Filtrering av mjölk för analys av Bacillus cereussporer och Clostridium tyrobutyricum-sporer

Branschintern Rapport nr 7024-I 2003-10-06 Filtrering av mjölk för analys av Bacillus cereussporer och Clostridium tyrobutyricum-sporer Kerstin Ekelund, Hiroshi Ogura, Irena Ollermark, Amanda Monthán, Anders Christiansson och Birgitta Svensson Svensk Mjölk Forskning Telefon 0771-191900 E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se

Filtrering av mjölk för analys av Bacillus cereus-sporer och Clostridium tyrobutyricum-sporer Kerstin Ekelund, Hiroshi Ogura, Irena Ollermark, Amanda Monthán, Anders Christiansson och Birgitta Svensson 1. Inledning Bakteriesporer är ett problem för mejeriindustrin eftersom de överlever den lågpastörisering av mjölken som görs på mejeriet för tillverkning av k-mjölk och ost. För k-mjölken är det sporer av Bacillus cereus, en aerob, Gram-positiv, katalaspositiv, sporbildande stav, som ställer till bekymmer. B. cereus är vanligt förekommande i jord och kan via smutsiga spenar hamna i mjölken. B. cereus kan dessutom kontaminera mjölken via utrustning på gården och mejeriet. Vid osttillverkningen är det smörsyrabildande klostridier som ställer till problem. Av störst betydelse vid osttillverkning är Clostridum tyrobutyricum, en anaerob, Gram-positiv, katalasnegativ, sporbildande stav. Klostridiesporerna är också vanligt förekommande i jord. Vid inläggning av ensilage kan klostridiesporer hamna i grönmassan och om ensileringsförhållandena inte är optimala kan mycket höga halter klostridiesporer bildas i ensilaget. Klostridieporerna äts upp av kon och kommer sedan ut i gödseln. Därifrån kan de via smutsiga spenar hamna i mjölken. Jämfört med halten av vegetativa bakterier förekommer sporerna i ett lågt antal i mjölken och därför är det svårt att bestämma antalet sporer i mjölken. Och oavsett vilken metod man väljer så måste mjölken först värmebehandlas för att avdöda de vegetativa bakterier som förekommer. På mjölkbedömningen används ett MPN-system för att få en uppfattning om i vilken storleksordning sporerna förekommer i leverantörsmjölk. I denna rapport presenteras en filtreringsmetod som ger ett mer exakt värde på antalet sporer som förekommer i mjölken. För att kunna filtrera mjölk måste man även förbehandla den så att man finfördelar fettet och proteinerna så att dessa inte stoppar igen filtret. Nedan följer en detaljerad beskrivning av filtreringsmetoden. 2. Princip 100 g mjölk (10-100 g mjölk) värmebehandlas, förbehandlas och filtreras (se flödesschema i Bilaga sidan 6). Vid analys av B. cereus lägges filtret på en blodagarplatta med polymyxin och inkuberas aerobt vid 20 C ±1 C i 48 tim ±3 timmar. Vid analys av klostridier lägges filtret på RCM-agarplatta med D-cykloserin och inkuberas anaerobt vid 37 C ±1 C i 72 timmar ± 3 timmar. Filtrering utförs i dubbelprov. 3. Utrustning Till 6 filtreringar (3 prov x 2 filtreringar) behövs: - Autoklaverbar 6-kanals filtreringsutrustning i rostfritt stål för 47 mm membranfilter - Vacuumpump - Lufttrycksmätare - 2 st. mellanflaskor - Slangar 2

