Maxwell CSC RNA FFPE Kit

TEKNISK MANUAL Maxwell CSC RNA FFPE Kit Bruksanvisning för produkt AS1360 Varning: Hantera kassetterna med försiktighet, tätningskanterna kan vara vassa. BRUKSANVISNING FÖR PRODUKTEN AS1360 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany Reviderad 10/18 TM404

Maxwell CSC RNA FFPE Kit All teknisk litteratur finns tillgänglig på: www.promega.com/protocols Besök webbplatsen för att säkerställa att du använder den senaste versionen av denna tekniska handbok. Mejla Promegas tekniska support om du har frågor om hur du använder detta system: techserv@promega.com 1. Beskrivning... 1 2. Produktkomponenter, lagringsförhållanden och symbolförklaring... 2 3. Produktens avsedda användning... 4 4. Begränsningar för produktens användning... 4 5. Innan du startar... 5 5.A. Preparering av FFPE-prov... 5 5.B. Maxwell CSC-kassettförberedelser... 6 6. Instrumentkörning... 8 7. Efter rening... 9 8. Felsökning... 10 9. Bilaga... 12 9.A. Skapa en ribonukleasfri miljö... 12 9.B. Referens... 12 10. Sammanfattning av ändringar... 12 Maxwell CSC RNA FFPE Kit finns bara tillgängligt i utvalda länder. Den här produkten uppfyller kraven i EG-direktiv 98/79/EG gällande medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik. 1. Beskrivning Maxwell CSC RNA FFPE Kit används i kombination med Maxwell CSC Instrument för att tillhandahålla en enkel, effektiv automatiserad metod för rening av RNA från mänskliga FFPE-prov (formalinfixerade, paraffininbäddade) av bröst-, lung- eller kolonvävnad. Maxwell CSC Instrument levereras med förprogrammerade reningsmetoder. Det är utformat för att användas tillsammans med de avdelade reagenskassetter som levereras med kitet vilket säkerställer enkel och smidig användning. Instrumentet kan hantera upp till 16 prov på mindre än 60 minuter, och det renade RNA:t kan användas direkt i ett antal olika förstärkningsbaserade efterföljande tillämpningar, såsom RT-PCR. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 1 www.promega.com TM404 Reviderad 10/18

1. Beskrivning (fortsättning) Maxwell CSC RNA FFPE Kit renar nukleinsyra med hjälp av paramagnetiska partiklar som skapar en mobil fast fas med vilken insamling, rengöring och rening av RNA ur provet optimeras. Maxwell CSC Instrument är ett instrument för behandling av magnetiska partiklar. Detta system låter RNA effektivt bindas till de paramagnetiska partiklarna i en förfylld kassetts första brunn, och flyttar sedan provet under blandning genom kassettens brunnar. Med detta tillvägagångssätt för magnetisk insamling undviks vanliga problem kopplade till vätskebehandlande system såsom igensatta spetsar eller partiell reagensöverföring, vilket i andra vanliga automatiserade system leder till en suboptimal reningsprocess.. 2. Produktkomponenter, lagringsförhållanden och symbolförklaring PRODUKT STORLEK KAT.# Maxwell CSC RNA FFPE Kit 48 prep. AS1360 Endast för in vitro-diagnostik. Endast för professionellt bruk. Tillräckligt för 48 automatiserade isolationer från FFPE-prov. Maxwell CSC-kassetter är för engångsbruk. 15 C 30 C 6010TB 48 Innehåller: 25ml Mineral Oil 20ml Lysis Buffer 2 1ml Proteinase K 100µl Blue Dye 2 1ml MnCl 2, 0.09M 1ml DNase Buffer 3 vials DNase I (lyophilized) 48 Maxwell FFPE Cartridges 50 CSC/RSC Plungers 50 Elution Tubes (0.5ml) 25ml Nuclease-Free Water Förvaringsförhållanden: Förvara Maxwell CSC RNA FFPE Kit i rumstemperatur (15 30 C). Förvara rehydratiserad DNas I i 30 C till 10 C. Frys/tina inte mer än 10 gånger. Säkerhetsinformation: Reagenskassetterna innehåller etanol och isopropanol. Dessa substanser är att betrakta som brandfarliga, giftiga och irriterande. Maxwell CSC-kassetterna är utformade för att användas med potentiella smittoämnen. Bär lämplig personskyddsutrustning (t.ex. handskar och skyddsglasögon) vid hantering av smittoämnen. Hörsamma din inrättnings riktlinjer för hantering och destruktion av smittoämnen som används tillsammans med detta system. 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 TM404 Reviderad 10/18 www.promega.com

