KRISTLLISERING V LYSOZYM ETT EXEMPEL PÅ PROTEINKRISTLLISERING Laboration i kursen Experimentell Kemi Gävle 14:e augusti 2013 Handledare: Petra Elund, Göteborgs Universitet (petra.edlund@gu.se)
KRISTLLISERING V PROTEINER VRFÖR KRISTLLISTION? Proteiner är de molekyler som utför arbetet i våra kroppar till exempel transporterar syre i blodet, registrerar ljus så att vi kan se eller bryter ned maten i våra tarmar. e hundratusentals olika proteinvarianter som finns ser olika ut och fungerar på olika sätt. Om man vill förstå hur ett specifikt protein fungerar är det till stor hjälp om man vet hur den molekylära strukturen ser ut i 3. Problemet är att proteiner är för små för att studera i mikroskop, och man får därför ta till alternativa metoder. en vanligaste är röntgenkristallografi. enna metod kräver att man kan få proteinmolekylerna att bilda kristaller. I en kristall sitter likadana kopior av en molekyl i ett ordnat mönster som upprepar sig i alla tre dimensioner. Om man belyser kristallen med strålning som har ungefär samma våglängd som de avstånd man vill studera uppstår fenomenet diffraktion. e elektromagnetiska vågor som träffat kristallen fokuseras i vissa punkter. Om man kan bestämma positionen av dessa punkter, samt amplituder och faser för de elektromagnetiska vågor som bildade dem, kan man sedan räkna ut hur molekylen som byggde upp kristallen såg ut. En förutsättning för allt detta är att man kan bilda kristaller av det ämne man vill studera. en första molekyl vars struktur bestämdes med röntgenkristallografi var vanligt salt, Nal, vilket skedde 1914. Idag studerar forskare komplicerade komplex av proteiner, men flaskhalsen i detta arbete är just svårigheterna att få till kristaller av bra kvalitet. I denna laboration ska vi kristallisera proteinet lysozym. Lysozym är ett antibakteriellt protein, eftesom det har förmågan att sönderdela cellväggen hos vissa bakterier. Vi har det bland annat i våra tårar. Proteinet som används i labben är dock framställt ur hönsäggvita. KRISTLLISTIONSMETOER Principen bakom kristallisering är att man har det ämne man vill studera i lösning. Sedan låter man denna lösning bli allt mer koncentrerad. Till slut nås nukleationspunkten där några molekyler sätter sig samman. enna nukleus kan sedan byggas på till en stor kristall. En vanlig metod som används i proteinkristallisering är ångdiffusion (se
Figur 1). Man har då en förseglad kammare på vars botten det finns en reservoar med en stor volym precipitanttlösning, som innehåller ämnen som ska främja kristallbildning. I kammaren finns också en droppe proteinlösning som blandats med en droppe precipitantlösning. Eftersom den lilla droppen då kommer vara utspädd i jämförelse med lösningen i reservoaren kommer vatten sakta att dunsta från droppen till reservoaren på bottten. Undan för undan kommer koncentrationen protein att öka i den lilla droppen och om förhållandena är precis rätt kan stora, väldiffrakterande kristaller bildas. Precipitantlösningen innehåller ämnen som får proteinet att långsamt falla ut och förhoppningsvis bilda kristaller i den processen. essa ämnen är ofta olika salter eller polyetylenglykol. essutom har man en buffert för att kontrollera ph samt andra ämnen som skapar en miljö som proteinet trivs i till exempel något som proteinet binder till på ett specifikt sätt och därmed stabiliseras. tt komma fram till vad som ska ingå i ett visst proteins precipitantlösning är ofta en mödosam process som tar lång tid. Kristallerna, som ofta är kring 100µM stora, behöver sedan fiskas upp ur sin droppe, frysas i flytande kväve och därefter transporteras till s.k. synkrotroner som alstrar intensiv röntgenstrålning. Här kan diffraktionsdata samlas in, och därefter kan strukturen på proteinet lösas (se Figur 2). FIGUR 1. TVÅ VRINTER PÅ ÅNGIFFUSIONSMETOEN. TILL VÄNSTER HÄNGNE ROPPE ÄR PROTEINROPPEN SITTER I TKET, OH TILL HÖGER SITTNE ROPPE ÄR PROTEINET FINNS PÅ EN PEESTL.
