CELLODLINGSHANDLEDNING

CELLODLINGSHANDLEDNING inom kursen Morfologisk metodik och Cellodling, 7.5hp Göteborg 2014-08 Ali-Reza Moslemi och Inger Johansson

LABORATION: TILLVÄXTKURVA PÅ AGS-CELLER INTRODUKTION Sterilarbete och avfall Att odla celler under flera dagar kräver steril miljö. All cellodlingsarbete som pågår inom forskning så väl som kliniskt sker under mycket kontrollerade former. Speciellt avsedda utrymmen förbereds för att fungera som cellodlingsutrymme. Här finns sterila arbetsbänkar, sk laminar air flow (LAF) bänkar, luftintagen bör vara utrustade med speciella luftfilter (HEPA) som hjälper till att förhindrar infektioner, samt öppna ytor för att minimera ansamling av damm och smuts. I dessa utrymmen har man ofta ett övertryck i luften för att luften skall strömma från cellodlingsutrymmet och ut när man öppnar dörrar till andra utrymmen, ett undertryck skulle öka risken för KONTAMINATION och infektion genom att dra in luft. Oavsett hur ren miljön i cellodlingsutrymmet är måste den som odlar ständigt tänka på att även arbeta sterilt. Att använda rock och handskar, torka av ytor som skall utnyttjas med 70 % etanol, tänka på var och hur man lägger skålar, flaskor, lock etc. Att inte jobba på en full bänk utan att arbeta systematiskt och med så lite material som möjligt framme på sin arbetsyta så att det finns utrymme. Utrymme samt lugn och ro skall eftersträvas vid cellodling för att minska kontaminationsrisken. Förutom sterilarbetet vid själva arbetsmomentet och dess omgivande miljö är det även mycket viktigt att tänka på avfall. Avfallet i form av celler, medier, material som varit i kontakt med celler och medier, skålar, pipetter osv. I möjligaste mån bör allt material AUTOKLAVERAS innan det kasseras. Detta för att ytterligare minska risken för en eventuell kontamination. Kontroll av celler i ljusmikroskop Celler i odling måste löpande kontrolleras för att visuellt bedöma deras tillstånd, morfologi, eventuell kontaminering och cellmediets näringsinnehåll (bedöms av färgen på mediet). Gör en visuell bedömning i ljusmikroskop av andelen levande och döda celler samt KONFLUENS, hur stor del av plattan som är täckt av celler. OBS!!! Lyft aldrig på locket (om du inte arbetar i en LAF-BÄNK). Tillväxtkurva på AGS-celler (som är en TUMÖRCELLINJE från magsäck) För att få säkra resultat vid experimentella försök i cellodling måste man lägga tid på att studera sin CELLINJE under normala förhållanden. Detta för att snabbt se en eventuell förändring i tex morfologi. Finns inte känslan för hur cellerna växer vid normala fysiologiska förhållande finns risk att man vid det experimentella upplägget studerar en artefakt eller en kontamination hellre än den effekt man vill detektera. Kontaminering De vanligaste kontaminationerna utgörs av SVAMP och MYKOPLASMA. JÄSTSVAMP, som i hög grad överförs från slemhinnor och hud, där de utgör en del av normalfloran, ses ofta i cellodlingar. Även mögelsvampar utgör en fara för cellkulturer då de trivs i laboratorier, tex i kylskåp, fönster och väggar, i samband med byggnadsarbeten osv. Svampar är resistenta mot de flesta antibiotika med antibakteriell verkan. På grund av detta är det mycket viktigt att alltid arbeta sterilt vid cellodling. Mykoplasma är den minsta och enklaste mikroorganism som kan föröka sig i en cellfri miljö. Mykoplasma är en bakterie men skiljer sig från vanliga bakterier eftersom de saknar cellvägg. De är mycket svåra att detektera och kräver speciella analyser. De kan göra stor skada på cellerna, förändrar tillväxten och direkt påverka dess produktion av proteiner osv. Förutom svamp och mykoplasma förekommer också kontamination av BAKTERIER. 2

I odlingsmedier och lösningar kan kontamination av både svamp och bakterier konstateras genom färgomslag på mediet, oklarhet eller flockaktig växt. Vid all kontaminering bör de infekterade cellerna avlägsnas direkt, gärna genom autoklavering först. Kontaminering sprids mycket fort och kan snabbt infektera ett helt cellodlingslaboratorium. Upptäcker man kontaminering får man inte under några omständigheter lyfta på locket, detta kan snabbt leda till fortsatt spridning av infektionen. För värdefulla cellkulturer kan bakterieinfektioner behandlas, men detta bör dock undvikas och man skall vara väl medveten om risken för vidare spridning är mycket stor. Odlingsbetingelser Cellodlingsmediet innehåller de ingredienser som är nödvändiga för cellerna att växa. Dessa utgörs av AMINOSYROR, VITAMINER, NÄRINGSÄMNEN, ORGANISKA SALTER och FENOLRÖTT. Till detta behövs lämplig fysikalisk miljö för syrsättning, ph-balans och temperatur. Detta uppnås genom att cellerna förvaras i plattor eller flaskor som tillåter gasutbyte och placeras i inkubator med 5% CO 2 vid 37 C. Celler i odling infekteras lätt eftersom de saknar de försvarsmekanismer som naturligt finns i organismer och för att cellodlingsmediet innehåller alla de ingredienser som också är nödvändiga för bakteriernas överlevnad. I de allra flesta medier idag används därför ANTIBIOTIKA vilket hjälper till att förhindra bakteriekontamination. Långtidsförvaring av cellinjer Möjligheten att långtidsförvara cellinjer är mycket värdefull. Detta görs genom nedfrysning av cellsuspensionen. Nedfrysning säkerställer den specifika cellinjens fysiologiska egenskaper samtidigt som den skyddar mot infektioner. Nedfrysning sker efter tillsats av KRYOSKYDDANDE ämnen vilka förhindrar cellerna att förstöras under frysningsprocessen. DIMETYLSULFOXID (DMSO) är ett av de mest använda kryoskyddande ämnet idag. DMSO används i koncentrationen 5-10 % och är både lågmolekylärt och lättlöslig i vatten, den diffunderar och verkar därför både intra- och extracellulärt. Vid nedfrysning skall LÅNGSAM TEMPERATURSÄNKNING eftersträvas, 1-3º per minut till ungefär -70º därefter en snabbare sänkning ner till förvaringstemperatur som variera beroende på var cellsuspensionens skall förvaras, -120º (i frys) till -196º (i flytande kväve). Långsam nedfrysning är viktigt för att cellerna skall hinna avge tillräcklig mycket vatten till den extracellulära vätskan genom osmos vilket förhindrar isbildning intracellulärt. Intracellulär isbildning har stor betydelse på cellerna viabilitet efter nedfrysning. Efter en korrekt utförd nedfrysning kan cellsuspensionen förvaras många år. Nästa kritiska moment innan cellerna kan användas igen är SNABB UPPTINING av den frysta cellsuspensionen. KRYORÖR med cellsuspension skall gå direkt från frysen till 37ºC vattenbad och därefter direkt till odlingsskål med komplett medium. Det kryoskyddande ämnet kan vid längre tids exponering eller i för hög koncentration vara toxiskt för cellerna. En snabb hantering skyddar därför cellerna genom att minimerar tiden med det kryoskyddande ämnet, samt ger snabb tillgång till den viktiga näringen som finns i mediet och som så väl behövs för viabiliteten. Serum som ingår som tillsats i mediet (KOMPLETT MEDIUM) neutraliserar den toxiska effekten av det kryoskyddande ämnet DMSO. Tillväxtkurvor För att man skall ha de mest optimala förhållanden i sina försök är det mycket viktigt att känna till cellernas morfologi, näringsbehov, odlingskrav och tillväxthastighet. Detta eftersom celler som växer för tätt, som uppnått KONFLUENS, kan hämma tillväxten. Likaväl som vid 3

motsatta förhållanden, när de växer för glest och inte får tillgång till närliggande cellers proteinsekretion försämrar dess tillväxt. En tillväxtkurva kan göras på vilken cellinje som helst. Det man göra är att man sår ut en känd mängd celler som man inkuberar 4-7 dagar, utsådden görs så att två brunnar kan skördas och räknas varje dag fram till dag 7. Genom att rita upp en kurva där antalet räknade celler står mot tid i odling kan kurvans lutning beräknas och därmed även tillväxthastigheten. Detta är resultat som är mycket värdefulla för vidare experiment och utgör en grundläggande kunskap för varje cellodlare. Accutase är en enzymblandning med både proteasaktivitet och collagneasaktivitet, som hjälper till att lösgöra adherenta celler utan att skada dem, vilket ger en bra återhämtning och minimerar påverkan på membranproteiner. Trypanblått är en färglösning för räkning av döda celler i ljusmikroskop. Döda celler tar upp trypanblått och färgas blå, medan viabla celler förbli ljusa. Står de för länge kommer dock även de viabla cellerna att färgas. 4

ÖVERSIKT ÖVER LABORATIONEN: A: Utsådd av celler, dag 0 B: Skörd och kontroll av tillväxt, dag 3-6 C: Byte av cellodlingsmedium i brunnarna, dag 3 och 5 D: Framställning av tillväxtkurva och beräkning av dubbleringstid A: UTSÅDD, DAG 0 Material Cellodlingsflaska innehållande konfluenta C2C12-celler DMEM Fetalt kalvserum (FCS) Penicillin-Streptomycin (PEST) Insulin Fibroblast Growth Factor (FGF) Trypsin STERILA 12-hålspattor STERILA ENGÅNGSPIPETTER, 10 ml 15 ml falcon centifugrör, 1.5 mleppendorfrör Bürkerkammare med täckglas Trypanblått, 0.4 % Design av 12-hålsplatta Tänk igenom hur plattan skall designas för att enkelt och varje dag under dag 3-6 skörda två brunnar, detta med tanke på minsta möjliga risk för kontaminering. Märk 12-hålsplattan väl med respektive dag. Förbered cellsuspension av C2C12-celler Gör i ordning cellsuspension för utsådd. Cellsuspension skall vara 0.2x10 5 celler/ml. ARBETA STERILT punkt 1-9 och 12-13. 1. Studera cellerna i invertmikroskop. 2. Aspirera och kassera mediet från petriskålen med en steril pipett. 5

3. Skölj med PBS genom att tillsätta 10 ml försiktigt till petriskålen, tippa skålen ett par gånger så PBSen sköljer över cellerna. Aspirera all PBS med pipett och kassera. 4. Upprepa punkt 2 en gång. 5. Tillsätt 1 ml trypsin, inkubera skålen i 37 o C, 5 min. 6. Tillsätt 3 ml cellodlingsmedium till skålen. Blanda ordentligt genom att pipettera upp och ner några gånger, så att cellerna lossnar från plasten. OBS - pipettera försiktigt så att det inte bildas luftbubblor. Kontrollera att cellrna har lossnat från plasten (invertmikroskop) Överför cellsuspensionen från skålen till ett 12 ml falconrör (centrifugrör). 7. Centrifugera vid en hastighet av 400 x g under 5 min. 8. Sug upp supernatanten och resuspendera cellerna i 1 ml cellodlingsmedium. Bestäm cellkoncentrationen med Bürkerkammare: 9. Tag 20 µl av cellsuspensionen med en steril pipettspets och för över till ett eppendorfrör. Ställ in falconröret, med locket på glänt, i inkubatorn så att cellerna inte dör medan du räknar. 10. Blanda cellsuspensionen i eppendröret med 0.4% trypanblått i förhållandet 1:1. 11. Tillsätt ca 10 µl av lösningen från punkt 10 till Bürkerkammare, se anvisningar på sidan 11. Räkna antal celler i 3 st A-rutor och beräkna därefter koncentrationen levande celler. 12. Cellsuspensionen ska nu spädas för utsådd i 12-hålsplattan. Totalt kommer det att behövas 8x2 ml + 1 ml extra = 17 ml, utspädd cellsuspension per laborationspar. Räkna ut hur stor mängd av cellsuspensionen (falconröret) det behövs för att få en slutkoncentration av 0.2x10 5 celler/ml i en volym av 17 ml. 13. Flytta rätt mängd cellsuspension till ett 50 ml falconrör. Tillsätt sedan cellodlingsmedium så att totalvolymen blir 17 ml. 14. Pipettera 2 ml cellsuspension per brunn till 8 st brunnar i din 12-hålsplatta, inkubera plattan i 37 o C och 5% CO 2. 6

B: SKÖRD OCH KONTROLL AV C2C12-CELLER, Dag 3-6 Material PBS Trypsin 1,5 ml eppendorfrör Bürkerkammare med täckglas Trypanblått, 0,4% Skörda och beräkna antalet C2C12-celler 1. Studera cellodlingsplattan i invertmikroskop. Notera tätheten av cellmattan. 2. Aspirera mediet från två brunnar. 3. Skölj varje brunn försiktigt med PBS genom att tillsätta 2 ml på kanten av brunnen och låt skölja över cellerna. Aspirera all PBS med pipett och kassera. 4. Tillsätt 1 ml trypsin till var och en av de två brunnarna och inkubera i 37 o C, 5 min. 5. Studera de trypsinbehandlade brunnarna i invertmikroskop, för att kontrollera att cellerna har lossnat från plasten. 6. Blanda suspensionen i brunnarna ordentligt genom att pipettera upp och ner några gånger, och överför sedan cellsuspensionen till eppendorfrör, ett rör för varje brunn. Var noga med att suga upp all vätska ur brunnarna så att inga celler lämnas kvar i brunnen. 7. Ställ tillbaka cellodlingsplattan i inkubatorn. Bestäm cellkoncentrationen med Bürker-kammare 8. Blanda 20 µl av cellsuspensionen med 0.4% trypanblått i förhållandet 1:1. 9. Räkna 3 st A-rutor och beräkna koncentrationen levande celler. Använd nedanstående tabell vid beräkning av cellkoncentration. TABELL Dag 3 Dag 4 Dag 5 Dag 6 Brunn A-ruta Antal Konc Antal Konc Antal Konc Antal Konc 1 A1 xxx xxx xxx xxx A2 xxx xxx xxx xxx A3 xxx xxx xxx xxx medel 2 A1 xxx xxx xxx xxx A2 xxx xxx xxx xxx A3 xxx xxx xxx xxx medel 7

C: BYTE AV CELLODLINGSMEDIUM I BRUNNARNA: Byte av medium sker dag 3 och 5. OBS - byt medium bara i de brunnar som ska fortsätta odlas i inkubatorn. 1. Sug försiktigt, med steril pipett, upp allt medium från brunnen. Undvik att skrapa pipetten i botten eftersom cellerna då lossnar. Kassera mediet. 2. Tillsätt 2 ml nytt cellodlingsmedium. 3. Placera plattan i inkubatorn. 8

D: FRAMSTÄLLNING AV TILLVÄXTKURVA: Beräkning av tillväxthastighet Rita upp en tillväxtkurva med logaritmisk skala på y-axel där antalet celler/ml markeras och x-axeln där tid anges i dagar. För varje skörd plotta cellkoncentrationen i figuren för att slutligen dag 7 få en hel tillväxtkurva som används för att beräkna dubbleringshastigheten. Se exempel på tillväxtkurva samt övrig information för uträkning nedan. Tillväxtkurva med cellkoncentration (y-axel) mot tid i odling (x-axel) 6 5 4 Korrekt skala Loggade värden log(10 4 ) = 4. Beräkning av fördubblingstiden För beräkning av fördubblingstiden av C2C12-celler plottas antalet celler/ml in på y-axeln av en logaritmisk skala. OBS - använd logaritmerade värden på koncentrationerna, enligt skalan till vänster. På motsvarande x-axel markeras tiden. Start markeras som 0. Beräkning görs lättast utifrån den linjära delen av kurvan (log-fasen där cellerna har en exponentiell tillväxt). Riktningskoefficienten (k) beräknas och fördubblingstiden (t) bestäms som: t = log(2) / k. Eftersom log(2) = 0.301, kan formeln skrivas: t = 0.301 / k. Välj två punkter på y-axeln inom vilka kurvan är linjär, läs av (y1; y2). Läs sedan av motsvarande värden på x-axeln (x1; x2) Se bild nedan. Riktningskoeficienten (k) för den linjära delen av kurvan är då: (y2 - y1) / (x2 - x1). Fördubblingstiden blir alltså 0.301/k dagar. 9

RAPPORTERING Ange fördubblingshastigheten av dina celler, illustrera med diagram. Diskutera orsaken till kurvans utseende, och eventuella avvikelser från den förväntade tillväxtkurvan. Har det skett någon kontamination, och hur såg det i så fall ut (växtsätt, morfologi, överlevnad)? Förslag på agens? Maila in rapporten till respektive handledare, senast 21e september: ali-reza.moslemi@gu.se eller inger.johansson@gu.se 10

Cellräkning med Bürkerkammare Bürkerkammare och täckglas ska vara omsorgsfullt rengjorda i vatten och sprit. Täckglaset sätts på genom att fukta åsarna och sedan försiktigt trycka på glaset så att Newtons färgringar bildas. Ta 10 µl av cellsuspensionen färgad med trypanblått och låt vätskan glida in under täckglaset i den ena kammaren. Ev. överflödig vätska torkas bort med kleenex. Varje fält på räknekammaren är med dubbellinjer uppdelad i 9 rutor, varje sådan ruta (A-ruta) rymmer 0.1 µl. A-rutan är delad i 16 st fält, B-rutor (se fig. nedan). Vid räkning av celler i en A-ruta räknas alla celler som ligger på eller tangerar den högra och den övre gränslinjen. Celler som ligger på eller tangerar den vänstra eller nedre gränslinjen räknas ej. Räkna minst 100 celler, gärna flera A-rutor och använd medelvärdet för koncentrationsberäkning. Antalet viabla celler/ml = viabla celler i en A-ruta x 10 4 x spädningen 11