QIAamp DSP Virus Kit Handbook

1050717_SV 16.04.2008 9:13 Uhr Seite 1 November 2007 QIAamp DSP Virus Kit Handbook Version 1 Σ 50 IVD QIAamp DSP Virus Kit är ett allmänt system som använder QIAamp-teknologi för isolering och rening av virala nukleinsyror från humana plasma- eller serumprov för in vitro-diagnostiska ändamål. För in vitro-diagnostisk användning REF 60704 H B 1050717SV 11/2007 QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden, Tel: +49-2103-29-0 R1 MAT 1050717SV Sample & Assay Technologies

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 2 Varumärken: QIAGEN, QIAamp, QIAvac, MinElute (QIAGEN-koncernen); AMPLICOR HBV MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR, AMPLICOR HIV-1 MONITOR, COBAS, TaqMan (Roche-koncernen), artus, RealArt (artus GmbH), Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Registrerade namn, varumärken, etc, som används i detta dokument, även om de inte angetts som sådana, ska inte anses som oskyddade i lag. PCR-processen täcks av de amerikanska patenten 4,683,195 och 4,683,202 och motsvarande som ägs i andra stater av Hoffmann-La Roche AG. 2004 QIAGEN, alla rättigheter förbehållna.

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 3 Innehåll Kitinnehåll 4 Symboler 5 Förvaring 6 Kvalitetskontroll 6 Avsedd användning 6 Begränsningar för produktanvändning 7 Säkerhetsinformation 7 Inledning 9 Princip och utförande 10 Utrustning och reagenser som ska tillhandahållas av användaren 14 Viktiga anmärkningar 15 Viktiga moment före start 15 Förberedning av RNA 15 Förvaring av prov 16 Förberedning av reagenser och buffertar 16 Eluering av virala nukleinsyror 19 Utbyte av och kvalitet på virala nukleinsyror 19 Inställning av vakuumsystemet QIAvac 24 Plus 19 Protokoll Isolering och rening av virala nukleinsyror från plasma och serum 22 QIAGEN-distributörer 27 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 3

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 4 Kitinnehåll QIAamp DSP Virus Kit Katalognr 60704 Antal provpreparat 50 QIAamp MinElute QIAamp MinElute Columns COL 50 med Wash Tubes (WT) (2 ml) EXT Column Extenders (3 ml) COL EXT 50 ET Elution Tubes (1.5 ml) ELU TUBE 50 VC VacConnectors VAC CON 50 LT Lysis Tubes (2 ml) LYS TUBE 50 WT Wash Tubes (2 ml) WASH TUBE 50 AL Lysis Buffer* LYS BUF 33 ml AW1 Wash Buffer 1* (koncentrerad) WASH BUF 1 CON 19 ml AW2 Wash Buffer 2 (koncentrerad) WASH BUF 2 CON 13 ml AVE Elution Buffer (lila lock) ELU BUF 4 x 2 ml PS Protease Solvent QPROT SOLV 4.4 ml Carrier Carrier RNA (röda lock) CAR RNA 310 µg QP QIAGEN Protease QPROT 1 vial CD H B 1 Handbook H B 1 * Innehåller guanidinhydroklorid. Inte kompatibel med desinfektionsmedel med blekmedel. För mer information, se sid. 7. Innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Resuspensionsvolym 4,4 ml. 4 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 5 2 C 8 C Symboler Σ 50 i IVD REF LOT MAT COMP VOL i Kitet innehåller reagenser för 50 provpreparat Se information i handboken Använd före Medicinsk utrustning för in vitro-diagnostik Katalognummer Batchnummer Materialnummer Komponenter Volym Temperaturbegränsningar Laglig tillverkare Vid ankomst Viktig anmärkning Byt handskar efter protokollsteg med denna markering Öppna vid ankomst och förvara QIAamp MinElute Columns vid 2-8 C? EtOH ADD CONT LYOPH RCNS EtOH GuHCI SUBT Skriv ner aktuellt datum efter tillsats av etanol i flaskan Tillsätta Innehåller Frystorkad Rekonstituera i Etanol Guanidinhydroklorid Subtilisin Leder till QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 5