FIGUR 2. ÖVERSIKT V PROESSEN FRÅN KRISTLL TILL STRUKTUR. KRISTLLER V PROTEIN () FISKS UR SIN ROPPE I EN LITEN LOO, FRYSES OH UTSÄTTS FÖR RÖNTGENSTRÅLR (). ETT RESULTERR I IFFRKTIONSMÖNSTER (), OH UTIFRÅN ETT KN STRUKTUREN FÖR PROTEINET ESTÄMMS (). IFFRKTIONSTT GÖR TT ET KN ERÄKNS VR ET FINNS MYKET ELEKTRONER (LÅTT HÖNSNÄT ) OH I ENN ELEKTRONENSITET KN EN MOEL V PROTEINET YGGS IN.
LMNUL I den här laborationen kristalliseras proteinet lysozym. För att se hur sammansättningen på precipitantlösningen påverkar kristallbildningen testas ett antal olika koncentrationer av Nal och etylenglykol. UTRUSTNING: utomatpipetter med spetsar Kristalliseringsplatta med 24 brunnar Kristalltejp Mikroskop KEMIKLIER Lysozym 100 mg/ml 1M Natriumacetat ph 4.5 4M Nal 100% Etylenglykol estillerat vatten UTFÖRNE 1. Pipettera upp reservoarlösningen enligt bifogat pipetteringsschema. 2. Skaka plattan försiktigt eller pipettera upp och ned i varje reservoar så att allt är ordentligt omblandat. 3. Sätt en 2µL proteindroppe i på hyllan i varje reservoar i rad. 4. Tillsätt 2µL av reservoarlösningen ovanpå varje proteindroppe. ropparna behöver ej blandas om. 5. Tejpa över så att varje brunn är tät. 6. Upprepa för rad 7. Kontrollera resultatet i mikroskop direkt när du är färdig, efter några timmar och gärna följande dag. Notera var kristallerna bildas, var de är flest respektive störst och bildades snabbast.
Starting ate Protein Lysozym, 100 mg/ml alt 50 mg/ml i 59mM Nac ph 4.5 Protein conc - 100 mg/ml, -, 50 mg/ml Reservoir rop volume Temperature STOK 1 2 3 4 5 6 4 M Nal 1,0 125 1,3 163 1,6 200 1,9 238 2,2 275 2,5 313 1 M Na cetate ph 4.8 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 Ethyleneglycol 100% 15% 75 15% 75 15% 75 15% 75 15% 75 15% 75 mq 275 238 200 163 125 88 4 M Nal 1,0 125 1,3 163 1,6 200 1,9 238 2,2 275 2,5 313 1 M Na cetate ph 4.8 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 Ethyleneglycol 100% 25% 125 25% 125 25% 125 25% 125 25% 125 25% 125 mq 225 188 150 113 75 38 4 M Nal 1,0 125 1,3 163 1,6 200 1,9 238 2,2 275 2,5 313 1 M Na cetate ph 4.8 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 Ethyl Glycerol 100% 15% 75 15% 75 15% 75 15% 75 15% 75 15% 75 mq 275 238 200 163 125 88 4 M Nal 1,0 125 1,3 163 1,6 200 1,9 238 2,2 275 2,5 313 1 M Na cetate ph 4.8 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 0.05 M 25 Ethyl Glycerol 100% 25% 125 25% 125 25% 125 25% 125 25% 125 25% 125 mq 225 188 150 113 75 38 ate: ate:
ate: ate: ate: