Slutrapport till SLF för projektnr: Madeleine Magnusson Anders Christiansson Birgitta Svensson Christina Kolstrup

Rapport nr 7006-P Avtorkningsrutiner i mjölkstallet: Hur minimeras risken för kvalitetsfel i mejeriprodukter orsakade av klostridie- och Bacillus cereus-sporer i leverantörsmjölk? Slutrapport till SLF för projektnr: 0030009 Madeleine Magnusson Anders Christiansson Birgitta Svensson Christina Kolstrup 2002-06-30 Sveriges Lantbruksuniversitet (SLU) Svensk Mjölk Institutionen för jordbrukets Forskning biosystem och teknologi (JBT) Scheelevägen 18 Box 59 223 63 Lund 230 53 Alnarp

INNEHÅLLSFÖRTECKNING SAMMANFATTNING 3 INLEDNING 4 Bakgrund 4 Juveravtorkningens effekt på bakterier och sporer i mjölk 5 Vegetativa bakterier 5 Sporer 6 Kunskapsbehov 7 MÅLSÄTTNING OCH SYFTE 7 MATERIAL OCH METODER 8 Avtorkningsförsök 8 Djurmaterial och skötsel 8 Delförsök 1: Olika sorters juverdukars avtorkningseffekt 8 Delförsök 2: Olika avtorkningsmetoders avtorkningseffekt 9 Delförsök 3: Avtorkningens effekt på spenar förorenade med olika sportyper, olika sorters smuts och i varierande föroreningsgrad 10 Kontaminering av spenar 11 Provtagning 12 Tvättförsök 13 Delförsök A 13 Delförsök B 13 Uppodling av klostridie- och B. cereus-sporer 14 Analyser 14 Statistiska metoder 15 RESULTAT 16 Avtorkningsförsök 16 Delförsök 1 16 Delförsök 2 16 Delförsök 3 17 Tvättförsök 19 Delförsök A 19 Delförsök B 19 DISKUSSION 20 SLUTSATSER 21 FORTSATTA FORSKNINGSINSATSER 22 REFERENSER 22 PUBLICERADE ARBETEN OCH INFORMATION OM PROJEKTET 24 2

SAMMANFATTNING De sporbildande bakterierna, klostridier och Bacillus cereus, orsakar allvarliga produktfel i ost (klostridier) och i konsumtionsmjölk (B. cereus). Sporerna hamnar i mjölken om kons spenar förorenas av sporbemängd gödsel, jord eller strömaterial. Rengöring av spenar är den sista möjligheten i mjölkproduktionen att förhindra att mjölken kontamineras med sporer. För att minimera överföringen av sporer till mjölken, från gödsel-, jord- eller strörester med mycket höga sporhalter på spenarna, är det viktigt att använda bästa möjliga avtorkningsteknik. Syftet med detta projekt var att finna effektiva avtorkningsmetoder i samband med mjölkningen som leder till att mjölkproducenterna kan leverera en mjölkråvara som uppfyller mejeriindustrins krav med avseende på låga klostridie- och B. cereus- sporhalter i mjölken. Utvärdering av olika avtorkningsmaterial och avtorkningsmetoders effekt på att reducera sporhalten i leverantörsmjölken då spenarna var förorenade med höga halter av sporer studerades i två försök. Kornas spenar förorenades aktivt före mjölkning genom att doppas i en gödsel-vatten-blandning innehållande höga halter av Clostridium tyrobutyricum-sporer. Avtorkning med olika torra och fuktiga juverdukar studerades liksom olika typer av kombineringsmetoder med tvål eller där två dukar användes. Resultaten visade att den signifikant bästa och mest effektiva avtorkningsmetoden var en fuktig avtorkning med eller utan tvål följt av en torr avtorkning under 10+10s. Dessutom visade det sig att fuktig avtorkning oftast var bättre än torr, att längre avtorkningstid hade god effekt (20s 10s), att användning av två dukar gav bättre resultat än en duk under samma tid (20s), och att det inte är nödvändigt att använda tvål för att uppnå goda avtorkningsresultat. För att undersöka om sportyp, smuts sort eller spenarnas föroreningsgrad påverkade avtorkningens effekt genomfördes ett försök där kornas spenar förorenades med olika kontamineringsblandningar innehållande olika sorters och olika mycket smuts (gödsel, mycket gödsel, jord eller sågspån) samt olika sportyper (klostridier och/eller B. cereus). Resultaten visade att avtorkningen var lika effektiv oberoende av smuts sort, sportyp eller föroreningsgrad. I två tvättförsök studerades om maskintvätt och handtvätt av tvättbara juverdukar var tillräckligt effektiva för att tvätta bort sporer ur dukar som används på spenar med hög sporbelastning. Det visade sig att både maskintvätt och en noggrann handtvätt tycks vara tillräckligt effektiva. Maskintvätt är dock att föredrag eftersom det finns större risk för slarv vid handtvätt. I besättningar med sporproblem bör en fuktig avtorkning följd av en torr avtorkning rekommenderas. Men även vid denna avtorkning elimineras dock ej sporerna till 100 %. Därför är det viktigt att vidta hygienåtgärder i alla led inom mjölkproduktionen. Bås och gångar skall hållas rena så att inte juver och spenar förorenas. Nedsmutsning av drivningsvägar och vid vattenkoppar måste minimeras vid betesdrift. Allra viktigast för att förhindra klostridiekontamination är att ensilaget har god kvalitet. Metoden att aktivt kontaminera spenarna med Clostridium tyrobutyricum-sporer före avtorkning visade sig vara en bra praktisk metod för att utvärdera olika avtorkningsmetoders effektivitet. 3