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 6 Förvaring QIAamp MinElute Columns bör förvaras vid 2-8 C vid ankomst. Alla buffertar kan förvaras i rumstemperatur (15-25 C). Frystorkad Carrier RNA kan förvaras i rumstemperatur (15-25 C) fram till utgångsdatumet. Carrier RNA kan endast lösas upp i Elution Buffer (AVE). Upplöst Carrier RNA bör omedelbart tillsättas till Lysis Buffer (AL) som beskrivet på sidan 16. Denna lösning bör förberedas färsk och är stabil vid 2-8 C i upp till 48 timmar. Oanvänd Carrier RNA löst i Elution Buffer (AVE) bör frysas ned i alikvoter vid -20 C. Frystorkad QIAGEN Protease (QP) kan förvaras i rumstemperatur (15-25 C) fram till utgångsdatumet utan prestandaförsämring. Rekonstituterad QIAGEN Protease (QP) är stabil i upp till ett år med förvaring vid 2-8 C men endast fram till utgångsdatumet. Rekonstituerad Wash Buffer 1 (AW1) och rekonstituerad Wash Buffer 2 (AW2) är stabila i ett år med förvaring i rumstemperatur (15-25 C) men endast fram till utgångsdatumet. Kvalitetskontroll I enlighet med QIAGENs certifierade totala kvalitetshanteringssystem testas varje batch QIAamp DSP Virus Kit mot förbestämda specifikationer för att garantera konsekvent produktkvalitet. Avsedd användning QIAamp DSP Virus Kit är ett allmänt system som använder QIAamp-teknologi för isolering och rening av virala nukleinsyror från humana plasma- eller serumprov för in vitro-diagnostiska ändamål. Ett diagnostiskt resultat genererat med provförberedningsmetoden tillsammans med en efterföljande diagnostisk NAT-analys bör tolkas med hänsyn tagen till andra kliniska undersökningar och laboratorieundersökningar. Produkten är avsedd för användning av professionella användare som laboratoriepersonal och läkare utbildade i molekylärbiologiska tekniker. Den är utformad för användning med efterföljande applikation som använder enzymatisk amplifiering eller annan enzymatisk modifiering av DNA eller RNA följt av signaldetektion eller amplifiering. De isolerade och renade virala nukleinsyrorna kan användas i kvalitativa (t.ex blodundersökning) liksom kvantitativa (t.ex. viral belastningsundersökning) diagnostiska NAT-analyser. För att minimera oregelbundenheter i diagnostiska resultat är produkten avsedd att användas med en intern kontroll såväl som positiva och negativa kontroller genom hela provförberedningsprocessen och provamplifiering och detektion i enlighet med den efterföljande analys som används. Produkten är utformad för användning med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus eller motsvarande vakuumsystem. 6 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 7 Begränsningar för produktanvändning Kitet ska inte användas med blod, vävnad, benmärg eller odlade celler. Kitet är inte heller till för isolering och rening av nukleinsyror i bakterier, svampar eller parasiter. Kitets prestanda vid isolering och rening av virala nukleinsyror från andra cellfria kroppsvätskor som urin och CSF har inte utvärderats. Säkerhetsinformation Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt materialsäkerhetsdatablad (MSDS) för mer information. Dessa finns online i behändigt och kompakt pdf-format på hemsidan www.qiagen.com/ts/msds.asp där man kan hitta, titta på och skriva ut MSDS för varje QIAGEN-kit och kitkomponent. VARNING: Tilsätt INTE blekmedel eller sura lösningar direkt till provprepareringsavfall. Lysis Buffer (AL) och Wash Buffer 1 (AW1) innehåller guanidinhydroklorid som kan bilda mycket reaktiva föreningar i kombination med blekmedel. Om vätska med dessa buffertar spills ut ska den torkas upp med lämpliga laboratorierengöringsmedel och vatten. Om den spillda vätskan innehåller potentiellt smittsamma ämnen ska ytorna först rengöras med laboratorierengöringsmedel och vatten och därefter med 1 % (v/v) natriumhypoklorit. Om buffertflaskorna är skadade eller läcker ska man använda handskar och skyddsglasögon när flaskorna kastas för att undvika personlig skada eller skada på andra. QIAGEN har inte testat det flytande avfall som genereras av metoden med QIAamp DSP Virus för smittsamma restmaterial. Kontamination av det flytande avfallet med smittsamma restmaterial är mycket osannolikt men kan inte fullständigt uteslutas. Därför måste det flytande avfallet anses vara smittsamt och ska hanteras och kastas i enlighet med lokala säkerhetsbestämmelser. QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 7

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 8 Följande risk- och säkerhetsfraser tillämpas på komponenterna i QIAamp DSP Virus Kit: Lysis Buffer (AL) och Wash Buffer 1 (AW1) Innehåller guanidinhydroklorid: hälsoskadlig, irriterande. Risk- och säkerhetsfraser:* R22-36/38, S13-26-36-46 QIAGEN Protease (QP) Innehåller subtilisin (från Bacillus subtilis): sensibiliserande, irriterande. Risk- och säkerhetsfraser:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46 24-timmars nödsituationsinformation Medicinsk nödsituationsinformation på engelska, franska och tyska kan erhållas 24 timmar om dygnet från: Giftinformationscentral Mainz, Tyskland Tel: +49-6131-19240 * R22: Hälsoskadlig vid förtäring, R36/38: Irriterande för ögon och hud, R37/38: Irriterande för andningssystem och hud, R41: Risk för allvarlig ögonskada, R42: Kan orsaka sensibilisering vid inandning, S13: Förvara ej i närheten av livsmedel, dryckesvaror och djurfoder, S22: Andas inte in damm, S24: Undvik hudkontakt, S26: I fall av ögonkontakt, spola omedelbart med mycket vatten och uppsök läkare, S36: Använd lämplig skyddsklädsel, S36/37/39: Använd lämplig skyddsklädsel, handskar och ögon/ansiktsskydd, S46: Vid förtäring, uppsök läkare omedelbart och visa denna behållare eller etikett. 8 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 9 Inledning QIAamp DSP Virus Kit använder väletablerad teknologi för samtidig isolering och rening av viralt DNA och RNA. QIAamp DSP Virus-metoden kombinerar selektiva bindningsegenskaper av ett kiseldioxidbaserat membran med minimala elueringsvolymer på 20 μl eller 60 μl. Det linjära intervallet för QIAamp DSP Virus-metoden har fastställts för HIV RNA och HBV DNA i flera efterföljande diagnostiska analyser (tabell 1, figurer 1 och 2). Tabell 1. Efterföljande diagnostiska analyser för vilka det linjära intervallet för QIAamp DSP Virus-metoden har testats Analys Realtid RT-PCR av HIV RNA Realtid PCR av HBV DNA Kit TaqMan assay och COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test TaqMan assay och COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Test Linjärt intervall för QIAamp DSP Virus-metoden med TaqMan-analyser A log result IU/ml 8 6 4 y = 1.0042x + 0.0832 2 R 2 = 0.9974 0 1 2 3 4 5 6 7 8 log input IU/ml B log result IU/ml 6 5 4 3 2 1 0 y = 0.9725x + 0.0982 R 2 = 0.9984 1 2 3 4 5 6 log input IU/ml Figur 1 Det linjära intervallet för QIAamp DSP Virus-metoden vid 60 μl elueringsvolym fastställdes med TaqMan-analyser för A HIV RNA och B HBV DNA. QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 9

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 10 Linjärt intervall för QIAamp DSP Virus-metoden med COBAS AMPLICOR MONITORtester A log result IU/ml 6 5 4 3 2 1 y = 1.0098x + 0.1234 R 2 = 0.9982 2 3 4 5 log input IU/ml B log result IU/ml 4 3 2 1 0 y = 0.8839x + 0.1718 R 2 = 0.984 1 2 3 4 5 log input IU/ml Figur 2 Det linjära intervallet för QIAamp DSP Virus-metoden vid 60 μl elueringsvolym fastställdes med COBAS AMPLICOR MONITOR-tester för A HIV RNA och B HBV DNA. Metoden är användbar för användning med plasma eller serum. Båda kan innehålla citrat eller EDTA. Prov kan antingen vara färska, frystorkade eller frysta förutsatt att de inte frysts ned och tinats upp mer än en gång. Metoden kan användas för isolering av viralt RNA och DNA från ett brett spektrum av RNA- och DNA-virus. Metoden är utformad för att undvika korskontamination mellan prover och ge säker hantering av potentiellt smittsamma prov. Metoden är mycket lämplig för samtidig bearbetning av flera prov. Virala nukleinsyror elueras i Elution Buffer (AVE) bruksfärdiga för användning vid amplifieringsreaktioner eller förvaring vid -20 C. Princip och utförande QIAamp DSP Virus-metoden utgör fyra steg: Lysering av viruspartiklar i provet Bindning av virala nukleinsyror i lysatet till membranet i en QIAamp MinElute Column Tvättning av membranet Eluering av virala nukleinsyror från membranet Metoden utförs med QIAamp MinElute Columns på en vakuum-manifold. 10 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 11 Provvolym Detektionsgränsen (DL) och kvantifieringsgränsen (QL) har fastställts i enlighet med ICH-riktlinjer 2QA och 2QB för QIAamp DSP Virus-metoden (med en provvolym från start på 500 μl och elueringsvolymer på 20 μl och 60 μl) med flera olika efterföljande diagnostiska analyser (tabeller 2 och 3). Tabell 2. Detektionsgräns för QIAamp DSP Virus-metoden Analys Elueringsvolym 95% gränsvärde artus RealArt HBV DNA 20 μl 2,31 IU/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 μl 24,31 IU/ml (n=192) AMPLICOR manual HIV RNA 60 μl 90,92 IU/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 μl 4,73 IU/ml (n=192) Tabell 3. Kvantifieringsgräns för QIAamp DSP Virus-metoden Analys QL CV TaqMan HBV DNA 5,7 IU/ml < 70% (n=88) TaqMan HIV RNA 52 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HIV RNA 100 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HBV DNA 30 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HCV RNA 700 IU/ml < 60% (n=66) Lysering av viruspartiklar Prov lyseras under denatureringsförhållanden vid förhöjda temperaturer. Lysering utförs i närvaro av QIAGEN Protease (QP) och Lysis Buffer (AL) som tillsammans garanterar inaktivering av RNaser. QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 11

