom c primrar, samt rrna primrar. För en jämförelse mellan uttrycket av cytc, Cld och Clr användes även cdna templat tillsammans med Cld och Clr primrar[12]. Cld och Clr proverna kördes med 60 C annealing temperatur och samma primerkoncentration som i receptet ovan. För att jämföra uttrycket av cyt c med Cld och Clr beräknades C T kvoter, dock gjordes inget effektivitetstest med Cld eller Clr så effektivitetsvärdet E=1 användes. Beräkningen gjordes enligt = ( ) ( ) [6] där X är ursprunglig mängd cyt c mrna och R är ursprunglig mängd Cld och Clr mrna. Resultat och diskussion Nedanstående primerpar för cytc designades: Tabell 2 Designat primerpar för cytc med sekvens i riktning från 5 mot 3. 5' -> 3' Position Tm ( C) Fragmentlängd (bp) Upper primer GCCCGGCCTGGAATGAA 263-279 56,4 Lower primer TTGTTTTGATGTCGGCGTCTTTGA 415-392 60,3 153 Den beräknade längden av primerprodukten är 153 bp (Bilaga 2). 12

Kontroll av primrar. För att säkerställa att det designade primerparet fungerade som förväntat testades de i en PCR reaktion med genomiskt DNA som templat. Observera att en omvändning av gråskalan gjorts för att banden skall synas bättre i figur 2B. Figur 2 Test av cytc primrar med Low Range O GeneRuler DNA ladder som stege i brunn 1 och ett aerobt prov i brunn 3 och anaerobt prov i brunn 5. 2 % -iga agarosgeler. Gelerna utsattes för 100 V under ca 30 min. A) visar en PCR-produkt i brunn 5 vid ca 150 bp samt rester av primrar längst ner. B) Visar en primerprodukt i brunn 3 samt rester av primrar strax under. Som man kan se i figur 2A och 2B finns det ett band i brunn 5 (anaerobt prov) vid ca 150 bp, primerproduktens storlek ligger på 153 bp (tabell 1), vilket indikerar att det är den förväntade primerprodukten som observerats. I figur 2A ser man ett tydligt band i brunn 3 (aerobt prov). Dock saknas det en stege i figur 2B, men eftersom gelerna i figur 2A och 2B har utsatts för lika hög spänning under likvärdig tid kan man med en viss säkerhet jämföra figur 2A med figur 2B. Som man kan se i de två figurerna befinner sig rester av primrar längst ner i brunn 3 och 5 i likvärdig position, samt positionen av primerprodukten i brunn 5 från figur 2A och produkten i brunn 3 från figur 2B. Resultatet från elektrofores testen av produkt från PCR körningen visar att primrarna ger en produkt och att en 57 C annealing temperatur är helt acceptabel. 13

Kontroll av RNA-preparationer För att undersöka RNA preparationen från eventuell RNA-nedbrytning analyserades produkten med agarosgelelektrofores. Figur 3 2 % agarosgeler A) Lambda DNA/Eco130I stege i brunn 1, RNA från det anaeroba provet i brunn 3, RNA från det aeroba provet i brunn 5. B) Stege i brunn 2, anerobt prov i brunn 4. Figur 3A och 3B visar 2 tydliga band för både de aeroba och anaeroba RNA proverna. Figuren 3A innehåller både anaerobt prov och aerobt prov, men då det anaeroba provet inte kunde observeras, gjordes det en till körning med enbart anaerobt prov (figur 3B). Skillnaden mellan positionen av banden i figur 3A och 3B indikerar att de inte gjorts under identiska förhållanden. Banden i figur 3A befinner sig högre upp jämfört med banden i figur 3B. De två banden i figur 3B stämmer överens med storleken för 16S rrna och 23Sr RNA vid ca 1500 baspar och 2000 baspar. Vid en preparation av totalrna förväntas det att man ser dessa två band med rrna. Smear utan tydliga band indikerar att RNA t blivit nedbrutet och även fast en skillnad finns mellan figur 3A och 3B går det att konstatera att RNA t tycks vara intakt. Tabell 3 Spektrofotometrisk mätning (280 och 260 nm) av RNA-preparationer från celler odlade under aeroba respektive anaeroba förhållanden. Kvoten beräknades fram genom att ta A260/A280. TE buffert använt som blankprov. A 260nm A 280nm Koncentration Kvot Aerobt prov 1 0,1996 0,0904 159,68 ng/µl 2,21 Aerobt prov 2 0,196 0,0939 156,8 ng/µl 2,08 Anaerobt prov 1 0,1053 0,0503 84,24 ng/µl 2,09 Anaerobt prov 2 0,1015 0,0471 81,2 ng/µl 2,15 14