INLEDNING Bakgrund De sporbildande bakterierna, klostridierna och Bacillus cereus, orsakar de allvarligaste leverantörmjölksbetingade bakteriologiska produktfelen i svenska mejeriprodukter. Till skillnad från andra bakterietyper är sporer från dessa organismer omöjliga att avdöda vid mjölkens pastörisering. Sporerna finns därför med i mjölken vid produkttillverkningen och beroende på sportyp kan de ge kvalitetsfel i ost (klostridiesporer) eller konsumtionsmjölk (B. cereus). Ostkvaliteten försämras p.g.a. smörsyra- och gasbildning, vilket ger uppsvällda ostar med söndertrasade pipor och kraftiga smakfel. Detta är inte hälsofarligt för konsumenterna men ostens kvalitet blir försämrad och ostarnas försäljningsvärde minskar avsevärt. Bacillus cereus är en potentiell matförgiftningsbakterie som kan tillväxa under den pastöriserade mjölkens kylförvaring. För att klara de riktvärden för B. cereus, som Statens Livsmedelsverk sätter upp och som inte bör överstigas vid framstämplingstidens slut, måste B. cereussporhalten i leverantörmjölken hållas låg. Detta gäller i synnerhet under sommaren när kornas juver exponeras för jord som kan innehålla höga sporhalter, men även i vissa stallsystem vintertid. Den förhöjda halten B. cereus-sporer under betessäsongen medför att mejeriföretagen måste stämpla ned bäst före-dagen på förpackningarna med åtminstone ett dygn. Detta medför att konsumenten upplever att hållbarheten är lägre, vilket kan minska köpbenägenheten. Samtidigt försvårar nedstämplingen mejeriföretagens möjligheter att på ett tillfredsställande och lönsamt sätt betjäna alla sina kunder, eftersom logistiken måste anpassas till framstämplingen. Klostridiehalten i mjölken är starkt kopplad till ensilagekvaliteten och avdrag för höga klostridiehalter kan vissa år drabba många lantbrukare, detta trots rådgivning och information om vikten av att göra ett bra ensilage. Då det gäller konsumtionsmjölk har flera mejeriföretag noterat att resultaten av B. cereus-sporanalysen i leverantörmjölkbedömningen inte alltid avspeglar de hållbarhetsproblem man har under sommaren. Detta tycks till stor del beror på att analysmetodens känslighet i sin nuvarande form är för låg. Man kan konstatera att den mjölk som levereras till mejerierna inte alltid är optimal för produktion av konsumtionsmjölk och ost. Det är från mejeriernas och mjölkleverantörernas synpunkt viktigt att kunna framhäva den svenska mjölkråvarans goda kvalitet för att kunna behålla konsumenternas förtroende och mjölkens profil som ett bra livsmedel i en allt hårdare marknadskonkurrens. Konsumtionsmjölken är mejeriföretagens lönsammaste produkt och alla faktorer som kan leda till minskad konsumtion måste minimeras. Sedan EU-inträdet har ostimporten ökat, och därigenom konkurrensen på marknaden, vilket understryker behovet att kunna producera ost av hög och jämn kvalitet. Det är ett faktum att tiden för skötselåtgärder inklusive mjölkning i dag är betydligt kortare per ko i större besättningar än i mindre. Detta leder till en risk att hygienen kan komma att eftersättas och att därmed mjölkkvaliteten försämras. Hygienåtgärderna kring kon utgör en integrerad kedja från foder och båspalls-hygien till avtorkningsrutiner i samband med mjölkning. Det är viktigt att vidtaga hygienåtgärder i alla led, men spenarnas rengöring är det sista momentet där kontamination av mjölken med klostridie- och Bacillus cereus-sporer från omgivningen kan minimeras. En situation som tydliggör detta är när ensilaget, trots ansträngningar, har misslyckats. För att minimera överföringen av klostridiesporer till mjölken, från gödselrester med mycket höga sporhalter på spenarna, är det då viktigt att 4

använda bästa möjliga avtorkningsteknik, men kunskap om optimala metoder och hur stor sporreduktion som kan erhållas med rimliga insatser saknas. Juveravtorkningens effekt på bakterier och sporer i mjölk. Mjölken som lämnar kons juver är praktiskt taget steril. De första bakterierna hamnar i mjölken i samband med passagen genom spenkanalens yttre delar och när den kommer i kontakt med spenhudens mikroflora i samband med mjölkning. Denna bakterieflora är annorlunda än den som kon möter i omgivningen (1). Mikroorganismer som kontaminerar spenarna utifrån och som inte avlägsnas genom rengöring kommer att hamna i mjölken. Bakterier som sitter kvar avlägsnas till stor del (storleksordning 80%) från spenarna genom tvättverkan av mjölken i samband med mjölkningen (2). Eftersom rengöring av spenarna före mjölkning är det enda sättet att eliminera detta är det viktigt att rengöringen utförs effektivt. Vegetativa bakterier Flertalet systematiska undersökningar av juver- och spenavtorkningens effekt har gjorts med avseende på vegetativa bakterier, vanligen totalantalet aeroba bakterier eller koliformer. Oftast är spenarna mera kontaminerade med bakterier under stallperioden, när de kommer i kontakt med strömaterial som kan innehålla höga bakteriehalter, än under sommaren när korna är på bete (3,4). Flera författare betonar betydelsen av att ha så rena spenar som möjligt när korna ska mjölkas. Hansen visade att på gödsel-förorenade spenar fanns nästan dubbelt så många bakterier än på spenar som var synligt rena och torra (5). Kor som hade minimalt med sågspån eller halm på liggplatsen fick högre bakterietal i mjölken än kor som hade rikligt med strö (6). Flertalet undersökningar tyder på att någon form av juver- och spenrengöring, oavsett vilken, är bättre än ingen alls (6-10). I en studie under betessäsongen sågs dock ingen effekt av avtorkning med avseende på totalantalet bakterier, koliformer och streptokocker i mjölken, troligen beroende på den låga nedsmutsningsgraden, medan samma behandling gav en 40-50%-ig reduktion under stallperioden (9). Ett annat undantag rör de fall när juvret och spenarna blötts ned i samband med rengöringen utan att ha torkats torra efteråt. Detta ledde till högre totalantal bakterier i mjölken än andra rengöringsmetoder (2, 3). Sannolikt rinner smutsigt vatten ned på spenarna och förorenar mjölken. Flera undersökningar tyder på att fuktig avtorkning ger bättre resultat än torr avtorkning på totalantalet bakterier (5, 7, 11). I ovanstående undersökningar uppnåddes en reduktionsgrad på 55-80% av bakterietalet på spenarna eller i mjölken. Användning av desinfektionsmedelsindränkt papper eller duk ger en viss avdödningseffekt på vegetativa bakterier på spenytan i samband med avtorkning (5) och på förekomsten av bakterier i mjölken (4, 7, 8) men den mekaniska effekten av avtorkning är viktigare (4, 7, 8). I McKinnons försök gav hypokloritdesinfektion och torkning med torr pappersduk i genomsnitt en reduktionsgrad på 80% i mjölken jämfört med 46 % vid vattentvättning och torkning med torr duk (4). Galton (7) fann i genomsnitt följande bakterietal i mjölk: efter ingen avtorkning (11090/ml), torr avtorkning (8000/ml), fuktig avtorkning med pappersduk (6300/ml), fuktig avtorkning med efterföljande torkning (3500/ml). Ytterligare någon sänkning erhölls med desinfektionsmedelsfuktat papper följt av torr-torkning, men effekten var inte statistiskt signifikant. Enligt EU s mjölkdirektiv är dock all avtorkning eller behandling av spenar med desinfektionsmedel förbjuden före mjölkning, för att förhindra att främmande substanser hamnar i mjölken. 5

