Litteraturstudie: Magainin - en antimikrobiell sköld på den Afrikanska klogrodans (Xenopus Laevis) rygg. Jonas Fagerberg Uppsala Universitet Institutionen för läkemedels kemi Avdelningen för farmakognosi Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling Vt-2007
Sammanfattning. Magainin 1 och 2 är antimikrobiella katjoniska peptider som är 23 aminosyror långa. De upptäcktes i huden hos den afrikanska klogrodan i mitten på åttiotalet. De utövar sin antmikrobiella effekt genom att skapa porer i mikroorganismers cellmembran. Ett stort antal magaininanaloger har utvecklats. Den mest framgångsrika, Pexiganan, fick i slutet på 1990talet avslag av FDA när försäljningsgodkännande ansöktes. Framsida: Agarplatta med E. coli som utsatts för olika fraktioner av magaininextrakt från Xenopus Laevis hud (Zasloff, 1987). 2
Innehållsförteckning Sammanfattning. 2 Inledning. 4 Historisk bakgrund. 4 Hur och varför magaininprojektet startade. 4 Syntes, extraktion och isolering av magaininer. 5 Beskrivning av magaininerna och deras biologiska aktivitet. 5 Magaininer och läkemedelsutveckling. 7 Referenser 8 3
Inledning. Magainin, eller magaininerna är en grupp antimikrobiella peptider som först upptäcktes i huden hos den afrikanska klogrodan, Xenopus Laevis. De har fått sitt namn från det hebreiska ordet magain, som betyder sköld. Gruppen innefattar i första hand magainin 1 och 2. Dessa peptider är 23 aminosyror långa och skiljer sig från varandra på två aminosyrerester (Berkowitz et al. 1990). Även andra liknande peptider såsom den amiderade formen av magainin 2, syntetiska derivat och PGLa räknas ibland in i peptidfamiljen (Matsuzaki, 1998). Detta trots att PGLa, som också återfinns i den afrikanska klogrodans hud, inte delar magaininernas sekvenshomologier. Peptiderna är katjoniska. Magainin 1 och 2 utövar sin effekt genom att störa cellmembranstrukturen hos mikroorganismer (Zasloff, 1987). Historisk bakgrund. Arten Xenopus Laevis, den afrikanska klogrodan, har använts som försöksdjur i vetenskapliga studier i mer än 80 år. En anledning till att arten använt flitigt är att det är lätt att styra dess fortplantning. I fångenskap lägger den inte ägg över huvudtaget utan att stimuleras till detta genom en hormoninjektion (Bellerby, 1933). Utöver detta är arten mycket tålig och kan överleva i ett akvarie i decennier. Artens ägg är dessutom förhållandevis stora. Detta gör dem lätta att manipulera. Den afrikanska klogrodan har använts i endokrinologiska studier såväl som i försök för att studera hur RNA uttrycks hos eukaryoter. Hur och varför magaininprojektet startade. Det var just i studiet av RNAuttryck i oocyter från grodan som artens exceptionella motståndskraft mot mikroorganismer uppmärksammades och undersöktes för tjugo år sedan. Michael Zasloffs forskargrupp ägnade en stor del av åttiotalets början åt dessa studier. Äggstockar från vuxna hongrodor avlägsnades med ett försiktigt kirurgiskt ingrepp. Efter att ingreppet utförts och operationssåren på grodornas buk noggrant sytts ihop återfördes djuren till sina tidigare habitat. Trots att varken operationsbetingelser eller djurens akvarier var tillnärmelsevis sterila drabbades endast ett försvinnande litet antal djur av infektioner efter utfört ingrepp (Zasloff, 1987). Misstankar fattades att grodornas hud innehöll någon steriliserande substans som kunde vara anledningen till att de klarade sig utan infektioner. De substanser som hittades i efterföljande studier var magainin 1 och 2. Dessa substanser, såväl som en uppsjö derivat, har sedermera syntetiserats (Chopra, 1993). I samband med de initiala studierna och isolerandet av peptiderna hittades även en cdnasekvens som kodar för ett gemensamt prekursorprotein till magainin 1 och 2. Detta protein är 160 aminosyrerester långt och innehåller en magainin 1 och två magainin 2-enheter (Matsuzaki, 1998). 4
Syntes, extraktion och isolering av magaininer. Magainin 1 och 2 samt deras derivat kan framställas med hjälp av fastfassyntes (Rautenbach et al., 2005). Fastfassyntes av peptider bygger på att man successivt förlänger en peptidkedja på en resin genom att klyva bort en skyddsgrupp och tillsätta en aktiverad aminosyra som i sin tur bär en skyddsgrupp. Denna process upprepas till de att man erhållit önskad aminosyrasekvens, varpå den färdiga peptiden klyvs av från resinen och tas om hand för vidare upprening, förvaring och användning. Att peptiderna går att syntetisera är naturligtvis en förutsättning för att omfattande studier av deras aktivitet och egenskaper ska vara försvarbar och ekonomiskt möjlig. Antalet klogrodor som skulle krävas för framställning av peptiderna skulle annars bli mycket, högt då huden från en vuxen individ innehåller upp till 2 mg magainin (Zasloff, 1987). Vidare möjliggör syntesen för förändringar i aminosyrasekvensen vilket gör att ännu effektivare analoger kan utvecklas. Magaininanaloger kan även framställas med hjälp av bioteknologi. En hybridpeptid med sekvensinslag från både magainin 2 och cecropina, som är ytterligare antimikrobiell peptid, har framgångsrikt uttryckts av en rekombinant jäststam. En gen klonades in i jästens arvsmassa och efter fermentering kunde 22 mg peptid renas fram från en liter fermentationskultur. När peptidgruppen upptäcktes i mitten på åttiotalet utvanns substanserna ur hud från Xenopus Laevis. I det protokoll som följdes för att extrahera substanserna sövdes grodorna genom att nedsänkas i vatten preparerat med tricaine. Detta är ett anestetiskt preparat som används för att söva vattenlevande djur. Därefter avlivades exemplaren varpå huden från deras buk och ben avlägsnades. Huden homogeniserades tillsammans med fyra volymer 0,2 molarig natriumacetat innehållande pepstatin, leupeptin samt fenylmetylsulfonlyflorid vid 4ºC. Homogenatet centrifugerades och supernatanten omhändertogs och kyldes ned och förvarades vid -70ºC. Efter att supernatanten tinats och centrifugerats ytterligare en gång för att bli klar fraktionerades vätskan fram på jonbyteskolonn. Den aktiva fraktionen delades upp ytterligare via gelfiltrering och undersöktes med avseende på bakteriedödande aktivitet (se figur på titelblad). De mest aktiva fraktionerna koncentrerades och fraktionerades ytterligare medelst reversedphase HPLC (Zasloff, 1987). Ur dessa kunde sedan magainin 1 och 2 isoleras. Beskrivning av magaininerna och deras biologiska aktivitet. Magainin 1 och 2 är båda 23 aminosyror långa och skiljer sig från varandra på endast 2 positioner (se figur 1). Figur 1: Aminosyrasekvensen för de två peptiderna (Zasloff, 1987). Peptiderna innehåller stora hydrofobiska element. De har båda en utpräglat katjonisk karaktär och uppvisar antimikrobiell aktivitet. Magaininerna har ett brett spektrum och 5
uppvisar aktivitet mot gramnegativa och grampositiva bakterier, svamp samt parasiter. I tidiga studier visade sig magainin 2 vara mer potent än magainin 1. Detta kan förklara varför många efterkommande studier inriktat sig på den förstnämnda. I vattenmiljö har Magaininerna ingen uttalad sekundärstruktur, men i omgivningar med organisk karaktär antar de en stavformig alfahelixstruktur (Berkowitz et al. 1990). Dessa stavar är långa nog att spänna över ett dubbellager fosfolipider, vilket spelar en avgörande roll i peptidernas antimikrobiella funktion. De cytotoxiska egenskaper som magaininerna uppvisar gentemot bakterier bygger på att de positivt laddade peptiderna interagerar med negativt laddade delar av bakteriers yta (Genco et al., 2002). Dessa negativa element kan vara lipopolysackarider i cellväggen hos bakterier eller fosfolipider i deras cellmembran. Denna interaktion leder till att mikroorganismens cellvägg får en förändrad permeabilitet. Två olika modeller för att förklara hur cellväggen störs har framlagts. Den ena bygger på att peptiderna ansamlas på utsidan av membranet och stör dess form. Den andra teorin talar om magaininerna som PFP, porformerande polypeptider (Matsuzaki, 1998). När ett tillräckligt antal peptider bundit till en bakteries cellmembran bildar de porer genom membranet (se figur 2). Genom dessa porer kan vätska, joner och andra substans passera membranet utan kontroll, vilket snart leder till att bakterien dör. Denna relativt generella verkningsmekanism torde försvåra resistensutveckling hos olika bakterier mot magainin. Figur 2: 1, Peptiderna fördelar sig till ett cellmembran. De skuggade delarna i stavarna motsvarar lipofila element. 2, När ett tillräckligt antal peptider gjort detta kommer de att blida porer som tillåter passage av ämnen över cellmembranet. (Matsuzaki, 1998). I studier som gjorts för att undersöka denna porformering hos magainin 2 har synergistiska effekter av tillsats av PGLa iakttagigts. PGLa är också en membranaktiv peptid som återfinns i Xenopus Laevis hud. Förkortningen står för: peptid med glycinstart och leucinamid terminal. Den synergi som uppstår har troligtvis att göra med hur stor del av de respektive porformerande peptiderna som är hydrofobiska (Tremouilhac et al., 2006). Ett mindre antal peptider krävs för att bilda en por när båda finns närvarande. Båda peptiderna klarar av att bilda porer på egen hand, men gör det inte lika enkelt. 6