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 12 Bindning av nukleinsyror till membranet i QIAamp MinElute Column För att optimera bindningen av viralt DNA och RNA till membranet i QIAamp MinElute Column tillsätts först etanol till lysaten. Varje lysat appliceras därefter till en QIAamp MinElute Column och virala nukleinsyror adsorberas på kiselgelmembranet när lysatet transporteras igenom med vakuumtryck. Avlägsnande av restkontaminanter Medan virala nukleinsyror kvarstår som bundna till membranet i QIAamp MinElute Column tvättas kontaminanter effektivt bort med hjälp av först Wash Buffer 1 (AW1), därefter Wash Buffer 2 (AW2) och sedan etanol. Eluering av rena nukleinsyror Virala nukleinsyror elueras från membranet i QIAamp MinElute Column med Elution Buffer (AVE). QIAamp MinElute Columns tillåter elueringsvolymer på 20 μl eller 60 μl. Beroende på den efterföljande analys som används kan eluat med nukleinsyror utgöra upp till 50 % av reaktionsvolymen utan inhibitoriska effekter. 12 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 13 QIAamp DSP Virus-metod Prov Lysering Läs protokollet (sida 22) noggrant före start Tillsätt 75 μl QP, 500 μl prov och 500 μl AL i LT Vortexblanda i 15 s Inkubera i 15 min (± 1 min) vid 56 C (± 1 C) Tillsätt 600 μl etanol Vortexblanda i 15 s Inkubera i 5 min (± 1 min) i rumstemperatur (15-25 C) Bindning Överför lysat till QIAamp MinElute Column med fastsatt EXT Vakuum Tvätt (AW1) Ta bort EXT innan vakuum appliceras Tillsätt 600 μl rekonstituerad AW1 Ta bort EXT Vakuum Vakuum Vakuum Tvätt (AW2) Tvätt (etanol) Tillsätt 750 μl rekonstituerad AW2 Tillsätt 750 μl etanol Eluering Rena virala nukleinsyror Torrcentrifugering Placera QIAamp MinElute Column i WT Centrifugera 1 min vid 14 000 varv/min Placera QIAamp MinElute Column i WT Inkubera 3 min vid 56 C Placera QIAamp MinElute Column i ET Tillsätt 20 μl eller 60 μl AVE Inkubera i 3 min i rumstemperatur (15-25 C) Centrifugera 1 min vid 14 000 varv/min QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 13

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 14 Utrustning och reagenser som ska tillhandahållas av användaren Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt materialsäkerhetsdatablad (MSDS) tillgängligt från produktleverantören för mer information. Etanol (96 100%) Pipetter* och pipettspetsar (det rekommenderas att pipettspetsar med aerosolbarriärer används för att undvika korskontamination) Engångshandskar Värmeblock* för lysering av prov vid 56 C (Eppendorf Thermomixer med termoblock rekommenderas för mikroprovrör på 2,0 ml ) Mikrocentrifug* Mätcylinder (50 ml) Vortexblandare QIAvac 24 Plus-vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, kat.nr 19413, QIAvac Connecting System, kat.nr 19419 och Vacuum Pump, kat.nr 84020) eller motsvarande allmänt laboratorievakuumsystem * För att garantera att prover bearbetas korrekt i QIAamp DSP Virus-metoden rekommenderas att instrument (t.ex. pipetter och värmeblock) kalibreras i enlighet med tillverkarnas rekommendationer. Detta är ingen fullständig lista över leverantörer och inkluderar därför inte alla viktiga tillverkare av biologiprodukter. Tillgängligt i mitten av 2004, se www.qiagen.com/products/accessories. 14 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 15 Viktiga anmärkningar Viktiga moment före start Kontrollera kitkomponenterna för möjlig skada efter mottagande av kitet. Om blisterförpackningar eller buffertflaskor är skadade, kontakta QIAGENs tekniska service eller den lokala distributören. I händelse av vätskespill, se Säkerhetsinformation (sida 7). Använd inte skadade kitkomponenter eftersom det kan leda till dålig kitprestanda. Använd alltid utrustning som är fri från RNas. Förvara etanol (96-100 %) på is under hela utförandet. Byt alltid pipettspetsar mellan vätskeöverföringar. Användning av pipettspetsar med aerosolbarriärer rekommenderas för att undvika korskontamination. Alla centrifugeringssteg utförs i rumstemperatur (15-25 C). Använd alltid engångshandskar och kontrollera regelbundet att de inte kontaminerats av provmaterial. Kasta handskar om de blir kontaminerade och åtminstone vid alla steg märkta med en handskesymbol. Öppna endast ett rör åt gången för att undvika korskontamination. Använd inte kitkomponenter från andra kit med kitet som för närvarande används såvida inte batchnumren är identiska. Undvik mikrobiell kontamination av kitreagenser. Arbete under laminära luftflödesförhållanden rekommenderas tills proverna har lyserats för att undvika kontamination från potentiellt smittsamma material. Detta kit bör endast användas av personal utbildad i in vitro-diagnostisk laboratoriepraxis. Proceduren ger anvisningar för bearbetning av ett enskilt plasma- eller serumprov. Upp till 24 prov kan emellertid bearbetas åt gången med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus. Förberedning av RNA Arbeta snabbt under de manuella stegen i utförandet då viralt RNA förbereds. Elution Buffer (AVE) innehåller natriumazid*, ett antimikrobiellt medel som förhindrar tillväxt av RNas-bildande organismer. Eftersom denna buffert emellertid inte innehåller RNas-nedbrytande kemikalier kommer den inte aktivt att inhibera RNaser som tillkommit vid olämplig hantering. Extrem försiktighet bör vidtagas för att undvika kontamination med RNaser då Elution Buffer (AVE) hanteras. * Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 15

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 16 Förvaring av prov Efter provtagning och centrifugering kan plasma eller serum förvaras vid 2-8 C i upp till sex timmar. För långtidsförvaring rekommenderas nedfrysning i alikvoter vid -20 C eller -80 C. Frysta plasma- eller serumprov får inte tinas upp mer än en gång. Upprepad nedfrysning-upptining leder till denaturering och fällning av proteiner, vilket resulterar i minskade virala koncentrationer och därför minskade utbyten av virala nukleinsyror. Dessutom bildas kryofällningar vid nedfrysning-upptining som täpper till membranet i QIAamp MinElute Column. Om kryofällningar är synliga bör de tas bort med centrifugering vid cirka 6 800 x g i tre minuter. Den klargjorda supernatanten bör aspireras och bearbetas omedelbart utan att pelleten vidrörs. Förberedning av reagenser och buffertar Förberedning av QIAGEN Protease Tillsätt hela innehållet i en vial med 4,4 ml Protease Solvent (PS) till vialen med frystorkat QIAGEN Protease (QP) och blanda noggrant. Blanda genom att vända vialen upp och ned flera gånger och undvik bubblor. Se till att QIAGEN Protease (QP) är fullständigt upplöst. i Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till Lysis Buffer (AL). Tillsats av Carrier RNA och intern kontroll till Lysis Buffer Carrier RNA fyller två funktioner. För det första förstärker den bindningen av virala nukleinsyror till membranet i QIAamp MinElute Column, särskilt om det finns mycket få målmolekyler i provet. För det andra minskar en tillsats av Carrier RNA risken för nedbrytning av viralt RNA i den sällsynta händelse då RNas-molekyler inte denatureras av proteinnedbrytande salter och rengöringsmedel i Lysis Buffer (AL). Om Carrier RNA inte tillsätts till Lysis Buffer (AL) kan detta leda till minskat utbyte av viralt RNA eller DNA. Carrier RNA kan också ingå i vissa interna kontrollreagenser för kommersiella efterföljande analyser. I dessa fall, se relevanta bruksanvisningar från tillverkaren av den efterföljande analysen. Användning av en intern kontroll rekommenderas särskilt när QIAamp DSP Virus Kit används tillsammans med diagnostiska amplifieringssystem. Internt kontroll-rna eller DNA och rekonstituerad Carrier RNA bör tillsättas till Lysis Buffer (AL) och blandas noggrant genom att vända upp och ned på röret tio gånger. Vortexblanda inte för att undvika bubbelbildning. Se tillverkarens anvisningar för att bestämma optimal koncentration av intern kontroll. Användning av en annan koncentration än den som rekommenderas kan resultera i inkorrekta resultat. När korrekt mängd intern kontroll beräknas ska man ta hänsyn till startvolymen av provet och elueringsvolymen. Kom ihåg att QIAamp DSP Virus Kit använder en startprovvolym på 500 μl. 16 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 17 För att förbereda en lösning av Carrier RNA ska man tillsätta 310 μl Elution Buffer (AVE) till röret med 310 μg frystorkad Carrier RNA för att erhålla en lösning på 1 μg/μl. Lös upp Carrier RNA noggrant, dela upp den i lämpliga alikvoter och förvara vid -20 C. Frys inte ned och tina upp alikvoter av Carrier RNA mer än två gånger. Observera att Carrier RNA inte löses upp i Lysis Buffer (AL). Den måste först lösas upp i Elution Buffer (AVE) och därefter tillsättas till Lysis Buffer (AL). Se till att Carrier RNA fullständigt löses upp i korrekt volym av Elution Buffer (AVE) innan den blandas med Lysis Buffer (AL). i Använd alltid korrekt intern kontroll för den efterföljande analysen. Se tillverkarnas anvisningar för vidare information. Beräkna volymen av blandningen Lysis Buffer (AL)/Carrier RNA som behövs per provbatch genom att välja antalet prov som ska bearbetas samtidigt från tabell 4 (sida 18). Volymer beräknas med följande provberäkning: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 μl/ml = z μl där: n = antalet prov som ska bearbetas samtidigt y = beräknad volym av Lysis Buffer (AL) z = volym av Carrier RNA/Elution Buffer (AVE) att tillsätta till Lysis Buffer (AL) QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 17

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 18 Tabell 4. Volymer av Lysis Buffer (AL) och Carrier RNA/Elution Buffer (AVE) som krävs för QIAamp DSP Virus-metoden Antal Vol. AL Vol. Carrier Antal Vol. AL Vol. Carrier prov (ml) RNA/AVE (μl) prov (ml) RNA/AVE (μl) 1 0,55 6,2 13 7,15 80,0 2 1,10 12,3 14 7,70 86,0 3 1,65 18,5 15 8,25 92,4 4 2,20 24,6 16 8,80 98,6 5 2,75 30,8 17 9,35 104,7 6 3,30 37,0 18 9,90 110,9 7 3,85 43,1 19 10,45 117,0 8 4,40 49,3 20 11,00 123,2 9 4,95 55,0 21 11,55 129,4 10 5,50 61,6 22 12,10 135,5 11 6,05 67,8 23 12,65 141,7 12 6,60 73,9 24 13,20 147,8 Förberedning av Wash Buffer 1 Använd en mätcylinder och tillsätt 25 ml etanol (96-100 %) till flaskan med 19 ml koncentrat av Wash Buffer 1 (AW1). Förvara den rekonstituerade Wash Buffer 1 (AW1) i rumstemperatur (15-25 C). i Blanda alltid den rekonstituerade Wash Buffer 1 (AW1) genom att vända upp och ned på flaskan flera gånger före start. Förberedning av Wash Buffer 2 Använd en mätcylinder och tillsätt 30 ml etanol (96-100 %) till flaskan med 13 ml koncentrat av Wash Buffer 2 (AW2). Förvara den rekonstituerade Wash Buffer 2 (AW2) i rumstemperatur (15-25 C). i Blanda alltid den rekonstituerade Wash Buffer 2 (AW2) genom att vända upp och ned på flaskan flera gånger före start. Förberedning av Elution Buffer Fyra rör med Elution Buffer (AVE) tillhandahålls i kitet. Var noga med att inte kontaminera bufferten med RNaser. Om fyra reningsutföranden eller mindre utförs med ett enda kit rekommenderas det att röret med Elution Buffer (AVE) kastas i slutet av varje utförande. 18 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 19 Eluering av virala nukleinsyror För efterföljande applikationer som kräver små startvolymer (t.ex vissa PCR- och RT-PCR-analyser) kan användning av virala nukleinsyror eluerade i 20 μl Elution Buffer (AVE) öka analyssensitiviteten. Volymen av virala nukleinsyror eluerade från en QIAamp MinElute Column kan vara upp till 5 μl mindre än volymen av Elution Buffer (AVE) som applicerats till kolonnen. Till exempel kan eluering av virala nukleinsyror med 60 μl Elution Buffer (AVE) leda till ett eluat på cirka 55 μl medan eluering med 20 μl resulterar i cirka 15 μl eluat. Utbytesvolymen av eluatet beror på provets natur. Om volymen av eluatet är för låg för den efterföljande analysen kan volymen ökas med tillsats av Elution Buffer (AVE). Eluerade virala nukleinsyror samlas in i Elution Tubes (ET). Om virala nukleinsyror förvaras i upp till 24 timmar rekommenderas förvaring vid 2-8 C. Utbyte av och kvalitet på virala nukleinsyror Utbytet av och kvalitet på isolerade virala nukleinsyror är lämpliga för alla typer av efterföljande detektionsmetoder i molekylär diagnostik. Diagnostiska analyser bör utföras i enlighet med tillverkarnas anvisningar. Inställning av vakuumsystemet QIAvac 24 Plus Se till att Column Extender (EXT), QIAamp MinElute Column, VacConnector (VC) och VacValve ställs in korrekt (se figur 3). Figur 3 Montering av komponenterna i QIAamp DSP Virus Kit för vakuumbearbetning av prov: 4 3 2 1 1: VacValve (tillhandahålls med vakuumsystemet) 3: QIAamp MinElute Column 2: VacConnector (VC) 4: Column Extender (EXT) QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 19

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 20 Vid användning av vakuumsystemet QIAvac 24 Plus rekommenderas märkning av Lysis Tubes (LT), Elution Tubes (ET) och QIAamp MinElute Columns i enlighet med schemat i figur 4 för att undvika sammanblandning av prov. Detta schema kan kopieras och märkas med provnamn. 01 02 03 04 05 06 13 14 15 16 17 18 20 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 21 Datum: Operatör: Kör-ID: 07 08 09 10 11 12 19 20 21 22 23 24 Figur 4 Märkningsschema för Lysis Tubes (LT), Elution Tubes (ET) och QIAamp MinElute Columns för användning med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus. QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 21

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 22 Protokoll Protokoll: Isolering och rening av virala nukleinsyror från plasma och serum För isolering och rening av virala nukleinsyror från 500 μl EDTA-behandlad eller citratbehandlad plasma och serum. Saker som ska utföras före start Låt blodprov komma i jämvikt till rumstemperatur (15-25 C) och se till att de är välblandade. Tillsätt Carrier RNA som rekonstituerats i Elution Buffer (AVE) eller intern kontroll till Lysis Buffer (AL) i enlighet med anvisningarna på sidan 16. Se till att Wash Buffer 1 (AW1), Wash Buffer 2 (AW2) och QIAGEN Protease (QP) har förberetts i enlighet med anvisningarna i Viktiga anmärkningar på sidan 15. Låt Elution Buffer (AVE) komma i jämvikt i rumstemperatur (15-25 C) för användning i steg 18. Om det är möjligt ska färsk Elution Buffer (AVE) användas för varje utförande (fyra rör tillhandahålls). Ställ in ett värmeblock på 56 C för användning i steg 4 och 17. För in en VacConnector (VC) i varje lueradapter i vakuumsystemet för att undvika korskontamination. Se till att avfallsflaskan för vakuumsystemet är tom och att alla anslutningar är korrekta. Se den medföljande handboken för detaljer om vakuumsystemets funktion, särskilt underhåll. Utförande 1. Pipettera 75 μl QIAGEN Protease (QP) i ett Lysis Tube (LT). i Kontrollera utgångsdatumet för det rekonstituerade proteaset före användning. 2. Tillsätt 500 μl plasma eller serum till Lysis Tube (LT). 3. Tillsätt 500 μl Lysis Buffer (AL) (med 11,2 μg/ml Carrier RNA) till Lysis Tube (LT), stäng locket och blanda med pulserande vortexblandning i 15 s. För att garantera effektiv lysering är det viktigt att provet och Lysis Buffer (AL) blandas noggrant för att ge en homogen lösning. i Lysis Buffer (AL) innehåller intern kontroll. Se till att korrekt volym av Lysis Buffer (AL) tillsätts genom försiktig pipettering eller genom användning av en lämplig pipett som Eppendorfs flerstegspipett eller motsvarande eftersom Lysis Buffer (AL) har hög viskositet. i Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till Lysis Buffer (AL). 4. Inkubera vid 56 C (± 1 C) i 15 min (± 1 min). 22 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 23 5. Centrifugera Lysis Tube (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 6. Byt handskar och öppna Lysis Tube (LT) försiktigt. 7. Tillsätt 600 μl etanol (96-100 %) till Lysis Tube (LT), stäng locket och blanda noggrant med pulserande vortexblandning i 15 s. Inkubera i 5 min (± 1 min) i rumstemperatur (15-25 C). 8. Centrifugera Lysis Tube (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 9. För in QIAamp MinElute Column i VacConnector (VC) på vakuumsystemet (se figur 3, sida 19). För in kolonnförlängaren (EXT) i den öppna QIAamp MinElute Column. Protokoll i Behåll Wash Tube (WT) för torrcentrifugeringen i steg 16. 10. Byt handskar och öppna endast ett rör åt gången. 11. Applicera försiktigt hela lysatet från steg 7 i kolonnförlängaren (EXT) på QIAamp MinElute Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp MinElute Column med pipettspetsen. 12. Sätt igång vakuumpumpen. Efter att lysatet har transporterats igenom QIAamp MinElute Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. Om flera QIAamp MinElute Columns bearbetas på samma gång rekommenderas att VacValve för varje kolonn stängs efter att lysatet har passerat för att minska tiden för detta vakuumsteg. i Om lysatet inte fullständigt har passerat genom membranet efter 15 min, kasta QIAamp MinElute Column och upprepa utförandet med ett nytt prov. i Vakuumsystemets ventil bör användas för snabb utjämning av vakuumtrycket. 13. Applicera 600 μl Wash Buffer 1 (AW1) till QIAamp MinElute Column. Ta försiktigt bort och kasta kolonnförlängaren (EXT) och stäng ventilen för vakuumsystemet. Efter att Wash Buffer 1 (AW1) har transporterats igenom QIAamp MinElute Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. i Se till att kolonnförlängare (EXT) inte passerar över närliggande QIAamp MinElute Columns vid borttagandet för att undvika korskontamination. 14. Applicera 750 μl Wash Buffer 2 (AW2) till QIAamp MinElute Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp MinElute Column med pipettspetsen. Låt kolonnens lock vara öppet och stäng ventilen på vakuumsystemet. Efter att Wash Buffer 2 (AW2) har transporterats igenom QIAamp MinElute Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 23