Få studier har gjorts över effekten av olika lång avtorkningstid. 5 sekunders avtorkning med torr pappersduk gav ingen signifikant effekt medan 10-15 sekunder gav en viss reduktion av totalantalet bakterier i mjölk, men inte av koliformer (7). Däremot gav fuktig avtorkning 15 sekunder effekt på koliformer, effekten ökade ytterligare vid kombination av fuktig avtorkning följt av torr (ingen avtorkning: 18000/ml, torr: 16600, fuktig: 11600 och fuktig + torr: 4900 koliformer/ml). Ingen skillnad sågs mellan olika märken av pappersdukar med avseende på avtorkningseffekt på spenarna (7). Manuell torrtorkning var viktigare än typen av pappersduk. Högst bakteriehalt fick man om spenarna blöttes ned utan att torkas torra före påsättning. Författarna konstaterar att det är viktigt att inte blöta ner andra delar av kon än spenarna och att göra noggrann torrtorkning (7). Även McKinnon visade på betydelsen av att torka spenarna torra (6). Sporer Det finns få systematiska och noggranna undersökningar över spenavtorkningens effekter på sporer. McKinnon (6) visade att, till skillnad från vegetativa bakterier, hade hypoklorit ingen avdödande effekt på aeroba sporer på spenarna, troligen beroende på den korta exponeringstiden. Spenarna tvättades med vattenslang och torkades torra med papper. Den manuella torkningen gav en signifikant reducerad (halverad) sporhalt i mjölken jämfört med ingen torkning alls (6). För spenar som tvättades med vatten utan torkning blev sporhalten oförändrad. Vid fyra olika gårdar fann McKinnon och Pettipher (4) att det genomsnittliga antalet aeroba sporer på spenarna reducerades med mellan 28 och 89%, beroende på gård, vid kombinerad fuktig och torr avtorkning under stallperioden. Olsson (12) undersökte effekten av torr respektive fuktig avtorkning med avseende på Bacillus cereus-sporer i mjölk i ett mycket begränsat försök. Resultatet tydde på en något bättre effekt av den fuktiga avtorkningen. Ehn (13) visade på en signifikant reduktion av B. cereus-sporhalten i mjölk från enskilda kor när mycket noggrann avtorkning (uppblötning, tvätt med tvållösning samt torrtorkning) jämfördes med ingen avtorkning alls vid 10 olika gårdar. Medan hälften av mjölkproverna från kor utan avtorkning hade sporhalter som översteg 400/l, så hade endast 6% av proverna så höga sporhalter för de avtorkade korna. Sporhalten understeg 100 sporer/l i 67% av proverna från torkade kor men endast för 17% av de icke torkade korna. Almér (14) genomförde ett kontrollerat försök där 12 kor spendoppades med en sporsuspension av B. cereus i jord i ett change over-försök. Man fann att kor som avtorkats hade signifikant lägre sporhalter i mjölken än kor som inte torkats. Avtorkningseffekten gav i genomsnitt cirka 70-75% reduktion och man såg ingen effekt av urdragning. Avtorkning med fuktig bomullsduk gav något bättre (p=0,09) än avtorkning med våt pappersduk. Förklaringsgraden ökade under de tre behandlingstillfällena för varje behandling. Det fanns skillnader mellan mjölkare vad gäller avtorkningseffektiviteten, som varierade mellan 45% och 94% (13). Christiansson et al. undersökte effekten av avtorkning med torrt papper och mycket noggrann avtorkning med sprit samt efterföljande torrt papper för B. cereus-sporer (15). Jämfört med torrt papper gav den noggranna behandlingen ytterligare cirka 80% reduktion. I försöket undersöktes också sporhalten vid handmjölkning av de första 100 millilitrarna mjölk och sporhalten i den maskinmjölkade mjölken. Handmjölkad mjölk innehöll mycket mindre sporer än vid maskinmjölkning, vilket visar att sporer på spenarnas utsida lossnar till mjölken under maskinmjölkning (15). Rasmussen et al. visade, i den enda internationellt publicerade systematiska undersökningen som rör bakteriesporer, att avtorkning med fuktig bomullsduk var effektivare mot anaeroba sporer än 6

avtorkning med torr och våt pappersduk. Avtorkningstiden hade också betydelse för mjölkens innehåll av aneroba sporer (16). Christiansson et al. undersökte också effekten av spendoppning med kletigare jord och mycket hög sporhalt av B cereus (17). Härvid erhölls endast 56 % reduktion, vilket tyder på att avtorkningstekniken behöver utvecklas ytterligare. Kolstrup et al. undersökte olika avtorkningsrutiner för kor som nedsmutsats experimentellt med sågspån kontaminerad med B. cereus-sporer (18). Avtorkning med torr pappersduk och avtorkning med fuktig engångsduk (samma typ som ovan i (13)) under 10 och 25 sekunder jämfördes med ingen avtorkning. Signifikant bättre resultat erhölls (65-78% reduktion) med samtliga rutiner jämfört med ingen avtorkning alls. Det fanns en tendens (p<0,1) att fuktig avtorkning i 25 sekunder var bättre än torr i 10 sekunder. Det kunde inte påvisas någon skillnad i avtorkningsresultat mellan en erfaren och en oerfaren mjölkare som deltog. En längre avtorkningstid behöver inte nödvändigtvis innebära att arbetstiden per ko ökar. Rasmussen visade att ökad avtorkningstid medförde att mjölkflödet blev snabbare och mjölkningstiden därmed kortare (19). Kunskapsbehov Sporer anses på grund av sina hydrofoba egenskaper betydligt svårare att avlägsna än vegetativa bakterieceller. Ett antal generella råd angående avtorkning, baserade mest på forskning kring vegetativa bakterier, förekommer i rådgivningen. Dessa har delvis visat sig verksamma även mot sporer, men råden är uppenbarligen inte tillräckliga i alla lägen. Tidigare forskning, som delvis är motsägande, tyder på att det finns behov av ytterligare kunskap för att kunna rekommendera det effektivaste sättet att reducera sporer i samband med avtorkning före mjölkning, i synnerhet under förhållanden där sporkontaminationen är hög. Ökad baskunskap kring mätmetodik för rengöring av spenar bör också vara användbar vid bedömning av nya tekniska lösningar i relation till spenrengöring i robotsystem. Hypoteser som undersökts i detta projekt är: - Att olika avtorkningsmaterial och metoder har olika stor påverkan på sporhalten i mjölk vid hög sporbelastning på spenarna. - Att avtorkningseffekten skulle variera beroende på med vilken sportyp, sort av smuts eller i vilken föroreningsgrad spenarna är förorenade. - Att vid hög sporbelastning skulle sporer ackumuleras i tvättbara dukar efter många avtorkningar och tvättar. MÅLSÄTTNING OCH SYFTE Målsättningen med projektet var att finna vägar för att minska risken för klostridie och B. cereus-sporer i leverantörsmjölk, i synnerhet vid hög sporbelastning på spenarna. Syftet var att finna effektiva avtorkningsmetoder i samband med mjölkningen som leder till att mjölkproducenterna kan leverera en mjölkråvara som uppfyller mejeriindustrins krav med avseende på låga klostridie- och B. cereus-sporhalter i mjölken. 7