Magaininerna uppvisar selektiv cytotoxicitet gentemot mikroorganismer. Detta beror dels på ett större innehåll av fosfolipider med sur karaktär i tillexempel bakteriers cellvägg eller membran jämfört med i cellmembranen i däggdjursceller. Vidare stabiliseras däggdjurscellmembran av kolesterol, som saknar motsvarighet hos mikroorganismerna. Detta gör dem mindre känsliga för membranaktiva peptider (Matsuzaki, 1999). Att magaininerna naturligt sett förekommer i ett gemensamt prekursorprotein med en molekyl magainin 1 och 2 enheter magainin 2 kan ha en skyddande funktion för värdorganismen. Grodan utsätts inte kontinuerligt för peptider utan dessa bli aktiva först när prekursorproteinet av någon anledning spjälkas upp till de aktiva substanserna. Det bör även nämnas att magaininerna inte är hemolytiska. Magaininerna är även selektivt cytotoxiska mot tumörceller (Genco et al., 2003). Magaininer och läkemedelsutveckling. Ett stort antal magaininanaloger har utformats, syntetiserats och utvärderats med avseende på antimikrobiella och tumörhämmande egenskaper. Den substans som nått längst i läkemedelsutvecklingsavseende är MSI-78, eller pexiganan. Det är en 22 aminosyror lång magainin 2analog som var tänkt att användas som en i topikal beredning för behandling av fotsår som en komplikation vid diabetes. Krämen skulle säljas under namnet Locilex. Den lovande produkten fick dock aldrig ett försäljningsgodkännande av FDA (Moore, 2003). Peptidläkemedel är relativt dyra att framställa och kan vara instabila. I ett försök att undvika dessa problem har ett antal ämnen som kallas magaininmemetika utvecklats och undersökts. Två substanser, MSI-751 och MSI-774 testades med avseende på aktivitet mot anaeroba bakterier som kan orsaka orala infektioner med goda resultat. (Genco et al., 2003). 7
Referenser Berkowitz, B., A., Bevins, C., L., Zasloff, M., A., Magainins: A new family of membraneactive host defense peptides. Biochemical pharmacology, 1990, 4, 39, 625-629 Matsuzaki, K. Magainins as paradigm for the mode of action of pore forming polypeptides. Biochimica et biophysica acta, 1998, 1376, 391-400. Matsuzaki, K. Why and how are peptid-lipid interactions utilized for self-defens? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochimica et biophysica acta, 1999, 1462, 1-10. Zasloff, M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: Isolation, characterization of two active forms, and partial cdna sequence of a precursor. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 1987, 15, 84, 5449-5453. Tremouilhac, P., Strandberg, E., Wadhwani, P., Ulrich, A., S., Synergistic transmembrane alignment of the antimicrobial heterodimer PGLa/magainin. The journal of biological chemistry, 2006, 43, 281, 32089-32094. Rautenbach, M., Gerstner, G., D., Marè Vlok, N., Kulenkampff, J., Westerhoff, H., V., Analyses of dose-response curves to compare the antimicrobial activity of model cationic -helical peptides highlights the necessity for a minimum of two activity parameters. Analytical biochemistry, 2005, 11, 350, 81-90. Chopra, I. The magainins: Antimicrobial Peptides with potential for topical application. Journal of antimicrobial chemotherapy, 1993, 3, 32, 351-353. Genco, C. A., Maloy, W., L., Kari, U., P., Motley, M., Antimicrobial activity of magainin analogues against anaerobic oral pathogens. International journal of antimicrobial agents, 2003, 21, 75-78 Bellerby, C., W., The endocrine factors concerned in the control of the ovarian cycle xenopus laevis as a test animal. Biochemical journal, 1933, 3, 27, 615-620 Moore, A., The big and small of drug discovery. European Molecular Biology Organization Reports, 2003, 2, 4, 114 117. 8