Cellcykel/Celldöd. Laborationsrapport 20/2-14. Basgrupp 1

Cellcykel/Celldöd Laborationsrapport 20/2-14 Basgrupp 1 Louise Andersson Alexander Barhebreus Pontus Boberg Amanda Dahl Simon Ingves Christina Larsson Kajsa Lethin Thea Wennman

Syfte Se skillnad på hur strålning och Nutlinbehandling påverkar cancerceller med både muterad och ickemuterad p53gen med avseende på cellcykelarest, uttryck av p21 protein och apoptos av cancercellerna. Dessutom skulle det undersökas om det skett någon mutation i exon 8 i p53-genen hos någon av de två cellinjer som tilldelats (A och B) samt betydelsen av detta. I detta ingick att undersöka mutationens placering och dess eventuella funktionella konsekvenser på proteinnivå. Hypotes Cellcykeln kommer stanna i G1fas hos cellinje med wt p53 gen och inte i den med en muterad p53 gen. Obehandlade levande cancerceller bör innehålla låga eller inga nivåer av p53 då de inte har stannat upp i cellcykeln eller gått i apoptos. Celler behandlade med nutlin-3, strålning eller bägge borde uttrycka högre nivåer av p53 vilket bör leda till fler apoptotiska celler. Detta bör kunna visualiseras med DAPI-behandling och granskning i fluorescerande mikroskop. Bakgrund Cellcykeln består av fyra olika faser som en cell genomgår vid delning. Varje varv i cykeln slutar med delning av cellen i två. Då miljön är gynnsam sker cellcykeln om igen. De fyra faserna innebär: G1 - Gap phase 1 - Cellen ökar i storlek, beståndsdelar typiska för celltypen tillverkas och den förbereds för DNA-replikation. S - Synthesis phase Cellen replikerar DNA:t, 92 kromosomer. - Gap phase 2 - Kontroll och reparation av nyreplikerat DNA vid behöv. M-fasens proteiner förbereds. M - Mitosis phase Mitosen sker. När cellen inte är i cykeln ligger den utanför i G0 fas, permanent eller temporärt. I G0-fas utförs de fysiologiska uppgifter cellen är ämnad för. För att inget ska gå fel och för att undvika mutationer finns checkpoints i cellcykeln. Två finns i slutet av G1 respektive. Där undersöktes om DNAt är komplett. I checkpointen vid G1 styr transkriptionsregulatorn p53. P53 bildas konstant av cellen men inhiberas av MDM2 genom märkning av p53 med ubiquitin och bryts då ned i protesomen. P53 är en transkriptionsfaktor för MDM2 genen och MDM2 utgör en negativ feedback loop för p53. Nutlin-3A binder kompetitivt till MDM2 och hindrar inhiberingen av p53. När celler strålas kan vätebindningarna i DNAt påverkas och p53 stoppar då cellen i fas G1 för att förhindra att den skadade celler delar sig. Om skadan inte går att laga kommer cellen att gå i apoptos. p53 aktiverar flertalet proteiner, däribland p21 som inhiberar cyklin-cdkkomplex vilket inducerar cellcykelarrest. Exempel på när p53 aktiveras är vid strålningsinducerad DNAskada. Vissa cancerceller kan växa bland annat på grund av defekt uttryck eller effekt av p53. Apoptos innebär programmerad, kontrollerad, celldöd och sker normalt efter ett förutbestämt schema. Vid apoptos, till skillnad från nekros, läcker inte cellulärt innehåll ut i extracellulärutrymmet och därmed induceras inte inflammation. Kromatinet kommer att kondensera och omhöljas av membran och därmed bilda apoptotiska kroppar. Apoptos kan induceras av Fas-ligandinteraktion eller intracellulär aktivering.