MATERIAL OCH METODER Projektet har genomförts i tre olika avtorkningsförsök där kornas spenar aktivt har kontaminerats med sporer före mjölkning, samt i två tvättförsök. Avtorkning Delförsök 1. Olika sorters juverdukars avtorkningseffekt. Delförsök 2. Olika avtorkningsmetoders avtorkningseffekt. Delförsök 3. Avtorkningens effekt på spenarna förorenade med olika sportyper, olika sorters smuts och i varierande föroreningsgrad. Tvättförsök Delförsök A och B. Hand- och maskintvätt rengöringseffekt på tvättbara juverdukar. Avtorkningsförsök Djurmaterial och skötsel Samtliga avtorkningsförsök har genomförts på Alnarps Mellangård med SLB-kor. Kor som ingick i försöken var i 1-4 laktationen och mjölkade vid försöksstart mellan 17 35 kg mjölk per dygn och hade inga extremt avvikande juver eller spenar. Innan korna valdes ut till försöken kontrollerades det att deras mjölk var filtrerbar, så att mjölken kunde analyseras med avseende på sporer. Vid försöksstart klipptes kornas juver. Under försöken var korna uppbundna och båspallen var försedd med gummimatta och ströddes rikligt med sågspån. Före och efter mjölkning skrapades bakre delen av båsen noggrant rena. Vid mjölkning användes 1 mjölkningsorgan per ko och varje organ används till en och samma behandling under hela försöket. Mjölkarna tvättade händerna noggrant mellan varje ko som mjölkades. Efter mjölkning torkades kornas juver/spenar noggrant av med fuktiga engångsdukar och spendopp användes. Även mjölkningsorganen och mjölkningsanläggningen tvättades noggrant efter mjölkningen och sköljdes mellan varje mjölkning med kloramin. Under de olika delförsöken var avtorkningstiden standardiserad och tiden klockades. Avtorkningstider som studerades i försöken var antingen 10 eller 20 sekunder, vilket motsvarar avtorkningstider som används i praktiken. Jakobsson (21) fann i sin undersökning att avtorkningen + mjölkurdragning ur spenar varierade mellan 7 31,7 s/ko i olika besättningar. Erfarna mjölkare mjölkade under försöken och de torkade spenar och juver som vanligt men hade fått direktiv om att aktivt torka av spenspetsarna. Totalt mjölkade 3 olika mjölkare (A, B och C) under försöken. Mjölkare A och B mjölkade i delförsök 1, mjölkare B och C i delförsök 2 och mjölkare C mjölkade i delförsök 3. Delförsök 1: Olika sorters juverdukars avtorkningseffekt För att studera avtorkningseffekten för olika juverdukar jämfördes avtorkning med olika sorters dukar under 10 s med en kontroll där ingen avtorkning skedde. Juverdukar som användes var 2 olika sorters torr pappersduk, 2 olika sorters förfuktad pappersduk och 2 olika 8

sorters förfuktad tvättbar duk. Kornas spenar kontaminerades ca 20 minuter före mjölkning med en gödsel-vatten-blandning med hög halt av klostridie-sporer. Avtorkningstiden klockades. Urdragning med två mjölkstrålar per spene skedde före påsättning av mjölkningsmaskinerna för samtliga behandlingar utom för kontrollen. Försöket var upplagt i randomiserade romerska kvadrater där 7 kor fick 7 olika sorters behandlingar (avtorkningar) vid 7 olika mjölkningstillfällen i varje romersk kvadrat. Detta upprepades i 4 olika randomiserade romerska kvadrater med 2 olika mjölkare och vid 2 olika tidpunkter (morgon- respektive kvällsmjölkning). De 7 olika behandlingarna var: 1. Kontroll: ingen avtorkning, ingen urdragning. 2. Torr avtorkning, vanlig pappershandduk, returfiber 100%, våtstyrkemedel, format 25,5 x 33 cm (10s). 3. Torr avtorkning, juverduk, tunt papper men med något grövre yta än papper i behandling 2, format 25 x 28 cm (10s). 4. Fuktig avtorkning med engångsduk, färdigfuktad tunn pappersjuverduk med 10% isopropanol-lösning, format 25 x 29 cm (10s). 5. Fuktig avtorkning med engångsduk, torrt papper, något tjockare än papper i behandling 4, format 23 x 28 cm, som fuktades före mjölkning i en dispenser med en blandning av vatten och juvertvättmedel (juvertvättmedel: < 5% etanol och 15-30% alkylbenzensulfonat) (10s). 6. Fuktig avtorkning med tvättbar duk, bomullsduk, format 35 x 36 cm (doppades i hink med vatten och vreds ur) (10s). 7. Fuktig avtorkning med tvättbar duk, syntet, format 36 x 51 cm (doppades i hink med vatten och vreds ur) (10s). De tvättbara dukarna återanvändes inte, utan en ny duk användes vid varje behandlingstillfälle. Begagnade dukar utnyttjades i tvättförsök A (se nedan). Delförsök 2: Olika avtorkningsmetoders avtorkningseffekt För att se om man kunde uppnå ännu bättre effekt vid avtorkningen än vad som erhölls i delförsök 1 studerades i delförsök 2 effekten av längre avtorkningstid och olika former av kombinationsmetoder med eller utan tvål. Bäst effekt i delförsök 1 hade behandlingarna 5, 6 och 7. Därför användes några av dessa i delförsök två och kombinerades med ytterligare avtorkning. Fuktig avtorkning + torr avtorkning (10+10s) studerades liksom längre avtorkningstid med en (20s) respektive två fuktiga pappersdukar (10+10s). Effekten av tvål studerades i olika avtorkningsrutiner: spray + torr avtorkning (10s), skumdopp + torr avtorkning (10s), fuktig avtorkning med tvål (10s) + torr avtorkning (10s). Kornas spenar kontaminerades ca 20 minuter före mjölkning med en gödsel-vatten-blandning med hög halt av klostridie-sporer. Avtorkningstiden klockades. Urdragning med två mjölkstrålar per spene skedde före påsättning av mjölkningsmaskinerna för samtliga behandlingar utom för kontrollen. Försöket var upplagt identiskt med delförsök 1 med randomiserade romerska kvadrater där 7 kor fick 7 olika sorters behandlingar (avtorkningar) vid 7 olika mjölkningstillfällen i varje romersk kvadrat. Detta upprepades i 4 olika randomiserade romersk kvadrater med 2 olika mjölkare och vid 2 olika tidpunkter (morgon- respektive kvällsmjölkning). 9

De 7 olika behandlingarna var: 8. Kontroll: ingen avtorkning, ingen urdragning. 9. Fuktig avtorkning (10s) med tvättbar syntet -duk, format 36 x 51 cm som doppades i hink med vatten och vreds ur + torr avtorkning (10s) med juverduk av tunt papper, format 25 x 28 cm. 10. Fuktig avtorkning med tvål (10s) med syntet duk, format 36 x 51cm som doppades i hink med vatten och tvållösning och vreds ur (tvållösning: non joniska tensider, komplexbildare och färg) + torr avtorkning (10s) med juverduk av tunt papper, format 25 x 28 cm. 11. Sprayar på tvållösning (innehåll: non joniska tensider, komplexbildare och färg) + väntar 30s + torr avtorkning (10 s) med juverduk, tunt papper, format 25 x 28 cm. 12. Doppar i tvålskum (innehåll: mjölksyra 1-5%, fettsyraderivat 1-5%, väteperoxid <1%, fettalkoholethersulfat <1%) + väntar 30 s + torr avtorkning med juverduk av tunt papper, format 25 x 28 cm (10s). 13. Fuktig avtorkning med två fuktiga pappersdukar (10s + 10s), torrt papper, format 23 x 28 cm, som fuktades före mjölkning i en dispenser med en blandning av vatten och juvertvättmedel (juvertvättmedel: < 5% etanol och 15-30% alkylbenzensulfonat) (10s). 14. Lång fuktig avtorkning med en engångsduk (20s), torrt papper, format 23 x 28 cm, som fuktades före mjölkning i en dispenser med en blandning av vatten och juvertvättmedel (juvertvättmedel: < 5% etanol och 15-30% alkylbenzensulfonat) De tvättbara dukarna återanvändes inte, utan en ny duk användes vid varje behandlingstillfälle. Delförsök 3: Avtorkningens effekt på spenar förorenade med olika sportyper, olika sorters smuts och med varierande föroreningsgrad. För att studera om avtorkningseffekten var lika stor oberoende av sportyp, smuts sort eller spenarnas föroreningsgradgrad kontaminerades kornas spenar med 4 olika kontamineringsblandningar och mjölkades med eller utan avtorkning (kontroll). Kontamineringsblandningarna innehöll olika typer av smuts (gödsel, jord och sågspån) och smuts i olika mängd (gödsel och mycket gödsel ). Blandningarna innehöll den sportyp som är vanligast förekommande för varje smutssort, dvs. gödsel-klostridiesporer, mycket gödsel - klostridiesporer, jord-b. cereus-sporer och sågspån- B. cereus-sporer. För att kunna studera om sportypen påverkade avtorkningseffekten blandades båda sportyperna i gödsel och i jord. Korna kontaminerades ca 20 minuter före mjölkning. Avtorkningstiden klockades. En utav de bästa avtorkningsmetodena från delförsök 2 användes, dvs behandling 9, en fuktig avtorkning med syntet -duk (10s) + torr avtorkning med en pappersduk (10 s). Urdragning med två mjölkstrålar per spene skedde före påsättning av mjölkningsmaskinerna. I behandlingen utan avtorkning (kontroll) skedde ingen urdragning. Även detta försök var upplagt i randomiserade romerska kvadrater. Här fick 8 kor 8 olika sorters behandlingar (4 olika kontamineringar med eller utan avtorkning) vid 8 olika mjölkningstillfällen i varje romersk kvadrat. Detta upprepades i 2 olika randomiserade kvadrater vid två olika tidpunkter (morgon- respektive kvällsmjölkning). 10

De 8 olika behandlingarna var: 1. Gödsel med klostridie- och B. cereus-sporer - kontroll. 2. Gödsel med klostridie- och B. cereus-sporer - avtorkning. 3. Mycket gödsel med klostridiesporer kontroll. 4. Mycket gödsel med klostridiesporer avtorkning. 5. Jord med klostridie- och B. cereus-sporer kontroll. 6. Jord med klostridie- och B. cereus-sporer avtorkning. 7. Sågspån med B. cereus-sporer kontroll. 8. Sågspån med B. cereus sporer avtorkning. Kontaminering av spenar För att studera olika avtorkningsmaterials effektivitet på att rengöra starkt förorenade spenar behövs en jämn och hög nedsmutsning. Därför kontaminerades spenarna aktivt före mjölkning genom att doppas i en smuts-blandning med hög halt av sporer, metoden har använts i tidigare försök (14, 18). Eftersom klostridiesporer inte tillväxer aerobt användes en gödsel-vatten-blandning med Clostridium tyrobutyricum-sporer i delförsök 1 och 2. Sporerna kan därför anses vara inerta och deras viabilitet påverkas inte av behandlingarna. För att studera effekten av avtorkningen på spenar kontaminerade med olika sportyper, olika smutssorter och i varierande nedsmutsningsgrad användes i delförsök 3 fyra olika kontamineringsblandningar med olika mängd och sorters smuts (gödsel, jord och sågspån) samt med både klostridie- och B. cereus-sporer. Kontamineringsblandningarna förvarades i portionsförpackningar i kyl eller frys, lagom för kontaminering vid ett mjölkningstillfälle. Till varje mjölkningstillfälle tinades en portion upp och strax före kontaminering tillsattes sporerna och blandningen skakades väl. Kornas spenar kontaminerades ca 20 minuter före mjölkning så att smutsen torkade före mjölkning. Kontamineringsblandningarna hälldes upp i en 250 ml plast burk, något vidare upptill än nertill, och spenarna doppades i blandningen. Spenarna rengjordes inte före kontaminering, men om det hängde större flagor av gödsel eller strö på spenarna plockades de bort före kontaminering. I gödselblandningarna doppades varje spene 1-2 gånger direkt efter varandra och blandningen skakades väl mellan varje ko som kontaminerades. I jordblandningen doppades varje spene 3 ggr direkt efter varandra och blandningen skakades efter det att två spenar kontaminerats. I sågspånsblandningen doppades varje spene i burken medan burken skakades under ca 10 s, blandningen skakades väl mellan varje spene som kontaminerades. Delförsök 1 I delförsök 1 användes en kontamineringsblandning bestående av 1 del autoklaverad gödsel och 3 delar vatten (vikt/vikt)+ klostridiesporer. Vilket gav en svag synbar nedsmutsning av spenarna. Gödsel och vatten portionerades upp i burkar som frystes in. Till varje mjölkningstillfälle tinades sedan en burk upp och en bestämd mängd sporer tillsattes före kontamineringen så att blandningen beräknades innehålla 180000 klostridiesporer/g. Kontamineringsblandningen hade en ts-halt på ca 3,0 %. Delförsök 2 Eftersom den naturliga sporhalten i kornas gödsel var hög under delförsök 1 (upp till 620000 sporer/g) tillsattes mer sporer till kontamineringsblandningen i delförsök 2 än i delförsök 1 så 11

att inte den naturliga nedsmutsningen skulle påverka resultaten. Samma kontamineringsblandning användes som i delförsök 1 med 1 del autoklaverad gödsel och 3 delar vatten som portionerades upp och frystes in. Men en högre halt klostridiesporer tillsattes efter upptining och före kontaminering så att blandningen beräknades innehålla 495000 klostridiesporer/g. Kontamineringsblandningen hade en ts-halt på 3,4 3,7 % Delförsök 3 I delförsök 3 användes 4 olika kontamineringsblandningar: - Gödsel: Samma sorts kontamineringsblandning användes som i delförsök 1 och 2, dvs en blandning med 1 del autoklaverad gödsel och 3 delar vatten, vilket gav en svag synbar nedsmutsning av spenarna efter kontaminering. På grund av brist på klostridiesporer och med förhoppning om att korna utfodrades med bättre ensilage än under delförsök 1 tillsattes efter upptining och före kontaminering sporer så att blandningen beräknades innehålla 184000 klostridiesporer/g och 1 120000 B. cereus sporer/g. Kontamineringsblandningen hade en ts-halt på 3,8-3,9 %. - Mycket gödsel : För att åstadkomma en högre nedsmutsningsgrad blandades 1 del autoklaverad gödsel med 1,5 delar vatten, detta gav efter kontaminering en synbart något kraftigare nedsmutsning utav spenarna än med den ovanstående tunnare blandningen. Efter nedfrysning och upptining tillsattes före kontaminering sporer så att blandningen beräknades innehålla 184000 klostridiesporer/g. Kontamineringsblandningen hade en tshalt på 5,7-5,9 %. - Jord: Blandningen innehöll 1 del jord och 1 del vatten (vikt/vikt) samt sporer Efter kontaminering syntes en något kraftigare nedsmutsning utav spenarna än med gödsel - blandningen. Jord med en ts-halt på 88,3 % vägdes upp i portionsburkar och förvarades i kylen. Före varje mjölkningstillfälle tillsattes vatten och sporer så att kontamineringsblandningen beräknades innehålla 1 100000 B. cereus sporer/g och 169000 klostridiesporer. Kontamineringsblandningen fick då en ts-halt på 44,2 %. - Sågspån: Sågspån och vatten blandades så att blandningen fick en ts-halt på 37,6 %. Efter kontaminering syntes måttliga mängder med sågspån vidhäftade på spenarna. Sågspån med ts-halten 56,6 % vägdes upp i portionspåsar och förvarades i kylen. Före varje mjölkningstillfälle tillsattes vatten och B. cereus sporer så att kontamineringsblandningen fick en ts-halt på 37,6 % och beräknades innehålla 9 000000 B. cereus sporer/g. Provtagning Mjölkningen skedde med milkmaster och provtagningen skedde med Tru-tester. Mjölkmängden för varje ko och mjölkning registrerades och mjölkprov på minst 200 ml mjölk hälldes i provburkar och frystes in i väntan på analys. För att kunna kontrollera i vilken utsträckning omgivningen kunnat påverka resultaten gjordes en del registreringar och analyser under delförsöken. Prov togs på sköljvatten från mjölkningsanläggningen dels vid försöksstart och dels vid avslutat försök. Före kontaminering bedömdes renheten visuellt på juver, spenar och spenspets enligt en 5-gradig skala (14). Under försöken togs före varje morgonmjölkning samlingsprov på gödsel från 3 kor för analys av klostridiesporer. I delförsök 3 togs också under försöket prov på rent sågspån från lager och under sista försöksdagen togs 3 samlingsprov med strömedelsprov från vardera 3 olika bås för analys av B. cereus -sporer. 12