Koncentrationen och renhet av preparationerna bestämdes med hjälp av spektrofotometri. Från data i tabell 3 konstaterades det att reningen av RNA givit en acceptabel mängd nukleinsyra för vidare experiment. Kvoten A260/A280 mäter graden renhet i provet, för rent RNA bör kvoten ligga på ca 1,9-2,2. Vilket de gör i tabell 3 och preparationen anses då vara ren från kontaminationer. cdna syntesen antas producera samma mängd cdna som mängd RNA i provet (1:1). Detektion av cyt c mrna Tabell 4 Test av templat koncentrationer. Med beräknade medel cykeltröskel värden från triplikat, standardavvikelse och smälttemperatur. Prover i vilka amplifieringen misslyckats har tagits bort. Templat Medel C T Standardavvikelse Smälttemperatur C (approximativt) 1 ng Aerobt cdna 27,02 0,07 83 1 ng Anaerobt cdna 24,83 0,19 83 0,5 ng Aerobt cdna 28,42 0 83 0,5 ng Anaerobt cdna 26,20 0,04 83 0,2 ng Aerobt cdna 28,97 0,95 83, 77 och 67 0,2 ng Anaerobt cdna 30,29 0 83, 77 och 67 0,05 ng Aerobt cdna 0 0 83, 77 och 67 0,05 ng Anaerobt cdna 29,20 1,08 83, 77 och 67 Tabell 4 visar resultatet från ett försök där mängden templat varierats. Försöket bekräftar att cyt c mrna t uttrycks inom I. dechloratans. Amplifieringen har skett med hjälp av cyt c specifika primrar. Koncentrationerna av templat som använts är 1 ng, 0,5 ng, 0,2 ng och 0,05 ng av respektive aerob och anaerobt prov. De negativa kontrollerna (NTC) i försöket gav C T - värden över 34 (exempel kan ses i bilaga 3 figur 5) vilket visar att det är mrna-specifik amplifiering som sker. Vid låga koncentrationer av cdna templat (0,2 och 0,05 ng) uppstår det fler smälttemperaturer. Vilket skulle kunna förklaras av primerdimerisering som kan ske vid otillräcklig mängd templat i provet. En större mängd templat gav bättre reproducerbarhet i triplikaten och mängden specifikt mrna ser ut att vara låg i alla de testade proverna, eftersom ett C T -värde för den genspecifika reaktionen ska ligga ca 10 cykler från de negativa kontrollerna. På grund av detta valdes en högre templatmängd (2ng) för de fortsatta försöken. 15

Tabell 5 En samling av alla försök med 2 ng templat. Aerob cyt c Anaerob cyt c Aerob 16S rrna Anaerob 16S rrna Medel C T Försök 1 25,52 22,41 13,53 11,63 Medel C T Försök 2 22,47 20,43 10,52 9,33 Medel C T Försök 3 22,53 20,65 10,15 9,46 Medel C T Försök 4 24,23 21,71 9,84 9,42 Tabell 5 visar en sammanställning av alla försök innehållande 2 ng cdna templat. Dessa värden användes tillsammans med effektivitetsmätningen för att jämföra uttrycket av de olika odlingsbetingelserna. Bilaga 3 figur 5 visar ett exempel på en representativ amplifieringskurva. Effektivitetstest Amplifieringen sker med en faktor 1+E (E=effektiviteten) där effektiviteten kan bestämmas genom att avsätta C T -värden mot log templatmängden och beräknas då enligt = 10 ( ) 1 [7] Effektivitetsvärden i intervallet 90-110% är acceptabla[13] och amplifieringen kan då approximeras till X n =X 0 x 2 n. Vid effektivitetsvärden utanför det intervallet bör i första hand PCR-förhållandena optimeras men om man vill försöka beräkna relativa mrna-nivåer så använder man då de uppmätta värdena på E (ekvation 3). 16

35 30 25 Effektivitetstest y = -4,14x + 36,22 (R 2 =0,9984) y = -3,94x + 33,59 (R 2 =0,9998) y = -3,97x + 22,53 (R 2 =1) y = -3,86x + 21,98 (R 2 =0,9993) Medel C T 20 15 10 Aerobt Cyt C Anaerobt Cyt C Aerobt rrna Anaerobt rrna 5 0 0 1 2 3 4 5 6 Spädning i logaritmisk skala Figur 4 Spädningsserien börjar vid koncentrationen 0,01 ng (x=1) och går mot 100 ng (x=5). Samt R 2 -värden som visar styrkan av sambandet mellan de uppmätta värdena. Tabell 6 Effektivitetsmätning innehållande k-värden(slope) tagna ur trendlinje ekvationerna (figur 4) för varje prov samt beräknad effektivitet i procent. Slope Effektivitet (%) Aerobt Cytc -4,14 74 Anaerobt Cytc -3,94 79 Aerobt RNA -3,97 78 Anaerobt RNA -3,86 82 Effektivitetsmätningen (figur 4 och tabell 6) visar att amplifieringen sker med en effektivitet av 74-82%. Detta betyder att amplifieringen håller sig utom den acceptabla effektiviteten[10] för att E=1 och innebär att beräkningarna av mrna-nivåer bör göras med hjälp av de uppmätta E-värdena. R 2 värden > 0,99 ger ett bra förtroende för att korrelera C T - värdena mot den logaritmerade koncentrationen[10]. 17

Uttrycket av cyt c under olika odlingsförhållanden För att undersöka skillnaden i uttryck användes ekvation 5 med effektivitetsvärdena från tabell 6 och C T -värden från tabell 5. R 1 är C T -värde från de aeroba rrna proven, X 1 är C T - värde från de aeroba cyt c proven, samt R 2 från de anaeroba rrna proven och X 2 från de anaeroba cyt c proven. Effektivitetsvärden användes för korresponderande prov, t.ex. E=0,74 för de aeroba cyt c proven. Tabell 7 Kvot-värden beräknat med ekvation 5. Primerpar Kvot Medel kvot 1,29 Cyt c 1,07 1,31 2,12 1,45 C T -värden från Tabell 5 användes för att beräkna andelen cyt c mrna i celler odlade under aeroba förhållanden jämfört med celler odlade under anaeroba förhållanden, Tabell 7. Som man kan se befinner sig värdena vid och under värdet 2, detta tyder på att det troligtvis inte finns någon skillnad i uttryck[13] mellan de aeroba och anaeroba kulturerna. Eftersom effektiviteten av amplifieringen var låg och visade stora skillnader mellan de olika primerparen (Tabell 6) finns det dock en osäkerhet i försöken. Tabell 8 Jämförelse mellan uttryck av cyt c, Cld och Clr. Kvot Cyt c/cld Cyt c/clr 0,39 0,85 0,26 0,66 Ett försök gjordes även med att jämföra uttrycket av cyt c med uttrycket av cld och clr. Tidigare mätningar har visat att dessa geners uttryck ökar ca 10 gånger under anaeroba förhållanden. Tabell 8 visar beräkningar gjorda med ekvation 5 där uttrycket av cyt c jämfördes med uttrycket av Cld och Clr. Uttrycket av cyt c ser ut att induceras 3-4 gånger mer under anaeroba förhållanden än vad uttrycket av Cld gör och ungefär lika mycket som för Clr. Försöken behöver dock kompletteras med fler mätningar samt med effektivitetsbestämningar för reaktionerna med cld- och clr-specifika primrar innan några direkta slutsatser kan dras. 18