En mutation innebär att det genetiska materialet har modifierats på något sätt. Detta kan ske på följande sätt; punktmutation, insertion och deletion där de sista två även kan leda till en frame-shift. Vid en frame-shift kommer samtliga kodon efter deletionen eller insertionen att få en ny sammansättning av nukleotider medan en punktmutation endast påverkar det kodon vars nukleotid byts ut. Innebörden av att ett kodon får en ny sammansättning kan vara obetydlig och kodonet fortsätter koda för samma aminosyra, men det kan även innebära att det börjar koda för en annan aminosyra vilket kan ge proteinet en annan funktion. Detta kan vara gynnsamt, icke-gynnsamt eller obetydligt för cellens funktion/överlevnad. Metod Två cellinjer av bröstcancerceller studerades, cellinje A och B. Varje cellinje fanns som fyra olika prov där tre genomgått olika behandlingar och ett prov bevarats obehandlat. Ett prov hade strålats med 10 Gy, ett behandlats med Nutlin och ett hade utsatts för både 10 Gy och Nutlinbehandling. Cellcykelanalys Första steget under laborationen var tillsättning av en detergent och trypsin (lösning A) till varje prov för upplösning av cellmembranet. Efter 10 minuter tillsattes en trypsinhibitor, för att förhindra vidare upplösning av kärnan, och ett RNase, för upplösning av RNA, (lösning B). Proverna förvarades sedan i kyl i väntan på flödescytomtern. Precis innan analysens start tillsattes av Propidiumjodid (lösning C). Proverna analyserade sedan i ModFit Software för framtagning av fraktionen mellan antal celler i de olika cellcykelfaserna. Flödescytometern fungerar så att den energi (ljus) som skickas mot atomer och träffar en elektron i den yttre orbitalen leder till excitation av elektronen. Atomens stabilitet sänks och elektronen faller tillbaks. Det resulterar i utsöndring av ett ljus med aningen längre våglängd (mindre energirikt ljus) än det inskickade ljudets pga. värmeutsöndring. Propidiumjodid fluorescerar grönt ljus som detekteras i flödescytometern och är i relation till mängden DNA. Western Blot Western Blot utfördes för att detektera nivåer av p-21 i cellysaten i cellinjerna A och B. Kortfattat utfördes dessa huvudsakliga steg: Protein loading Electrophoresis Transfer Primary antibody (p21) incubation Secondary antibody incubation Exposing Analysis Elektrofores separerar proteiner baserat på molekylärvikt, där proteiner med lägre molekylärvikt vandrar snabbare och mer oförhindrat genom gelén. En buffert tillsätts för att alla proteinerna ska laddas negativt och därmed röra sig då de utsätts för en elektrisk ström. Som förberedelse för CCD-fotografering görs en transfer från gel till membran. Vid transfern överförs proteinerna till ett proteinbindande membran. Detta steg baseras också på att proteinerna kommer röra sig som följd av dess laddningar.

En antikropp tillsätts som är specifik för p21. Den sekundära antikroppen som adderas senare binder i sin tur till den primära antikroppen. Kopplat till den sekundära antikroppen sitter ett enzym (horseradish peroxidase) som driver klyvningen av ett HRP-substrat som tillsätts härnäst. Vid denna reaktion uppkommer chemiluminescence och ljuset som emitteras kan detekteras via en CCD-kamera. Figur 1 Apoptos Celler från cellinje A och B som utsatts för antingen strålning (10Gy), Nutlin-3, både strålning och Nutlin-3 eller ingetdera, infärgades med DAPI, med hjälp av lösningsmedlet Saponin, för att detektera dubbelsträngat DNA. DAPI gör cellkärnorna fluorescerande och cellerna preparerades sedan på mikroskopglas. Cellinje A och B kom från olika bröstcancerceller. Cellerna undersöktes sedan i fluorescerande mikroskop, där UV-ljus visualiserar infärgningen, för att jämföra mängd apoptotiska drag i förhållande till normala celler. Preparaten jämfördes sinsemellan för att man skulle kunna studera hur strålning och Nutlin-3 påverkat cellerna. Mutationsanalys Syftet med Sanger-metoden är att inkorporera stoppnukleotider i DNA-sekvensen så att fortsatt syntetisering inte kan ske. Stoppnukleotiderna hindrar fortsatt syntetisering genom att de saknar den OH-grupp som är nödvändig för fosfodiesterbindning till nästa nukleotid. När man har alla stoppnukleotider i tillräckligt hög koncentration kommer man få DNAfragment i samtliga längder. Detta kommer ske genom att en slumpmässig inbindning av stoppnukleotiderna sker, vilka hindrar fortsatt syntetisering av just sin DNA-sträng. Stoppnukleotiderna skiljer sig inte enbart från de vanliga nukleotiderna pga OH-gruppen. Stoppnukleotiderna innehåller även en flouroscerande molekyl som är unik för de olika nukleotidtyperna (A,T,C,G) och det är denna som kommer ge upphov till de olika färgerna som syns i elektrofores. Vid elektrofores kommer de olika DNA-fragmenten att vandra genom en gel som utsätts för spänning. Eftersom DNA är negativt laddat kommer fragmenten att vandra mot pluspolen. Hur långt fragmenten kommer röra sig i gelen beror av dess längd; den kortaste kommer att vandra längst. Då laborationen påbörjades hade en amplifiering av sekvenserna i cellinje A och B redan utförts med hjälp av PCR och även en rening från fria nukleotider. Först placerades cellinje A i två olika provrör och cellinje B i två provrör. Provrören markets med AF (A forward), AR (A reverse), BF (B forward) samt BR (B reversed).

För att detektera sekvensens nukelotid-ordning användes metoden Sanger-sekvensering. Denna metod går till på följande sätt: Först förbereds insertion av stoppnukleotider i PCR-produkten. Detta görs genom att det tillsätts primer (forward och reversed, så att AF, AR, BF och BR fås), MilliQ-vatten, Sequencing Buffer och BigDye Terminator till PCR-produkten. Primer utgör startpunkt för DNA-syntetisering MilliQ-vatten filtrerat och renat vatten Sequencing buffer BigDye Terminator innehåller dntp (deoxynukleotidtrifosfat), ddntp (dideoxynukleotidtrifosfat) och polymerase (anpassat till tidigare nämnda produkter). Denna blandning innehåller även fluoroform. Därefter placeras preparatet i en PTC-200 (Peltier Thermal Cycler) som programmerats enligt följade. 96 C, 1 min (separera DNA) Repetera följande i 25 cykler 96 C, 10 sek (denaturering av DNA) 55 C, 5 sek (primer binder in till DNA) 60 C, 2 min (syntetisering av komplemtär DNA-sträng) Då denna process genomförts skall post-reaction clean-up genomföras. Detta steg genomförs för att avlägsna salter m.m. som kan komma att störa elektroforesen. Post-reaction clean-up gör man genom att tillsätta milliq-vatten, EDTA, natriumacetat och etanol (99). Därefter skall provröret vändas fem gånger och sedan inkuberas i fem minuter i rumstemperatur och mörker. Sedan ska proverna centrifugeras på maxhastighet i 15 minuter. Efter centrifugeringen ska supernatanten avlägsnas från provröret. Då endast pelleten är kvar i provröret ska den sköljas med etanol (70) för sedan centrifugeras ytterligare 5 min och därefter ska supernatanten återigen avlägsnas. Sedan ska pelleten lufttorka över natten. Sist av allt ska Hi-Di formamid tillsättas och sedan ska produkten föras över till en speciell 96-wells platta. Därefter förs produkten in i en kapillärelektrofores-maskin som presenterar resultatet i ett datorprogram. För att tolka resultatet från elektroforesen gjordes följande: Lägg in sekvensen i BLAST. Välj complete cds Detta visar vilken gen sekvensen finns i, i detta fall tp53. Det går även att se var i genen sekvensen är lokaliserad. Här är det även möjligt att se om det skett några mutationer, dvs. att sekvensen inte matchar databasens. Därefter klickar man på Sequence ID och väljer visa sekvens. Det blir då utmarkerat hur databasens hela sekvens ser ut samt var det aktuella exonet är placerat (brunmarkerat). Sedan använder man FASTA formen för sekvensen och klistrar in den i en ny BLASTsökning med aligned sequence med den utvunna sekvensen. Resultatet av detta är att man ser vilka skillnader som skett i sekvensen (mutationer och frame-shift).

