LABORATION 2 MIKROSKOPET Personnummer Namn Laborationen godkänd Datum Assistent Kungliga Tekniska högskolan BIOX 1 (6)
LABORATION 2 MIKROSKOPET Att läsa i kursboken: sid. 189-194 Förberedelseuppgifter: Vad labben går ut på: Utrustning: 2 st, se nedan. Skall vara gjorda före labtillfället. Karaktärisera mikroskopets olika delar Bygga ett mikroskop Bestämning av förstoring Studera fasobjekt med schlierenmetoden. Mikroskopobjektiv med 16 ggr förstoring Fasobjekt Fiberljuslampa Retikel med fingraderad skala Linser till okular, kollimator och kondensor Skena, ryttare, hållare, etc. TEORI Mikroskopet är ett sammansatt linssystem som används för att förstora små föremål och har kommit att bli ett standardinstrument på de flesta arbetsplatser inom forskning, utveckling och laboratoriearbete. I den här labben skall du få bekanta dig med hur ett mikroskop fungerar. Det första teoriavsnittet behandlar mikroskopets uppbyggnad och hur bilden av ett vanligt objekt uppkommer. Med ett vanligt objekt menar vi ett objekt som enkelt kan urskiljas p. g. a. att intensiteten varierar över dess yta när det belyses. Inom många tillämpningar förekommer s. k. fasobjekt. Ett fasobjekt är ett föremål som är i stort sett helt transparent vid genomlysning, t. ex. en cell. Ett helt transparent objekt kan inte på ett enkelt sett ses i ett mikroskop eftersom det inte finns några intensitetsvariationer som ögat kan urskilja. Genom att använda speciella faskontrastmetoder kan man ändå få dessa objekt att framträda. En sådan metod beskrivs i teoriavsnitt två. Laborationen går ut på att du själv skall bygga ihop ett mikroskop och sedan studera både vanliga objekt och fasobjekt. Mikroskopets uppbyggnad Mikroskopet är i huvudsak uppbyggt av ett objektiv (eng. objective) och ett okular (eng. eyepiece). Objektivet sitter närmast det objekt som skall studeras och ger en förstorad positiv bild av objektet, den s. k. mellanbilden. Objektivet har en positiv brytkraft och kan i princip bestå av en enda positiv lins, men kommersiella objektiv består normalt av ett antal linser så att aberrationer kan minimeras och den numeriska aperturen maximeras. Okularet är också ett linssystem med positiv brytkraft. i det enklaste fallet består okularet av en enda positiv lins, men en vanligare konfiguration är det s. k. ramsdenokularet som består av två planokonvexa linser. Linserna har de krökta ytorna vända mot varann för att reducera den sfäriska aberrationen. Okularet fungerar som en lupp och förstorar upp mellanbilden från objektivet till en virtuell slutbild. Fig. 1 illustrerar strålgången i ett mikroskop, där objektiv och okular för enkelhets skull antagits vara tunna linser. Objektet som skall studeras placeras strax bortom objektivets ena fokalpunkt. Mellanbildens läge, d. v. s. den reella bild som objektivet ger upphov till, tas fram genom att dra tre strålar: den obrutna strålen från objektet genom objektivets mitt och strålarna genom främre respektive bakre fokalpunkterna, F1 och F1'. Okularet placeras sedan så att mellanbilden hamnar strax framför okularets vänstra fokalpunkt. Avstånden från respektive fokalpunkter är för tydlighets skull överdrivna: objektet ligger i själva verket mycket nära F1 och mellanbilden mycket nära F2. En person som ser genom okularet kommer nu att se en förstorad virtuell bild. Den virtuella bildens läge konstrueras genom att först dra den stråle från mellanbilden som går Kungliga Tekniska högskolan BIOX 2 (6)
genom okularets mitt och därför inte bryts. Sen drar man strålen som är parallell med optiska axeln och därmed passerar okularets högra fokalpunkt F2'. Genom att strecka denna stråle bakåt ser man den virtuella bildpunktens läge, d. v. s. den punkt som strålarna efter okularet skenbart utgår ifrån. OBJEKTIV OKULAR h F' F F' 1 2 2 F 1 h' h" Fig 1. Strålgången i ett mikroskop I många fall brukar man lägga en glasskiva med ett färdigt mönster i det plan där mellanbilden hamnar, en s. k. retikel. Eftersom okularet är inställt att avbilda detta plan ser man både skalan på retikeln och bilden av objektet skarpt på samma gång. Om mönstret på retikeln t. ex. utgörs av en millimeterskala kan man direkt se hur stor mellanbilden är. Eftersom objektivets förstoring alltid kan tas fram kan man sedan enkelt räkna ut det ursprungliga objektets storlek. Låt oss nu bestämma förstoringen i mikroskopet. Antag att höjden av objektet är h, höjden av mellanbilden h', höjden av slutbilden h", fokalvidden för objektivet f'1, fokalvidden för okularet f'2 och avståndet mellan objektiv och okular d. Ojektivets laterala förstoring h'/h kan beräknas genom att betrakta strålen från objektet som går igenom objektivets bakre fokalpunkt F' 1. Likformiga trianglar ger, m obj h' h d f ' f ' f ' 1 2 = = (1) 1 I formeln ovan har vi utnyttjat att mellanbilden ligger mycket nära okularets främre fokalpunkt F 2. Avståndet d f 1 f 2 kallas tublängden och brukar normalt sättas till 160 eller 170 mm. Riktigt bra kommersiella objektiv kan komma ner till en fokallängd på cirka 3 mm och därmed en förstoring på runt 60 ggr. Den laterala förstoringen i okularet beror på var bilden hamnar, eftersom slutbildens höjd växer proportionellt med avståndet till okularet. Avståndet kan ställas in rätt godtyckligt genom en lätt justering av okularets läge. I stället för att beräkna den laterala förstoringen kan vi jämföra synvinkeln som mellanbilden upptar när den betraktas på bekvämt synavstånd utan okular med synvinkeln som den virtuella slutbilden upptar när okularet är på plats. Normalt synavstånd brukar sättas till q = 250 mm. Om vi tittar på mellanbilden på detta avstånd upptar den ungefär vinkeln α s = h' / q. Ur fig. 1 ser man att synvinkeln med okular, det vill säga vinkeln mellan optiska axeln och strålen som går genom okularets mitt, blir α = h' / f ' ok 2. Vinkelförstoringen är nu kvoten mellan dessa båda synvinklar, Kungliga Tekniska högskolan BIOX 3 (6)
M = α α ok ok = q q f ' 2. (2) Typiska värden på okularets förstoring ligger på runt 5 till 10 ggr. Den totala förstoringen M i mikroskopet är produkten av objektivets och okularets förstoring, M d f ' f ' q = m (3) f ' 1 2 obj M ok = f ' 1 2 FÖRBEREDELSEUPPGIFT 1: Vilken brännvidd har ett okular som förstorar 10 ggr? Utöver objektiv och okular brukar mikroskopet också ha en kollektorlins för att samla ihop ljus från en ljuskälla och en kondensorlins för att fokusera ljuset på objektet och därmed belysa det, se fig. 2. Både kollektorn och kondensorn kan också utgöras av sammansatta linssystem. Vid belysning kan objektivet, i likhet med alla andra avbildande system, bara acceptera infallande strålar med en viss maximal infallsvinkel u mot optiska axeln. Normalt brukar man inte ange maximalvinkeln för ett linssystem utan istället sin u. Denna storhet kallas för den numeriska aperturen (N.A.). Kondensorlinsen bör väljas så att infallsvinkeln w' på randstrålarna inte överskrider u, annars går en del av ljuset i belysningen förlorat. Uppsamlingsvinkeln w för kollektorn skall vara så stor som möjligt för att inget ljus från källan skall gå förlorat. Kollektor och kondensor avbildar tillsammans ljuskällan på objektivet. I konstruktionen av belysningssystemet måste man också ta hänsyn till storleken hos bilden av ljuskällan. Bilden bör inte vara större än objektivets inträdespupill, d. v. s. den maximala bredd på ett strålknippe som kan tas upp i objektivet. Fig. 2. Uppställning för belysning av objektet i ett mikroskop. FÖRBEREDELSEUPPGIFT 2: Ett objektiv har den numeriska aperturen 0.25. Vilken infallsvinkel får infallande strålar maximalt ha för att kunna fångas upp av objektivet? Fasobjekt och faskontrast När vi håller upp ett delvis transparent föremål mot en ljus bakgrund uppfattar ögat främst intensitetsvariationer. Om vi till exempel betraktar ett par dammiga glasögon ser dammkornen mörkare ut än det omgivande glaset eftersom ljuset absorberas. I en del mycket tunna objekt, t. ex. celler, är variationerna i absorption så små att kontrasten blir mycket dålig. Objektet kan inte urskiljas från bakgrunden. Nu bör man lägga på minnet att ljuset är en vågrörelse och karaktäriseras både av sin amplitud och sin fas. Det elektriska fältet i en viss punkt hos en ljusvåg varierar som e ( t) = a sin( ω t + δ ), (4) där t är tiden, a amplituden, ω vinkelfrekvensen och δ fasvinkeln. Två vågor kan ha samma amplitud men olika fas. Fasvinkeln för en våg ändras i vågens färdriktning med 2π per tillryggalagd våglängd. Notera att det är den tillryggalagda optiska väglängden, d. v. s. Kungliga Tekniska högskolan BIOX 4 (6)
brytningsindex gånger den faktiskt tillryggalagda sträckan, som räknas. Ljuset som passerar tunna transparenta objekt tillryggalägger olika optisk vägsträcka i olika delar av objektet, dels. p. g. a tjockleksvariationer dels p. g. a. att brytningsindex kan variera. Ljuset kommer därför att fasförskjutas olika mycket i olika delar av objektet. Ett sådant objekt brukar kallas för ett fasobjekt. Faskontrastmetoder går ut på att omvandla fasskillnaderna hos ett fasobjekt till synliga intensitetsvariationer. Grunden för alla sådana metoder är att även om ett fasobjekt inte ger upphov till intensitetsvariationer när det genomlyses så sprider det ljuset på grund av diffraktion. Schlierenmetoden bygger på att man med hjälp av två komplementära aperturer (den ena aperturen blockerar där den andra är transparent) konstruerar belysningssystemet i mikroskopet så att om inte objektet sprider ljuset så kommer inget ljus att passera och bilden blir mörk. Från de områden i objektet där man har spridning (kanter på fasobjekt etc.) får man igenom ljus och dessa framträder som ljusa i bilden. Principen för metoden framgår av Fig 3. Fig 3. Schlierenmetoden En ljuskälla belyser ett objekt som sedan avbildas av objektivet. Mellan ljuskällan och objektet sitter en apertur (i figuren en enkel knivsegg) som begränsar de belysande strålknippena. Efter objektivet får man inte bara en bild av objektet utan även av aperturen. Alla strålar från ljuskällan, som inte ändrar riktning genom objektet, måste passera förbi både aperturen själv och bilden av densamma. Stråle 1 och 2 är exempel på två sådana strålar genom en punkt i objektets överkant. Om vi nu placerar en komplementär apertur i samma plan som bilden av aperturen med en sådan form att den tillsammans med bilden av aperturen utgör ett heltäckande strålstopp kommer stråle 1 och 2 effektivt att blockeras. Det innebär att allt ljus som passerar objektet utan att spridas av diffraktion kommer stoppas av den komplementära aperturen. Stråle 3 i figuren, däremot, motsvarar ljus som p. g. a. diffraktion ändrat riktning genom fasobjektet. Detta ljus kan passera genom systemet och ger upphov till ljusa delar i bilden som motsvarar områden i objektet med stor diffraktion. Fasobjektet har omvandlats till en bild med intensitetsvariationer som vi kan se med ögat! Kungliga Tekniska högskolan BIOX 5 (6)
INSTRUKTIONER 1. Du skall nu själva få bygga ihop ett mikroskop steg för steg. Komponenterna skall ställas upp längs med den optiska skena som finns på labbplatsen, och du måste alltså titta parallellt med skenan för att se den förstorade bilden. Till ditt förfogande har du en lysdiod, ett antal linser, ett mikroskopobjektiv och ett par hållare. Bygg först ett belysningssystem på ena änden av skenan så att objektet kan belysas i sin hållare. Ta hänsyn till objektivets prestanda och tänk på att lämna utrymme så att resten av mikroskopet får plats. 2. Försök nu att sätta det vanliga mikroskopobjektivet på plats. På din labplats finns en retikel med graderad millimeterskala. Använd denna som objekt och gör en avbildning med hjälp av objektivet. Lokalisera den positiva bild, mellanbilden, som alstras av objektivet och mät upp förstoringen. 3. Du kan använda en positiv lins som okular. Välj en lins så att okularet förstorar cirka 10 ggr. Installera okularet och betrakta retikeln genom mikroskopet. Finns det synliga aberrationer? Beräkna totalförstoringen i mikroskopet. 4. Sätt in retikeln i en hållare på lämplig plats längs skenan. Betrakta ett antal vanliga objekt genom mikroskopet och beräkna deras riktiga storlek. 5. Bygg nu om din uppställning för att kunna titta på fasobjekt med schlierenmetoden. Tänk på att placera aperturen så att hela objektet blir belyst. För underlätta inplaceringen av den komplementära aperturen kan du behöva byta ut mikroskopobjektivet mot en lins med längre fokallängd. Jämför kontrasten för några fasobjekt med respektive utan komplementär apertur. Kungliga Tekniska högskolan BIOX 6 (6)