Slutsats mrna tillhörande cyt c genen som befinner sig i genklustret för kloratmetabolism i I. dechloratans har observerats i alla försök. Då proteinet som detta mrna kodar för inte har påträffats vid detektionsförsök tyder det på att detekteringsförsöken av proteinet misslyckats eller att regleringen utav proteinet är starkt inhiberat efter transkriptionssteget. Vid jämförelsen av mrna uttryck från aeroba och anaeroba kulturer med cyt c primrar och 16S rrna primrar tycks ingen skillnad förekomma. Men vid jämförelsen mellan cyt c, Cld och Clr uttryck, tyder testet på att cyt c induceras under anaeroba förhållanden. Dock är inte dessa jämförelser fullt pålitliga då effektiviteten av amplifieringen med cyt c och 16S rrnaprimrarna var låg och ingen effektivitetsmätning gjorts på amplifieringsreaktionerna med Cld och Clr specifika primrar. Då resultatet indikerar att en eventuell skillnad kan finnas bör fler och bättre optimerade tester göras. Referenser [1] A. S. Crafts. Physiological problems connected with the use of sodium chlorate in weed control. Plant Physiol. (1935) October; 10(4): 699 711. [2] Monte A et al. Health effects assessment for environmental perchlorate contamination: the dose response for inhibition of thyroidal radioiodine uptake in humans. Environ Health Perspect. (2002) September; 110(9): 927 937. [3]J. J. Hofstra. Chlorate Toxicity and Nitrate Reductase Activity in Tomato Plants. Physiologia Plantarum. (1977) 41 (1): 65 69 [4] Dolf J. van Wijk et al. Toxicity of Chlorate and Chlorite to Selected Species of Algae, Bacteria, and Fungi. Ecotoxicology and Environmental Safety. (1998) 40 (3): 206 211 [5] Åsa Malmqvist et al. Ideonella dechloratans gen.nov., sp.nov., a New Bacterium Capable of Growing Anaerobically with Chlorate as an Electron Acceptor. System. Appl. Microbiol. (1994) 17: 58-64 [6] Danielsson T et al. A gene cluster for chloratemetabolism in Ideonella dechloratans. Appl. Environ. Microbiol. (2003) 69: 5585 5592. 19

[7] Bohlin J et al. Characterization of a cytochrome c gene located at the gene cluster for chlorate respiration in Ideonella dechloratans. (2010) 165 (6): 450 457 [8] Anna S. Bäcklund et al. c Cytochromes as Electron Carriers in Microbial Chlorate Respiration. Dissertation Karlstad University Studies (2011) [9]Cytochromes http://metallo.scripps.edu/promise/cytochromes.html Accessed in March 2012 [10]Understanding C T http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocu ments/cms_053906.pdf Accessed in March 2012 [11] Kenneth J et al. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^ C T Method. (2001) METHODS 25: 402 408 [12]Miriam Hellberg Lindqvist et al. Expression of Chlorite Dismutase and Chlorate Reductase in the Presence of Oxygen and/or Chlorate as the Terminal Electron Acceptor in Ideonella dechloratans. Appl. Environ. Microbiol. (2012) 78(12): 4380-4385 [13]Bradley S. Ferguson et al. Impact of Reference Gene Selection for Target Gene Normalization on Experimental Outcome Using Real-Time qrt-pcr in Adipocytes. (2010) 5 (12): 1-10 20