Material Se labhandledning. Resultat Cellcykelanalys Diagramtext: A - Cellinje A, B - Cellinje B, N- Nutlinbehandlad, R - Strålningsbehandlad. B B-N B-R B-NR 18,6 S 33,8 G1 47,6 56, 0 G1 25, 5 S 18, 5 S 0, 0 26, 5 G1 73, 5 62, 4 G1 17, 9 S 19, 7 47,8 A G1 27,0 S 25,2 66,1 A-N G1 22,2 S 11,7 86,3 A-R G1 6,4 S 7,3 79,7 A-NR G1 9,2 S 11,1 Figur 2

Western blot Nivå 21 kda Figur 3 Elektroforesresultat i CCD-kameran där cellinje B ses till vänster och cellinje A till höger. Ordningen i respektive linje från vänster till höger var: strålning + nutlin-3, strålning, nutlin-3 och obehandlad. Den sista A- linjen fattas. De tjockaste strecken (längst ner i bilden ovan) ligger på nivån 21 kda där p-21 förväntas ligga. Cellinje A uttrycker inte p-21. I cellinje B uttrycks högre nivåer p-21 i cellerna som behandlades med både strålning och nutlin-3. Cellerna behandlade med Nutlin-3 uttrycker högre nivåer p-21 än de strålningsbehandlade. Apoptos A (kontroll) Runda regelbundna celler Ej mycket apoptos Utspridda och växer ej lika snabbt som celllinje B A-N Ej stor skillnad från kontroll A-R En del apoptos och apoptotiska kroppar Färre celler än i kontroll A-NR Ej stor skillnad jämfört med A-R En del apoptos B (kontroll) Många, täta celler Ej mycket apoptos B-N Mer apoptos Oregelbundna celler Glesare och färre celler B-R Mer apoptos Oregelbundna celler Glesare och färre celler Liknar B-N B-NR Mest apoptos Oregelbundna celler Ännu glesare och färre celler Tabell 1

A A-N A-R A-NR B B-N Figur 4 Tolkning, se Tabell 1 B-R B-NR

Mutationsanalys Cellinje A forward Figur 5 Cellinje B forward Figur 6

Cellinje B reversed Figur 7 Diskussion Cellcykel I cellinje A kan man ana att p53 genen är muterad då cellerna inte stannar i G1 fasen efter strålbehandling. Detta borde ske då p53 kontrollen finns mellan G1- och S-fas. Efter Nutlin behandling stannar inte fler celler i G1, vilket borde skett om p53 hade varit funktionellt. I cellinje B stannar däremot flertalet celler i G1-fas efter strålbehandlingen. Det tyder på att p53 genen är funktionell och stannat cellcykeln vid checkpointen. I provet som både var strål- och nutlinbehandlat borde en avstanning i G1 fas också setts. Anledningen till att det inte skett kan vara att provet behandlats med Nutlin före strålningen. Nutlin har en förmåga att även stanna cellcykeln vid - checkpointen, vilket gjorts innan strålningen utfördes. Då Nutlin redan avstannat cellcykeln i - checkpointen kommer inte cellerna till G1 fasen där p53 hade haft möjlighet att avstanna cellcykeln. Western Blot Resultatet stämmer till viss del överens med hypotesen. I cellinje B uttrycker de behandlade cellerna mer p-21 som förväntat. Skillnaden i uttryck av p-21 mellan de strålningsbehandlade och nutlin-3-behandlade B-cellerna kan tänkas bero på variation i tumörernas molekylära strukturer och strålningskänslighet. Cellinje A uttrycker tillsynes inget P-21 alls. Förklaringen kan tänkas ligga i defekt P-53-gen men det måste stärkas av andra tester än western blot. Felkällorna listade nedan kan ha påverkat resultatet (definitivt i obehandlade cellinje A) men det är svårt att värdera hur mycket om alls. Upprepade studier eller jämförelse med andra likvärdiga studier behöver göras för att bekräfta deras betydelse. Felkällor under laborationen kan ha varit: För liten volym av den obehandlade cancercellen i cellinje A hamnade i brunnen vid överföringen till elektroforesgelen. Konsekvens: Uteblivet resultat vid mätning av obehandlade celllinje A-cellerna. Volymen av den sekundära antikroppen som tillsattes kan ha varit för liten, då pipetteringen inte skedde direkt i vätskan utan ovanför. Konsekvens: För att chemiluminescence ska ske måste den sekundära antikroppen binda in. För lite sekundärantikropp ger mindre eller ingen chemiluminescence.

Apoptos Cellinje A verkar ha en muterad p53-gen då den inte påverkas av nutlin-3 med avseende på apoptos, påverkas dock av strålning som inducerar apoptos via andra vägar. Detta kan ses på preparat A-N att nutlin-3 ej påverkar apoptosmängd (jmf kontroll) Cellinje B verkar ha starkare proliferativ förmåga än cellinje A och därmed är det viktigt att fokusera på andel apoptotiska celler och ej antal. Cellinje B verkar ej ha en muterad p53-gen då den påverkas av nutlin-3 med avseende på apoptos. Både nutlin-3 och strålning kommer alltså att inducera apoptos. Preparat B-N och B-R har liknande apoptosandel medan preparat B-NR har överlägsen andel apoptos. Vid tolkning av resultatet bör följande beaktas: Apoptos orsakas även av naturliga orsaker Infärgningen kan ha blivit inkorrekt då vi ej är erfarna preparatmakare Våra fynd vid mikroskoperingen baseras på subjektiva bedömningar Preparaten kan ha skadats fram till mikroskoperingen vilket kan påverka cellernas beteende Mutationsanalys Cellinje A forward (figur 5): I query har en mutation skett i nukleotid 68 vilket motsvarar nukleotid 71 i subject. Den 71:a nukleotiden är placerad i mitten på sitt kodon och är G, denna har muterats till ett A. Orginal-kodon är: AGA (Argenine) Mutations-kodon: AAA (Lysin) AGA284AAA Arg>Lys Cellinje A reversed: Det har skett en mutation i vår sekvens i nukleotid 62 vilket motsvarar databasens 71:a nukleotid. Den 71:a nukleotiden är placerad i mitten på sitt kodon och är ett C, denna har dock muterats till ett T. Orginal-kodon: TCT (Serine) Mutations-kodon: TTT (Phenylalanine) TCT284TTT Ser>Phe Cellinje B Forward (figur 6): I cellinje B finns det möjlighet att det skett en mutation i subjektets 70:e nukleotid där queryn svarat med ett M vilket innebär att det antingen är ett C eller M (orginal är A). Möjlig mutation: den första (70:e) nukleotiden i kodonet har bytts ut mot ett C. Orginal-kodonet är: AGA (Arginine) Muations-kodon är: CGA (Arginine) Detta kommer alltså inte att innebära någon konsekvens eftersom mutationen kommer att koda för samma aminosyra. Det innebär även att det är möjligt att det inte skett något nukleotidskifte Cellinje B reversed (figur 7): I cellinje B finns det möjlighet att det skett en mutation i subjektets 65:e nukleotid (queryn's 69:e) där queryn svarat med ett S vilket innebär att det antingen är ett G eller C (orginal är C). Original-kodonet: GGC (Glycine) Mutations-kodon: GGG (Glycine) Detta kommer alltså inte att innebära någon konsekvens eftersom mutationen

kommer att koda för samma aminosyra. Det innebär även att det är möjligt att det inte skett något nukleotidskifte Enligt ensemble finns ingen polymorfism i detta exon (8) vilket tyder på att detta är en mutation. Om salterna inte avlägsnas fullständigt vid post-reaction clean-up kan det störa elektroforesen, vilket kan yttra sig som en deletion. Detta skulle kunna tolkas som att det skett en frame-shift, vilket skulle kunna leda till felaktig tolkning av resultatet. Konklusion Den slutsats man kan dra av dessa labbar är att p53 genen är muterad hos cellinje A. I mutationsanalyslabben framkommer det att det har skett en muatation som ger en defekt p53 gen. Även de andra dellabbarna ger visar indirekt att p53 genen hos celllinje A är muterad. Denna defekt har gett funktionella konsekvenser i olika moment i cellens livscykel. Dessa konsekvenser kan sedan observeras i de experiment som utförts i de andra dellabbarna där defekten manifesteras i att de olika funktionerna som p53 har inte fungerar som de ska.