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 24 Protokoll 15. Applicera 750 μl etanol (96-100 %) till QIAamp MinElute Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp MinElute Column med pipettspetsen. Låt kolonnens lock vara öppet och stäng ventilen på vakuumsystemet. Efter att etanol har transporterats igenom QIAamp MinElute Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. i Använd pipettspetsar med aerosolbarriär för att applicera etanol till QIAamp MinElute Column. 16. Stäng locket på QIAamp MinElute Column, ta bort det från vakuumsystemet och kasta VacConnector (VC). Placera QIAamp MinElute Column i Wash Tube (WT) som sparats från steg 9 och centrifugera med maximal hastighet (cirka 20 000 x g eller 14 000 varv/min) i en minut för att fullständigt torka membranet. Kasta Wash Tube (WT) med filtratet. i Uteslutning av torrcentrifugeringen kan leda till inhibering av efterföljande analys. 17. Placera QIAamp MinElute Column i ett nytt Wash Tube (WT) och inkubera med locket öppet vid 56 C i tre minuter för att avdunsta återstående vätska. 18. Placera QIAamp MinElute Column i ett rent Elution Tube (ET) och kasta Wash Tube (WT). Öppna locket till QIAamp MinElute Column försiktigt och applicera 20 eller 60 μl Elution Buffer (AVE) (beroende på efterföljande analys) till membranets centrum. Stäng locket och inkubera i rumstemperatur (15-25 C) i tre minuter. Centrifugera med maximal hastighet (cirka 20 000 x g eller 14 000 varv/min) i en minut för ett eluera virala nukleinsyror. i Följ underhållsproceduren för vakuumsystemet efter att protokollet utförts (se handboken som medföljer vakuumsystemet för mer detaljer). 24 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 25 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 25

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 26 26 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 27 QIAamp DSP Virus Kit Handbook 11/2007 27

1050717_SV 16.04.2008 9:14 Uhr Seite 28 www.qiagen.com Australia Orders 03-9840-9800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066 Austria Orders 0800/28-10-10 Fax 0800/28-10-19 Technical 0800/28-10-11 Belgium Orders 0800-79612 Fax 0800-79611 Technical 0800-79556 Canada Orders 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China Orders 021-51345678 Fax 021-51342500 Technical 021-51345678 Denmark Orders 80-885945 Fax 80-885944 Technical 80-885942 Finland Orders 0800-914416 Fax 0800-914415 Technical 0800-914413 France Orders 01-60-920-926 Fax 01-60-920-925 Technical 01-60-920-930 Offers 01-60-920-928 Germany Orders 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Technical 02103-29-12400 Hong Kong Orders 800 933 965 Fax 800 930 439 Technical 800 930 425 Ireland Orders 1800-555-049 Fax 1800-555-048 Technical 1800-555-061 Italy Orders 02-33430411 Fax 02-33430426 Technical 800-787980 Japan Telephone 03-5547-0811 Fax 03-5547-0818 Technical 03-5547-0811 Korea (South) Orders 1544 7145 Fax 1544 7146 Technical 1544 7145 Luxembourg Orders 8002-2076 Fax 8002-2073 Technical 8002-2067 The Netherlands Orders 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Technical 0800-0229602 Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712 Singapore Orders 65-67775366 Fax 65-67785177 Technical 65-67775366 Sweden Orders 020-790282 Fax 020-790582 Technical 020-798328 Switzerland Orders 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Technical 055-254-22-12 UK Orders 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Technical 01293-422-999 USA Orders 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) 1050717SV 11/2007 Sample & Assay Technologies