Glattmuskel laboration Introduktion: Syftet med laborationen är att ta reda på hur potenta alfa- antagonisterna Prazosin och Yohimbin är genom att tillsätta stigande koncentration av agonisten noradrenalin (NA) till olika koncentrationer av de två antagonisterna. Droger klassificeras olika beroende på om de aktiverar eller inte aktiverar en receptormolekyl som de binder in till. Agonist är en drog som binder in till en receptor och inducerar ett biologiskt svar. En antagonist är ett ämne som binder in till samma receptor som agonisten men utan att inducera ett svar. Förmågan en agonist har att inducera ett fysiologiskt svar i förhållande till dess koncentration benämns som drogens potens och bestäms av både affinitet och efficacy. Affinitet är styrkan av bindningsinteraktionen mellan drog och receptor, och detta begrepp gäller både för agonister och antagonister. Efficacy är hur starkt receptorn aktiveras av att drogen binder in. Efficacy gäller enbart för agonister då antagonister inte inducerar receptorsvar vid inbindning. En antagonist kan vara kompetitiv eller icke- kompetitiv. En kompetitiv antagonist binder in till samma receptor som agonisten samt till samma binding site. Den kompetitiva antagonisten konkurrerar därmed direkt med agonisten om receptormolekylerna. Genom att höja koncentrationen av agonist kan antagonistens inbindning minskas. En icke- kompetitiv antagonist påverkar samma receptor som agonisten men binder in till en annan binding site och ändrar konformationen av receptorn vilket hindrar agonisten från att binda in. Vid närvaro av en icke- kompetitiv antagonist hjälper det inte att höja koncentrationen av agonist för att få ett ökat biologiskt svar, eftersom agonist och antagonist inte tävlar direkt med varandra om samma binding site. Inbindningen av en antagonist till en receptor kan vara reversibel eller icke- reversibel. I en reversibel interaktion binder och släpper drogen från receptorn beroende på molekylernas affinitet till varandra, jämvikt mellan fri och bunden form eftersträvas. Då en irreversibel drog- receptorinteraktion sker binder molekylerna till varandra med kovalenta bindningar vilket gör att de inte kan dissociera spontant. En farmakologisk metod för att studera agonister och antagonister tillsammans är att mäta muskelkontraktion och hur den påverkas vid tillsats av olika läkemedel. I glattmuskulatur runt mesenteriska artärer finns alfa- receptorer som ger muskelkontraktion då en agonist binder in till dem. Om en antagonist till alfa- receptorerna finns närvarande kommer konkurrens om receptorerna uppstå och graden av muskelkontraktion återspeglar potensen hos agonisten och antagonisten. Vi har mätt muskelkontraktion av glattmuskulatur, i artärer från nötkreatur, i närvaro av den endogena alfa- agonisten noradrenalin tillsammans med två olika alfa- antagonister, Prazosin och Yohimbin. En kontrollkurva av noradrenalin har uppmätts och antagonisterna testades i olika koncentrationer med en stigande tillsatts av noradrenalin. Efter alla tillsatser av NA och olika koncentrationer av antagonister, tillsatte vi en kaliumlösning för att få fram den maximala kontraktionen för respektive artärpreparat. Detta för att kunna jämföra de olika preparaten utan att eventuella skillnader i kontraktionsförmåga förvränger våra resultat. Kalium har en förmåga att stimulera glattmuskulatur till maximal kontraktion, dock inte genom samma mekanismer som NA och kan därför inte kallas agonist.
Material och metod Artärpreparat (mesenterialartär från nötkreatur) Krebs bikarbonatbuffert (40 ml stam I + 20 ml stam II + 940 ml destillerat vatten + 1 g glukos, jämviktat med 5% CO 2 och 95% O 2 vid 37 C) Noradrenalin (alfa- och beta- receptoragonist med molmassan 319,3 g/mol) Prazosin (alfa1- receptorantagonist i färdig lösning 10-3 M) Yohimbin (alfa2- receptorantagonist i färdig lösning 10-3 M). Laborationen genomfördes genom att artärpreparaten sänktes ned i 30 ml av Krebs bikarbonatbuffert. Bufferten tillfördes syrgas och koldioxid kontinuerligt: 95 % syrgas och 5 % koldioxid. Detta för att förse muskeln med det syre den behöver för att kontrahera, och för att hjälpa bufferten att hålla ett lämpligt ph. I bufferten fanns även 1 g glukos, som agerade som näring till muskeln under försöken. Preparaten sträcktes upp av trådar, varav en fästes i en tensionsgivare som känner av när muskeln kontraherar, och således drog i upphängningsmekanismen. Denna givare kopplades till en förstärkare, som i sin tur kopplats till en "skrivare", så att resultaten kunde visualiseras. Ett av buffertbaden innehöll endast buffert, medan de övriga (5 st) innehöll en antagonist i någon koncentration: Prazosin i koncentrationerna 3 x 10-8 M, 10-8 M samt 10-9 M och Yohimbin i koncentrationerna 3 x 10-8 M och 10-8 M. Till samtliga bad tillsattes noradrenalin i stigande koncentration. Slutkoncentrationerna av NA blev 10-9, 3x10-9,10-8, 3x10-8, 10-7, 3x10-7, 10-6, 3x10-6, 10-5, 3x10-5, 10-4 M. Den volym av NA- lösning vi tillsatte var 30 mikroliter, vilket innebar att koncentrationen i lösningen blev tusen gånger högre än den slutliga koncentrationen i buffertbadet. Dessa spädningar framställdes genom att sätta 50 mg NA i pulverform till 15,66 ml destillerat vatten, NA- koncentration blev då 3 x 10-3 M. Denna koncentration späddes ut med Krebs buffert i förhållandet 1:100, för att få den första koncentrationen i serien. Därefter späddes 3/10 NA- lösning och 7/10 buffert, ömsom 1/3 lösning och 2/3 buffert för att få de resterande koncentrationerna i vår serie. 30 mikroliter av NA- lösningarna, i stigande ordning från den lägsta till den högsta, tillsattes i samtliga bad och preparatens svar på noradrenalinet observerades. Efter varje dos väntade vi två minuter innan vi tillsatte nästa: detta för att försäkra oss om att allt noradrenalin från föregående dos brutits ned. Preparatens eventuella kontraktioner registrerades av sensorn. För att sedan kunna jämföra våra preparat, som kan vara olika beroende på t.ex. hur djuret slaktats, bytte vi sedan ut bufferten i baden mot en speciell kaliumlösning som orsakar muskelkontraktion via en annan mekanism än de adrenerga receptorerna. Detta gjorde att vi kunde ta reda på hur nära sitt absoluta kontraktionsmaximum varje preparat låg, vilket gjorde att vi kunde kompensera för preparatens eventuella skillnader gentemot varandra. Resultaten sammanställdes sedan i en dos- effekt kurva med logaritmerad koncentrationsskala på x- axeln och kontraktiliteten i procent på y- axeln.
Resultat: Tabell 1: Kontrollkurva för noradrenalin. Kontraktionsmaximum 7,5 g = 100 %. Koncentration (mol/l) Log(koncentration) (gram) 10-9 - 9, 0 0 3 10-9 - 8,52 0 0 10-8 - 8 0 0 3 10-8 - 7,52 0 0 10-7 - 7 0 0 3 10-7 - 6,52 0,2 2,67 10-6 - 6 3,1 41,33 3 10-6 - 5,52 3,8 50,67 10-5 - 5 3,5 46,70 3 10-5 - 4,52 4,5 60 10-4 - 4 5 66,67 Tabell 2: Prazosin antagonist koncentration 10-9 mol/liter. Kontraktionsmaximum 3,0 g = 100 %. Tabellen visar inte koncentrationerna som inte gav någon respons. Noradrenalin koncentration (gram) 3 10-7 0,1 3,33 10-6 0,5 50 3 10-6 2,0 66,67 10-5 1,5 50 3 10-5 2,0 66,67 10-4 2,5 83,33
Tabell 3: Prazosin koncentration 10-8 mol/liter. Kontraktionsmaximum 3,5 g =100 %. Tabellen visar inte koncentrationerna som inte gav någon respons. Noradrenalin koncentration (gram) 10-6 0,1 2,89 3 10-6 2,1 60 10-5 2,2 62,86 3 10-5 3,2 91,43 10-4 3,6 102,86 Tabell 4: Prazosin koncentration 3 10-8. Kontraktionsmaximum 12,0 g = 100 %. Tabellen visar inte koncentrationerna som inte gav någon respons. Noradrenalin koncentration (gram) 10-6 0,1 0,83 3 10-6 0,2 1,67 10-5 3,1 25,83 3 10-5 6,0 50 10-4 8,5 70,83 Tabell 5: Yohimbin koncentration 10-8 mol/liter. Kontraktionsmaximum 9,5 gram = 100 %. Tabellen visar inte koncentrationerna som inte gav någon respons. Noradrenalin koncentration (mol/liter) (gram) 10-7 0,1 1 3 10-7 0,4 4,21 10-6 4 42,11 3 10-6 6 63,16 10-5 5,5 57,89 3 10-5 7 73,68 10-4 7,5 78,95
Tabell 6: Yohimbin koncentration 3 10-8 mol/liter. Kontraktionsmaximum 8,0 g = 100%. Tabellen visar inte koncentrationerna som inte gav någon respons. Noradrenalin koncentration (mol/liter) (gram) 3 10-7 0,2 2,5 10-6 3 37,5 3 10-6 4,8 60 10-5 5,5 68,75 3 10-5 6 75 10-4 6,5 81,25 Diagram 1: Dos respons kurva för agonist och antagonist.
Diskussion och felkällor: Dos- respons kurvan ger möjlighet att göra en bedömning gällande den maximala effekten av ett läkemedel samt vad som krävs för att ge 50 % av maximal effekt, EC50- värde. Både maximal effekt och EC- 50 värdet är användbara för att kunna jämföra olika läkemedel med kvalitativt liknande effekter. Vi har inte tagit fram något EC- 50 värde då kurvorna i diagram 1 aldrig nådde platåvärde. Vi kan därmed inte vara säkra på att den maximala kontraktionen som vi uppmätte verkligen är den sanna maximala kontraktionen. Vid tillsats av noradrenalin 10-4 mol/liter till prazosin 10-8 mol/liter fick vi kontraktilitetssvaret 102,86 %. Kalium, som agerar via ett annat system än de adrenerga receptorerna ska i normalfallet åstadkomma en större kontraktion än de adrenerga receptorerna. Varför detta inte skedde i vårt fall är oklart, den troliga förklaringen är att något fel uppstått på vår utrustning, så att mätsvaren blivit felaktiga. Eftersom noradrenalin är den enda agonisten som testades i laborationen tillsammans med två antagonister, Yohimbin och Prazosin, borde kontrollkurvan för NA ha gett störst kontraktionsmaximum. Vårt försök illustrerar dock inte det och detta kan bero på olika felkällor. Kurvorna för antagonisterna kan trots det jämföras sinsemellan för att illustrera vilken antagonist och i vilken koncentration som är mest potent.