Analyser gjordes också på kontamineringsblandningarna för att fastställa hur många sporer blandningarna innehöll. Tvättförsök Delförsök A För att få en bild över hur mycket sporer som kunde finnas kvar i dukarna efter tvätt behandlades de tvättbara dukarna (bomull och syntet ) i delförsök 1 efter avtorkning på olika sätt. Antingen tvättades de för hand, maskin eller inte alls utan användes som kontroll. Hur dukarna skulle behandlas slumpades ut men fördelades jämt beroende på mjölkare och mjölkningstidpunkt (morgon/kväll). Totalt 48 dukar analyserades i avseende på innehåll av klostridiesporer. Dukarna analyserades parvis. Dukar med samma material, mjölkare och mjölkningstidpunkt slogs ihop till ett prov och analyserades tillsammans. Kontrolldukarna torkades efter användning i rumstemperatur. Dukar som handtvättades tvättades för hand i mjölkrum. Hett vatten spolades upp i en 15 liters spann tillsammans med 0,5 dl tvättmedel (SKONA) och juverdukarna låg i blöt 10-15 minuter. De tvättades därefter för hand och sköljdes 2 gånger. Dukar som maskintvättades tvättades i ett 95-graders program i tvättmaskin (Miele Novotronic, Exclusive) med 0,5 dl tvättmedel (SKONA). Efter tvätt torkade dukarna i rumstemperatur. Efter torkning förvarades dukarna i kyl fram till analystillfället. Delförsök B I delförsök A användes juverdukarna endast 1 gång. För att studera om sporhalten i dukarna ökade vid längre användning och vid hög sporbelastning genomfördes ett tvättförsök där juverdukarna kontaminerades mellan tvättarna genom att doppas i en gödsel-vatten-blandning innehållande höga halter av sporer. En del gödsel blandades med tio delar vatten och klostridiesporer tillsattes så att blandningen beräknades innehålla 27000 klostridiesporer/g. Gödsel var inte autoklaverad och kunde alltså ytterligare bidra med sporer till blandningen. Alla dukarna doppades i samma gödsel-vatten-blandning och en ny blandning gjordes mellan varje tvätt. Juverdukarna torkade inte mellan tvättarna. De dukar som maskintvättades blev centrifugerings torra och de som handtvättades vreds ur ordentligt efter sköljning innan de doppades på nytt i kontamineringsblandningen. Både handtvätt och maskintvätt gjordes med två olika sorters tvättbara juverdukar (samma som studerades i delförsök A): Bomull = Tvättbar bomullsduk, format 35 x 36 cm. Syntet = Tvättbar duk av syntetmaterial format 36 x 51 cm. Två dukar för varje material och tvättbehandling (hand/maskin) analyserades efter 1 tvätt, 15 tvättar och 30 tvättar. Dessutom analyserades 2 dukar av varje material efter 1 kontaminering men ingen tvätt som kontrolldukar. Dukar som handtvättades lades i blöt i en 15 liters hink med hett vatten och 0,5 dl tvättmedel (NOVA 20) under ca 5 minuter därefter tvättades de för hand och sköljdes 2 gånger. Dukar som maskintvättades tvättades i ett 95-graders program i tvättmaskin (Miele Novotronic, Exclusive) med 0,5 dl tvättmedel (NOVA 20). Efter tvätt torkade dukarna i rumstemperatur. Kontrolldukarna torkades i rumstemperatur direkt efter kontaminering. Efter torkning 13

förvarades dukarna i kyl fram till analystillfället. Nova 20 (Kemikalia) är ett tvättmedel som saluförs speciellt för vittvätt och juverdukar. Uppodling av klostridie- och B. cereus-sporer till kontaminering För att skapa en kontrollerad belastning av sporer på spenarna kontaminerades spenarna med smutsblandningar innehållande höga sporhalter. Mycket höga mängder sporer behövdes härvid för att uppnå höga halter. Dessa sporer framodlades på Svensk Mjölk Forskning, Lund. Bacillus cereus-sporer odlades fram enligt tidigare beskriven metod av Christiansson et. al. (15). Clostridium tyrobutyricum odlades på ytan av RCM-agarplattor under 1-2 veckor vid 37 C i anaerob atmosfär. Sporerna skördades och tvättades som ovan för B. cereus. Analyser Mjölk och vattenprover analyserades genom filtrering (22, 23). Metoden är tidigare beskriven av Christiansson et. al. (15). En mängd på 10-100 ml mjölk filtrerades beroende på förväntad kontamineringsgrad. Dubbla analyser gjordes för varje prov. Filtren placerades på RCM platta med 100 ppm D-cykloserin och odlades anaerobt vid 37 C i 3 dygn för klostridier. För B. cereus odlades filtren på blodagarplattor (Oxoid blodagarbas no 2, 5% nötblod/citrat och 10 ppm polymyxin B-sulfat) under 2 dygn vid 20 C. Efter inkubering räknades kolonierna. Gödsel och spån analyserades efter behandling i Stomacher tillsammans med peptonvatten. 25 gram prov uppvägdes i Stomacherpåse och 225 g sterilt peptonvatten tillsattes och behandlades i 2x30 sek. Efter avslutad behandling uttogs 100 ml vätska ur påse och överfördes till en steril 100 ml mätcylinder. Provet fick stå i 2 minuter, varefter 10 ml vätska uttogs med steril pipett vid 50 ml-markeringen på mätcylindern. Vätskan överfördes till ett sterilt provrör och värmebehandlades i vattenbad vid 72 C i 10 minuter för att avdöda vegetativa bakterieceller. Därefter gjordes decimala utspädningar i spädvatten och 0,1 ml i duplikat från lämpliga spädningar överfördes genom ytspridning till RCM platta + D- cykloserin eller till blodagarplattor (Oxoid blodagarbas no 2, 5% nötblod/citrat och 10 ppm polymyxin B-sulfat). Efter inkubering som ovan räknades kolonierna. Juverdukarna analyserades efter behandling i Stomacher. En duk behandlades tillsammans med 250 g peptonvatten under 60 s i Stomacher. Vätskan från duken hälldes i ny Stomacherpåse. 2x100 ml värmebehandlades i Stomacherpåsen i 80 C under 10 min. Vätskan från de tvättade juverdukarna filtrerades enligt samma metod som mjölk och vattenprov ovan. Vätskan från kontrolldukarna späddes och från lämpliga spädningar överfördes 0,1 ml i duplikat genom ytspridning till RCM platta + D-cykloserin och till blodagarplattor (Oxoid blodagarbas no 2, 5% nötblod/citrat och 10 ppm polymyxin B-sulfat). Efter inkubering som ovan räknades kolonierna. Kontamineringsblandningarna som skulle analyseras skakades väl innan de värmebehandlades i 80 C under 10 min (klostridier) eller 72 C under 5 min (B. cereus). Därefter gjordes lämpliga spädningar varifrån 0,1 ml överfördes i duplikat genom ytspridning till RCM platta + D-cykloserin och till blodagarplattor (Oxoid blodagarbas no 2, 5% nötblod/citrat och 10 ppm polymyxin B-sulfat). Efter inkubering som ovan räknades kolonierna. 14

Statistiska metoder För statistisk bearbetning av försöksdata användes MINITAB version 12 för Windows. Logtransformerade sporhalter användes i bearbetningarna som gjordes med ANOVA och GLM. Parvisa jämförelser är gjorda med Tukey s test. Delförsök 1 och 2 För att studera effekten av olika avtorkningsmetoder användes följande modell: Y ijklm = µ+a i +b j +c k +d l +(cd) kl +t m(kl) +e ijklm Y = log 10 sporer i mjölk a = behandling (olika avtorkningsmetoder) i = 1,,7. b = ko j = 1,, 7. c = mjölkare k = 1, 2. d = tidpunkt (morgon resp. kväll) l = 1, 2. t = mjölkningstillfälle inom romersk kvadrat m = 1,., 7. e = rest. Delförsök 3 För att undersöka om avtorkningseffekten är beroende av smutssort eller nedsmutsningsgrad användes följande modell: Y ijkl = µ+a i +b j +d k +t l(k) +e ijkl där a i = t m +? n + (t?) mn Y = log 10 sporer i mjölk a = behandling (kontroll eller avtorkning i = 1,,8. för olika kontamineringsblandningar) j = 1,, 8. b = ko k = 1, 2. d = tidpunkt (morgon resp. kväll) l = 1,.,8. t = mjölkningstillfälle inom romersk kvadrat m = 1,.,4. e = rest n = 1,2. t = kontamineringsblandning? = avtorkning (avtorkning resp. kontroll). För att studera om avtorkningseffekten är beroende av vilken sportyp som spenarna är kontaminerade med användes följande modell: Y ijkl = µ+a i +b j +d k +t l(k) +e ijkl Y = (log 10 klostridie sporer - log 10 B.cereus sporer) i mjölk a = behandling (kontroll eller avtorkning i = 1,,8. för olika kontamineringsblandningar) j = 1,, 8. b = ko k = 1, 2. d = tidpunkt (morgon resp. kväll) l = 1,.,8. t = mjölkningstillfälle inom romersk kvadrat e = rest. 15

RESULTAT Avtorkningsförsök Delförsök 1 Resultaten av avtorkningseffekten visas i tabell 1. Jämfört med kontrollen (ingen avtorkning, ingen urdragning) så reducerade avtorkning med olika sorters torra pappersdukar under 10 s sporinnehållet i mjölken med 45-50 %. En 50-74 % reduktion erhölls med olika sorters förfuktade pappersdukar (10 s) och en 74 % reduktion med olika sorters tvättbara dukar (10 s). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan de två mjölkarna (p=0,826), eller mellan morgon- och kvällsmjölkning (p=0,219). Tabell 1. Delförsök 1, medelvärde och standardavvikelse (SD) av log 10 sporer /mjölkning för olika avtorkningsmetoder. Medelvärde av 28 mjölkningar (n=28) Avtorkningsmetod Log 10 sporer/mjölkning Reduktion (%) Medelvärde SD jämfört med kontroll 1) kontroll: ingen avtorkning, ingen urdragning 5,00 a 0,14 0 2) torr pappersduk (10 s) 4,74 b 0,14 45 3) torr pappersduk (10 s) 4,70 b 0,16 50 4) fuktig pappersduk (10 s) 4,70 b 0,26 50 5) fuktig pappersduk (10 s) 4,42 c 0,27 74 6) fuktig tvättbar duk (10 s) 4,41 c 0,29 74 7) fuktig tvättbar duk (10 s) 4,42 c 0,31 74 a,b,c Medelvärden med olika bokstäver skiljer sig åt signifikant (p<0,001) SE of difference = 0,049 Under försöket mjölkade korna i genomsnitt 24,9 kg mjölk per ko och dygn. Kontamineringsblandningen visade sig innehålla ca 155000 klostridiesporer/g. Mjölkningsanläggningen tycks inte ha bidragit med några sporer, analyserna visade att sköljvattnet i mjölkningsanläggningen innehöll < 10 sporer/liter. Kornas gödsel däremot innehöll under försöket höga halter av klostridiesporer (87000-620000), vilket troligen berodde på utfodring med ensilage av sämre kvalitet. Jämfört med renheten på juver/spenar före kontaminering kunde några höga sporhalter kopplas samman med mycket smutsiga juver och spenar, men långt ifrån alla kor med smutsiga juver och spenar hade höga sporhalter i mjölken så den naturliga nedsmutsningen tycks inte ha påverkat resultaten. Delförsök 2 I delförsök 2 jämfördes olika kombinationsmetoder. Alla metoder med två dukar, tvål eller längre avtorkningstid gav bättre resultat (tabell 2) än avtorkningsmetoder testade i delförsök 1. Den signifikant bästa metoden (p<0,001) och mest effektiva i att rengöra spenarna var användning av en fuktig tvättbar duk med eller utan tvållösning + en torr pappers duk (10+10s), vilket reducerade sporinnehållet i mjölken med 96 % jämfört med kontrollen. Inte 16

heller under detta delförsök fanns skillnader mellan de två mjölkarna (p=0,224) eller mellan morgon- och kvällsmjölkning (p=0,079). Tabell 2. Delförsök 2, medelvärde och standardavvikelse(sd) av log 10 sporer /mjölkning för olika avtorkningsmetoder. Medelvärde av 28 mjölkningar (n=28) Avtorkningsmetod Log 10 sporer/mjölkning Reduktion (%) Medelvärde SD jämfört med kontroll 8) kontroll: ingen avtorkning, ingen urdragning 5,33 a 0,13 0 9) fuktig tvättbar duk + torr pappersduk (10+10 s) 3,94 b 0,28 96 10) fuktig tvättbar duk med tvållösning + torr papperduk 3,93 b 0,23 96 (10+10 s) 11) tvållösning sprayas på + torr pappersduk (10 s) 4,52 d 0,26 85 12) tvållösning, spene doppas i skum + torr pappersduk (10s) 4,26 c 0,28 91 13) två fuktiga pappersdukar (10+10 s) 4,30 c 0,24 91 14) en fuktig pappersduk (20 s) 4,47 d 0,22 86 a,b,c,d Medelvärden med olika bokstäver skiljer sig åt signifikant (p<0,001), utom mellan avtorkningmetod 13 och 14 då (p<0.01). SE of difference = 0,047 Under försöket mjölkade korna i genomsnitt 24,9 kg mjölk per ko och dygn. Kontamineringsblandningen visade sig innehålla ca 260000 klostridiesporer/g. Sköljvattnet i mjölkningsanläggningen innehöll < 10 sporer/liter och kornas gödsel innehöll lägre mängd sporer än under delförsök 1 (6100-194000). Troligen har varken mjölkningsanläggning eller naturlig nedsmutsning av spenarna påverkat resultaten. Delförsök 3 Effekten av en utav de bästa avtorkningsmetoderna i försök 1 och 2 (fuktig tvättbar duk + torr pappersduk (10+10s)) visade sig vara lika effektiv oavsett vilken typ av smuts, bakteriespor eller föroreningsgrad av smuts som spenarna var förorenade med. När spenarna förorenats med smuts innehållande den vanligaste förekommande bakteriesporen för respektive smutstyp (tabell 3) fanns det inget samspel (p=0,214) mellan smutstyp (mycket gödsel, gödsel, jord och sågspån) och avtorkning (avtorkning/kontroll). Vilket visar att det troligen inte finns några skillnader i effekten av avtorkning på spenar förorenade med de olika smutstyperna innehållande de olika vanligaste förekommande sporerna i respektive smutstyp, samt vid olika föroreningsgrad. Vid förorening med de två olika gödselblandningarna där mycket gödsel innehöll dubbelt så mycket gödsel som gödsel, men där sporhalten/g blandning var lika stor blev sporhalten i mjölken för kontrollerna lika stora, vilket antyder att dubbelt så mycket gödsel fastnat på spenarna vid behandlingen med mycket gödsel. 17

När båda sportyperna (Clostridium tyrobutyricum och B. cereus) fanns närvarande i samma smutstyp (gödsel och jord) fanns det inga signifikanta skillnader (p=0,234) mellan differenserna (log 10 klostridiesporer log 10 B. cereus -sporer) vid avtorkning och kontroll för de olika smutstyperna. Det visar att det troligen inte finns några skillnader i effektiviteten av avtorkningen på de olika sportyperna (tabell 4). Tabell 3. Effekten av avtorkning med fuktig tvättbar duk + torr pappersduk (10+10s) på spenar förorenade med olika typer av smuts med vanligen förekommande bakteriespor för respektive smutstyp, jämfört med kontroll: ingen avtorkning, ingen urdragning. Medelvärdet och standardavvikelse (SD) av log 10 sporer / mjölkning av 16 mjölkningar (n=16) Smuts sort Sportyp Log 10 sporer/mjölkning. Kontroll Avtorkning Medel SD Medel SD Reduktion (%) jämfört med kontroll Gödsel klostridie 5,01 a 0,42 3,23 b 0,37 98,3 Mycket gödsel klostridie 5,01 a 0,40 3,40 b 0,43 97,5 Jord B. cereus 5,23 a 0,22 3,48 b 0,29 98,2 Sågspån B. cereus 5,18 a 0,52 3,24 b 0,53 98,8 a,b Medelvärden med olika bokstäver skiljer sig åt signifikant (p<0,001) Tabell 4. Effekten av avtorkning med fuktig tvättbar duk + torr pappersduk (10+10s) på spenar förorenade med 2 olika typer av smuts innehållande både Clostridium tyrobutyricum- och B. cereus-sporer, jämfört med kontroll: ingen avtorkning, ingen urdragning. Medelvärdet och standardavvikelse (SD) av log 10 sporer /mjölkning, samt för varje smutstyp och mjölkning beräknat differensen mellan log 10 klostridiesporer log 10 B. cereus-sporer av 16 mjölkningar (n=16) Smuts Sportyp Log 10 sporer/mjölkning. Kontroll Avtorkning Medel SD Medel SD Reduktion (%) jämfört med kontroll Gödsel klostridie 5,01 0,42 3,23 0,37 98,3 Gödsel B. cereus 4,88 0,42 3,10 0,34 98,3 Gödsel klostridie B. cereus 0,13 a 0,25 0,13 a 0,39 Jord klostridie 5,21 0,12 3,62 0,16 97,4 Jord B. cereus 5,23 0,22 3,48 0,29 98,2 Jord klostridie B. cereus -0,025 a 0,22 0,14 a 0,26 a Medelvärden skiljer sig inte åt signifikant (p>0,05) 18

Under försöket mjölkade korna i genomsnitt 24,8 kg mjölk per ko och dygn. De olika kontamineringsblandningarna visade sig innehålla föjande antal sporer: Gödsel ca 210000 klostridiesporer/g och ca 1 260000 B. cereus-sporer/g. Mycket gödsel ca 240000 klostridiesporer/g Jord ca 230000 klostridie sporer/g och ca 740000 B. cereus-sporer/g. Sågspån - ca 3 100000 B. cereus-sporer/g. Sköljvattnet i mjölkningsanläggningen innehöll < 10 sporer/liter. Kornas gödsel innehöll mellan 12700 89000 klostridiesporer/g, oanvänt sågspån som användes till strömaterial innehöll < 100 B. cereus -sporer/g och strömaterial från båspall innehöll mellan 100 1750 B. cereus sporer/g. Troligen har varken mjölkningsanläggning eller naturlig nedsmutsning med gödsel eller strö på spenarna påverkat resultaten. Tvättförsök Delförsök A Resultaten från analyserna av hur mycket sporer de tvättbara juverdukarna innehöll efter 1 avtorkning och tvätt i delförsök 1 visas i tabell 5. Kornas spenar hade kontaminerats före avtorkning med gödsel-vatten-blandning innehållande höga klostridie-sporhalter, varför det eventuellt skulle kunna finnas en risk att dukarna inte blev fria från sporer. Det tycks finnas något fler sporer kvar i bomullsduken än i syntet -duken och maskintvätt tycks vara något effektivare än en noggrann handtvätt men i samtliga fall finns endast låga halter av klostridie sporer (< 1 promille) kvar i duken. Tabell 5. Antal klostridiesporer efter tvätt i tvättbara juverdukar som använts vid avtorkning av spenar som kontaminerats med sporer före avtorkning. Varje värde är ett medelvärde av 8 dukar som analyserats parvis (n=4) Duk Kontroll (ingen tvätt) Handtvätt Maskintvätt Bomull 230 000 207 146 Syntet 380 000 133 21 Delförsök B Klostridie-sporhalterna var fortfarande låga i dukarna även då olika typer av tvättbara juverdukar (bomull och syntet ) doppats i en gödsel-vatten-blandning, därefter tvättats för hand eller i maskin och detta upprepats upp till 30 gånger (tabell 6). Vid räkningen av kolonier på filtren fanns det kolonier längs filterkanten som vuxit samman och inte gick att räkna. På filtret fanns tydliga kolonier och det rör sig troligen om ett fåtal per platta som fanns längs kanten. Det kan bero på att dukarna efter många tvättar flockade. Efter 30 tvättar var bomullsdukarna fortfarande i mycket bra skick medan syntet -dukarna började se lite slitna ut i synnerhet de som maskintvättats. Försöket visar att sporer inte ackumuleras i dukar som återanvänds om de tvättas väl. 19