- Vattenbad +72 C +2,5 C. För att uppnå +72 C i mjölkprovet måste vattenbadets termostat ställas på +74,5 C. - Vattenbad +55 C + 2 C. För att uppnå +55 C i mjölkprovet måste vattenbadets termostat ställas på 57 C. - Inkubationsskåp 20 C ±1 C - Inkubationsskåp 37 C ±1 C - Anaerobklocka (vid analys av klostridier) - Snabbvåg - Stomacher - 6 st sterila stomacherpåsar, volym 400 ml - 6 st tvättklämmor eller gem - 7 st membranfilter 47 mm porstorlek 0,8 µm med rutor (Aka filter 11404-47-ACN) - Pincett för hantering av filter (ska gå att sterilisera) - Sterila engångsfilter, Millipore 0,22µm för sterilfiltrering av trypsin och D-cykloserin - Plastsprutor för sterilfilter (Millipore) volym 20 ml - 6 st 100 ml flaskor för invägning av trypsin - 6 st sterila 100 ml flaskor för trypsinlösningen - 6 st flaskor med 100 ml steril 1 % tritonlösning - Sterilt avjoniserat vatten på 100 ml flaskor ca 15 stycken á 100 ml - Stereomikroskop - Petriskålar 9 cm diameter - 2 st bägare - Sax - 3 st tidur - 2 termometrar kalibrerade med referenstermometer - Värmeskåp 180 C för torrsterilisering av 6 st rostfria trattar med lock och 6 st filterhållare till filtreringsutrustningen. - Autoklav - Värmeplatta - Tryckkokare för smältning av substrat 4. Kemikalier - 0,1 M Trisbuffert ph 7,8 (Tris (hydroxymethyl)-aminomethan, Merck 1.08382.500 M=121,14 g/mol) Väg upp 12,114 g Tris i 1000 ml avjoniserat vatten. Ställ ph till 7,8 med 6M HCl (ca 12 ml HCl per liter). Lösningen fövaras i kylskåp. - 2% Trypsinlösning (1:250, Difco 215 240 köpes hos Boule) 0,5 g trypsin löses i 25 ml Trisbuffert ph 7,8, skakas om väl och sterilfiltreras efter 15 minuter i rumstemperatur och användes direkt, eftersom trypsin inaktiveras med tiden. Se nedan under filtreringsförfarandet när det är lämpligt att blanda och sterilfiltrera trypsinlösningen. OBS! Använd munskydd och iakttag stor försiktighet vid invägning av trypsin. Trypsin är ett enzym och i pulverform kan det vid inandning ge skador på andningsvägarna. - 1% Triton X 100 (Merck 1.08603.1000) 10 g Triton löses i 1000 ml 50 C avjoniserat vatten, och fördelas på flaskor 100 ml/ flaska. Flaskorna autoklaveras 121 C i 15 minuter. Förvaras i rumstemperatur. - 95% alkohol i bägare för flambering av sax och pincett. - 70% alkohol i en liten bägare för teflonpackningarna, som tillhör filtreringsutrustningen. 3

För B. cereus-analys - Blodagarbas (Oxoid No2 CM271) 95 ml/flaska. Kan förvaras i kylskåp 4 månader. - Nötblod i citrat (Statens Veterinärmedicinska anstalt). Hållbar i kyl 3 veckor. - 0,1% Polymyxin B sulfat (Sigma). 100 mg polymyxin löses i 100 ml avjoniserat vatten. Lösningen sterilfiltreras och fördelas på sterila rör. Polymyxinlösningen kan frysförvaras upp till 6 månader. Lösningen kan tinas och frysas om en gång. - 7 st Blodagarplattor med polymyxin. 95 ml blodagarbas + 5 ml nötblod i citrat + 1 ml 0,1% polymyxin. OBS! Färdiggjutna plattor torkas under natt i rumstemperatur och kan förvaras två veckor i kyl. - Mosselagar (Merck 5267) för konfirmering av B. cereus, 90 ml/flaska. Hållbar i 2 månader i kylen - Ägguleemulsion (Oxoid) - Mosselagarplattor. 90 ml Mosselagar + 10 ml ägguleemulsion. Färdiggjutna plattor torkas under natt i rumstemperatur och kan förvaras två veckor i kylen. För klostridie-analys - RCM (Reinforced Clostridial Medium, Oxoid CM149) - Agar bakteriologisk ((agar nr 1) L11 Oxoid) - RCM-agar. Väg in 38 g RCM-pulver och 12 g agar i 1000 ml avjoniserat vatten. Koka upp så att agarn löses. Fördela på flaskor med 100 ml per flaska. Autoklavera 15 minuter vid 121 C. Hållbar 4 månader i kyl. - 2% D-cykloserinlösning. 2 g D-cykloserin (Sigma) löses i 100 ml avjoniserat vatten. Lösningen sterilfiltreras och fördelas på sterila rör. Förvaring i frys 12 månader. Lösningen kan tinas och frysas om en gång. - 7 st RCM agar plattor med D-cykloserin.100 ml RCM-agar + 1 ml 2% D- cykloserinlösning. OBS! Färdiggjutna plattor torkas under natt i rumstemperatur och kan förvaras 2 veckor i kylen. 5. Filtrering av mjölk (6 filtreringar åt gången (3 prov x 2)) - Starta vattenbaden 72 C + 2,5 C och 55 C + 2,0 C - Upptining av mjölkprov Det antal mjölkprov som skall filtreras under dagen tas fram från frysen och tinas försiktigt. Ställ frusna provburkar (200 ml mjölk) i ljummet vatten och låt stå i ca 30 minuter. Byt vatten då och då och skaka om provburkarna då och då. OBS! mjölkprovens temperatur skall ej överstiga 10 C vid upptiningen. Om temperaturen blir för hög i provet finns en risk att sporerna börjar gro och då kommer de att avdödas vid värmebehandlingen. Tänk på att vattnets nivå ska vara högre än mjölkens i provburken. Kolla noga att provburkarna är täta. (OBS! Locket kan öppnas ibland vid upptining). Upptining tar ca 2 timmar. - Ställ 7 st flaskor med 100 ml sterilt avjoniserat vatten för temperering i 55 C vattenbadet - Tag fram färdiggjutna agarplattor och låt dem stå i rumstemperatur tills de används. - Väg upp trypsinpulver i 6 st torra 100 ml flaskor (0,5 g trypsin / flaska) och låt stå mörkt i rumstemperatur tills de används. OBS! trypsin kan vara uppvägt i förväg. - Sätt in några flaskor med sterilt avjoniserat vatten i kylen (<6 C) för spädning av mjölk till 100 g. - Väg in 10-100 g (beroende på förväntad sporhalt och filtrerbarhet) av alla proven direkt i Stomacherpåsar (Bild 1) och ställ dem i kyl (<6 C). OBS! Påsarna skall förslutas med t.ex. tvättklämma eller gem för att förhindra infektion av provet. Försök även att få ut så 4