Bilaga 1 Recept PC-medium: 5 g trypton, 2,5 g jästextrakt som löstes upp i destillerat vatten till en liter med ph justering till 7,0. Anoxmediumet bestod av 100 ml 10x Anoxbas (se recept nedan) 2 ml 500x Mineral I (se recept nedan) 100 μl 104x Mineral II (se recept nedan) Som späddes till en liter med destillerat vatten 10x Anoxbas: 18 g NaAc, 2,31 g NH 4 Ac, 0,11 g CaCl 2, 0,34 g KH 2 PO 4, 0,25 g MgSO 4 x 7 H 2 O Späd till 1 liter med dh 2 O 500x Mineral I: 25 mm FeSO 4 x 7H 2 O, 25 mm MnSO 4 x H 2 O 2, 5 mm NiCl 2 x 6H 2 O, 2, 5 mm CoCl 2 x 6H 2 O 104 x Mineral II: 50 mm ZnSO 4 x 7H 2 O, 1 mm H 3 BO 4,1 mm Na 2 WO 4, 1 mm Na 2 SeO 4, 1 mm Na 2 MoO 4 Efter autoklavering av anoxmedium tillsätts 10 mm NaClO 3. 21

Bilaga 2 GGACGTAACGACGGTGGCAACCGCTTGGCATGTATTGTGACCCGCATACCTGAAAGGGAT ACTGACCATAACCTTTCACCAAGCAGCGCAACTGTTGCGCTGCTTCATTTCAACTCGGAA TAGCTTATGAAAAAAATTCTCGTACTGGCCGCATTCGCCACCCTCTCAGTCTCATCTTTC GCGATCGACAAAGGCGTCGCGATGGCTATGGCCCAGAAAAGTGGCTGCCTCGCATGCCAT GCACTGGACAAGAAGCTGGTCGGCCCGGCCTGGAATGAAGTCGGGAAAAAATATGCGGGA AATGCCGCTGCGGCGGCCCAATTGGCAGTGAAGATCAAAAAAGGCTCCAATGGCATCTGG GGCCCAATCCCGATGCCGCCAAACGCCACGGTCAAAGACGCCGACATCAAAACAATGGTC GAGTTTGTTTTAACCCTCAAGTAAACCTGATCGGACATCCGGTCTCTTAGGCACCACTGA CTCCAATGAGCAAGTGGTGTTGCGGCACATTTTATGAAAATCTTTGGAATCGCCGGCCAC TCTGGCATGGGTAAGACCACGTTACTGGAGCGATTGGTGCCTGCCATCAGCGCGCGCGGA ATGGTCATATCCTTGCTTAAACACAGCCAYAAAAATATTGACGTAGATCGGCCTGGTAAA GAYTCATATCGTCTGCGTGAGTCCGGCTGCAAAGAAGTGCTTTTACTGGGCAACGACCGC TGGGCGTTGATGCATGAACTGCGTGGAACGCCCGAGCCTTCATTGGATTATTTGCTTGGC CGAATGCAGCATTGCGACCTAGTGTTGATTGAAGGCTTTAAGAGCGGCACCTTTCCTAAA CTTGAGGTCTGGCGGGCATCGCTTGAAAAGCCCCCGCTGGCATCGGTTTGGCCGGGCATC GTGGCAATTGCCAGTGATACGCGGTTTGTTGCGTCAGAGCAATTATTGGCGGTACCGAAC TTGGTCAAACTGGATTTGGCCGACACGGCGTCCATCGCGG Hela cytc sekvensen [cyt; GenBankID: EU768872] Kodande sekvens 127-444 I rött: primer produkt 263-415 Pilar: Primerparet 22

Bilaga 3 Figur 5. Diagram över amplifiering av cdna templat med cytc primerpar. Fluorescensen är avsatt med en logaritmisk skala. De anaeroba kurvorna når tröskelvärdet vid ca 2 cykler före det aeroba provet (det anaeroba provet når tröskelvärdet vid ca 20 och aeroba vid 22). Banden längst till höger är NTC (blankprov innehållande enbart vatten). 23