mycket luft som möjligt från påsen innan den försluts. Det är viktigt att det ej finns mjölk kvar efter sidorna inuti påsen. Allt ska ner i botten, så att det blir ordentligt värmebehandlat. OBS! om provmängden är mindre än 100 g ska mjölken spädas till 100 g med sterilt kallt (<6 C) avjoniserat vatten. - Tag fram 6 st flaskor med invägt trypsin pulver till dragskåp och tillsätt 25 ml Trisbuffert ph 7,8 (från kylen). Skaka om trypsinlösningen väl, och låt stå i rumstemperatur 15 minuter. - Värmebehandla proverna till 72 C (vattenbadet bör vara inställt på max 74,5 C). Flytta 6 st invägda stomacherpåsar från kylskåpet till vattenbadet och värmebehandla. Ca 5 min för uppvärmning av proven och exakt 5 min hålltid vid 72 C (Bild 2). OBS! uppvärmningstiden är beroende av vattenbadets storlek och måste utprovas för varje bad. - Kyl ned påsarna genom att placera dem i rumstempererat vatten (Bild 3). Det är önskvärt att kyla så kort tid som möjligt. - Sterilfiltrera trypsinlösningen i steril 100 ml flaska genom sterilfilter (0,22µm) (Bild 4). OBS! det är viktigt att använda trypsinlösningen omgående efter sterilfiltreringen, eftersom den inaktiveras i rumstemperatur och det leder till försämrad filtrerbarhet hos mjölkprovet. - Tillsätt 100 ml steril 1% tritonlösning till varje prov och 25 ml sterilfiltrerad trypsinlösning. - Stomacherbehandla proven 30 sekunder. - Flytta påsarna efterhand till 55 C vattenbad (vattenbadet bör vara inställt på 57 C). Värmebehandla proverna. Ca 5 min uppvärmningstid och en hålltid vid 55 C på 15 min. Även här är uppvärmningstiden beroende av vattenbadets storlek. OBS! Starta tidur på 20 minuter (15 min + uppvärmningstiden) när första och sista provpåsen har hamnat i vattenbadet. Filtrera efterhand proverna i samma ordning, som de hamnade i vattenbadet, så att varje prov värmebehandlas lika länge. - Under den tid som proverna värmebehandlas 55 C sätts filtreringsutrustningen ihop och startas. Lägg teflonpackningarna i bägare med 70% alkohol innan de används. Sätt ihop filtreringsutrustningen Bild 5). - Doppa filtret i sterilt avjoniserat vatten med hjälp av flamberad pincett (Bild 6). Pincetten ska alltid doppas i 95% alkohol och sen brännas av. Lägg rutade filter (obs! rutorna uppåt) på filtreringsutrustningen (Bild 7). - Starta pumpen (undertrycket ska vara 0,8 bar) (Bild 8). - Efter 20 minuter (15 min + uppvärmningstid) hämtas första påsen från vattenbadet och ovandelen på påsen klipps av med flamberad sax, så att det blir lättare att hantera provet. Eventuellt kladd på påskanten klipps därmed bort (Bild 9 och 10). Doppa saxen i 95% alkohol och bränn av till nästa provpåse. - Filtera 1:a provet i tratt nr. 1 (Bild 11). - Skölj tratt nr 1 med 100 ml sterilt (55 C) avjoniserat vatten och filtrera det genom filtret så att triton och trypsinrester tvättas bort (Bild 12). - Fortsätt på samma sätt att filtrera nästa prov i nästa tratt tills alla 6 proven är klara. - Lägg respektive filter (rutad sida upp) med hjälp av flamberad pincett på agarplatta och märk plattan med prov nr. och tratt nr. OBS! det är viktigt att suga bort allt vattnet på filtret innan det lyfts över till agarplattan. Ett vått filter kan bli helt övervuxet av bakterier. Av samma anledning är det också viktigt att agarplattorna är torra. Undvik luftbubblor mellan filter och agaryta vid applikation av filtret på agarplattan (Bild 13, 14 och 15). - Avsluta filtreringen med att göra kontroll av filtreringsutrustningen, genom att lägga på ett nytt filter i fitreringsutrustningen och filtrera genom 100 ml sterilt 55 C avjoniserat vatten. Lägg filtert på agarplatta och märk plattan med text kontroll. 5

- Inkubera blodagarplattor med polymyxin aerobt vid 20 C ±1 C 48 timmar± 3 timmar vid analys av B. cereus. OBS! plattorna måste inkuberas rättvända för att bibehålla kontakten mellan bakteriekoloni och agar under inkuberingen. - Inkubera RCM-plattor med D-cykloserin anaerobt vid 37 C ±1 C i 72 timmar ± 3 timmar vid analys av Cl. tyrobutyricum. OBS! plattorna måste inkuberas rättvända för att bibehålla kontakten mellan bakteriekoloni och agar under inkuberingen. - Efter avslutad filtrering ska filtreringsutrustningen diskas och sköljas med avjoniserat vatten. - Underdelen av filtreringsutrustningen (stativet) autoklaveras i 15 minuter vid 121 C. - Rostfria trattar och filterhållare torrsteriliseras i värmeskåp 180 C minst 3 timmar. - Teflonpackningarna diskas för hand, sköljes och lufttorkas. 6. Resultaträkning Efter avslutad inkubering tag ut plattorna, och räkna bakteriekolonierna. Räkna kolonier på filter med 1-200 cfu/filter, > 200 cfu/filter ger ett osäkert resultat. På filtret är typiska B. cereus-kolonier gulaktiga, något ojämna och under filtret finns en tydlig hemolytisk zon (Bild 16 och 17). Användning av stereomikroskop underlättar räkningen av kolonierna, eftersom många kan vara ganska små. I stereomikroskop ser B. cereus-kolonierna skrynkliga ut (som en hjärna), men har ändå en jämn yta. Tveksamma kolonier mikroskoperas och ev. konfirmeras på Mosselagarplattor. Svaren anges i cfu/l mjölk. Cl. tyrobutyricum-kolonier på filtret ser olika ut, svagt gulaktiga eller vitaktiga stora och mycket små (Bild 18). Titta på kolonierna i stereomikroskop. Mikroskopera varje sorts koloni, eftersom det kan växa andra anaeroba kolonier än Cl. tyrobutyricum. I mikroskop har Cl. tyrobutyricum ganska tjocka stavar, man kan även se enstaka stavar med sporer. Räkna antal misstänkta kolonier i stereomikroskop. Tveksamma kolonier renstryks på RCM-plattor med D-cykloserin och odlas anaerobt 37 C ±1 C i 72 timmar. Svaren anges i cfu/l mjölk. 7. Referenser Abgrall, B. and Bourgeois, C. (1985 ) Enumeration of Clostridium tyrobutyricum spores by membrane filtration and culture on gelose media. Le lait 65, 45-53. A. Christiansson, K. Ekelund and H. Ogura (1997) Membrane Filtration for Enumeration and Isolation of Sporers of Bacillus cereus from Milk. Int. D. J. 7:743-748 A. Christiansson, I. Andersson, K. Ekelund, L. Jönsson, E. Månsson. (1992) Två metoder för bestämning av Bacillus cereus-sporer i leverantörmjölk. SMR reg. nr 4883. 6

Bilaga Filtreringsmetod för Bacillus cereus sporer och Clostridium tyrobutyricum sporer i mjölkprov Utförandet framgår av följande schema 1. Mjölkprov (100 gram) Uppvägning i stomacherpåse 2. Värmebehandling 72 C +2,5 C Dödar vegetativa bakterier (5 min. + 5min.) totalt 10 min. sporer överlever 3. Kylning till rumstemperatur 4. Tillsats av 100 ml 1% Triton X 100 Triton löser fett, trypsin bryter och 25 ml 2% trypsinlösning ner kaseinmiceller 5. Homogenisering 30 sek i stomacher Underlättar emulgering 6. Inkubering i 55 C +2 C Bättre proteasaktivitet och (15 min. + 5 min.) totalt 20 min. fettemulgering 7. Filtrering genom 0,8µm filter Sporer uppsamlas 8. Tvättning av filter med 100 ml Triton och trypsinrester bort sterilt avjonat vatten 55 C 9. Inkubering av filter på blodagar Sporerna gror, kolonier bildas 20 C ±1 C 48 tim. ±3 tim. Inkubering av filter på RCM-agar 37 C ±1 C anaerobt 72 tim. ± 3 tim. 10. Räkning av presumtiva B. cereus och Cl. tyrobutyricium 11. Konfirmering Mikroskopering, ev. Mossel för B. cereus 7

Bild 1. Märk en stomacherpåse högst upp mot öppningen för varje prov. Väg in mjölken i stomacherpåsarna. Påsarna kläms fast med häftmassa i en ställning bestående av två plexiglasskivor sammanfogade nedtill med en liten plexiglaskloss. Använd gärna en tvättklämma eller ett gem till att försluta påsen. Om gem används var försiktig så det inte går hål på påsen. Bild 2. Mjölken värmebehandlas vid 72 C för att avdöda vegetativa bakterier. Bild 3. Efter värmebehandlingen kyls mjölken i rumstempererat vatten. Ha gärna en bit cellstoff eller papper att sätta påsen mot för att bli av med en del vatten på utsidan. Bild 4. Trypsin löses i buffert och sterilfiltreras precis före användning. Observera att trypsin i pulverform kan vara irriterande för luftvägarna. Trypsin och triton sätts till mjölkproven för att bryta ner kaseinet respektive emulgera fettet så att filtret inte stoppas igen. Proven stomacherbehandlas och inkuberas i 55 C vattenbad. 8

Bild 5. Medan proven inkuberas sätts filtreringsutrustningen ihop och provkörs så att alla slangar och proppar håller tätt. Bild 6. Filtren förfuktas i sterilt avjonat vatten med hjälp av en flamberad pincett. Bild 7. Filtren placeras i filterhållaren med rutmönstret uppåt. Det är viktigt att man inte ställer ifrån sig tratten på det osterila underlaget. Bild 8. Vaccumpumpen startas och man kontrollerar att man fått rätt undertryck. 9

Bild 9. När första provet inkuberats färdigt. Tag upp påsen håll den mot en bit cellstoff eller papper för att bli av med vattnet på utsidan. Klipp med flamberad sax av övre delen av påsen (se nästa bild). Påsen blir lättare att hälla ur och man blir av med eventuellt kladd. Bild 10. För att lättare kunna hålla reda på vilket prov som filtrerats i vilken tratt läggs den avklippta delen med märkningen under respektive tratt. Bild 11. Kontrollera att kranen är stängd. Häll i provet i tratten. Öppna kranen. När alla vätska runnit igenom stäng kranen igen. Bild 12. Efterskölj med steril, tempererat vatten. Öppna kranen. När all vätska runnit igenom stäng kranen. Öppna och stäng kranen ytterligare några gånger för att bli av med all vätska på filtret. 10

Bild 13. Ställ fram märkta plattor för respektive prov. Kontrollera mot de avklippta delarna från påsarna. Bild 14. Lyft av tratten och tag bort filtret med en flamberad pincett. Tag försiktigt ute i kanten. Bild 15. Lägg filtret med rutorna uppåt på agarplattan. Undvik att få luftbubblor mellan filtret och agarytan. Inkubera plattorna med filtret uppåt enligt rekommendation för respektive bakterieart. Bild 16. Blodagarplatta med B. cereuskolonier på filtret. Observera hemolyszonerna som bildats i agarn under kolonierna. 11

Bild 17. Blodagarplatta med många B. cereus-kolonier. Får man förmånga kolonier kan det vara svårt att räkna och det är även svårt att avgöra vilka kolonier som har gett hemolys. Bild 18. RCM-platta med Cl. tyrobutyricum-kolonier på filtret. Dessa kolonier är ofta gula och den karaktäristiska doften av smörsyra brukar kännas tydligt. 12