Varning: Hantera kassetterna med försiktighet, tätningskanterna kan vara vassa. Ytterligare information: Komponenterna i Maxwell CSC RNA FFPE Kit är godkända och kvalitetstestade för att fungera tillsammans. Att blanda komponenter från olika kit-lotter rekommenderas inte. Använd bara de komponenter som följer med i kitet. Symbolförklaring Symbol Förklaring Symbol Förklaring Medicinteknisk produkt avsedd för in vitro-diagnostik Auktoriserad representant inom Europeiska gemenskapen 15 C 30 C Förvara i 15-30 C. 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Tillverkare Viktigt Irriterande Cancerframkallande Räcker till n tester Conformité Européenne Viktigt. Mikrobiologisk risk. Viktigt. Risk för klämskada. Listnummer Satsnummer Får inte återanvändas Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 3 www.promega.com TM404 Reviderad 10/18

3. Produktens avsedda användning Maxwell CSC RNA FFPE Kit är avsett att användas i kombination med Maxwell CSC Instrument och reningsmetoden Maxwell CSC RNA FFPE, som medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik (IVD) för att genomföra automatiserad isolering av RNA mänskliga FFPE-prov (formalinfixerade, paraffininbäddade) från bröst-, lung- och kolonvävnad. Det renade RNA:t är lämpligt för användning i förstärkningsbaserade in vitrodiagnostikanalyser. Maxwell CSC RNA FFPE Kit är avsett att användas vid en temperatur på 15 30 C. Användning utanför detta temperaturintervall kan leda till suboptimala resultat. FFPE-prov preparerade med 10 % neutralbuffrat formalin kan användas med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Maxwell CSC RNA FFPE Kit är inte avsett att användas som en del av ett specifikt in vitro-diagnostiktest. Maxwell CSC RNA FFPE Kit är endast avsett för yrkesmässig användning. Diagnostiska resultat som erhållits vid användning av RNA som renats med detta system måste tolkas tillsammans med andra kliniska eller laboratoriska data. 4. Begränsningar för produktens användning Maxwell CSC RNA FFPE Kit är endast avsett att användas tillsammans med mänskliga FFPE-vävnadsprov hämtade från bröst, lunga eller kolon. Det är inte avsett att användas tillsammans med icke-ffpe-prov såsom färska eller frysta vävnadsprov eller med mänskliga FFPE-vävnadsprov av annan vävnad bröst, lunga eller kolon. Maxwell CSC RNA FFPE Kit är inte avsett att användas med andra typer av prov, inklusive icke-mänskliga prov eller för rening av DNA. Maxwell CSC RNA FFPE Kit är inte avsett att användas med vävnadsprov som har preparerats med andra fixeringsmetoder än 10 % neutralbuffrat formalin. Prestandan hos Maxwell CSC RNA FFPE Kit har utvärderats genom att RNA från FFPE-vävnadsprov i storleksintervallet 0,1 2,0 mm 3 har isolerats. Det är inte avsett att användas med prov utanför detta intervall. Användaren är ansvarig för att fastställa nödvändiga prestandaegenskaper för efterföljande diagnostiska tillämpningar. Lämpliga kontroller måste finnas inkluderade i alla efterföljande diagnostiska tillämpningar där RNA renat med Maxwell CSC RNA FFPE Kit används. 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 TM404 Reviderad 10/18 www.promega.com

5. Innan du startar Material som ska tillhandahållas av användaren mikrocentrifug pipetter och pipettspetsar för förbehandling och överföring av prov till förfyllda reagenskassetter 1,5 2,0 ml rör för provinkubering (till exempel Microtubes, 1,5 ml Kat.# V1231) värmeblock inställda på 56 C och 80 C (Observera: Värmeblocken ska ställas in på den fordrade temperaturen. Värmeblockets faktiska temperatur ska läsas av med en kalibrerad termometer. Se till att temperaturen är korrekt inom termometerns felmarginal.) FFPE-prov med en total vävnadsvolym på 0,1 2,0 mm 3 ; tjockleken på tvärsnittet ska inte överstiga 5 µm (Observera: Prov ska förvaras i rumstemperatur [15 30 C].) rakblad(observera: Iaktta försiktighet när rakblad används för att skrapa prov från objektsglas. Rekonstituera vid behov en lyofiliserad ampull DNas I med 275 µl nukleasfritt vatten. Vänd ampullen för att skölja DNas I från lockets undersida och virvla försiktigt, ej vortex. 5.A. Preparering av FFPE-prov Förbehandling av tvärsnittsprov 1. Placera snittet i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Om du använder vävnadssnitt på objektsglas, skrapa snittet från glaset med ett rent rakblad. 2. Tillsätt 300 µl mineralolja i provrören. Vortexa i 10 sekunder. 3. Värm proven i 80 C i 2 minuter. Placera proven i rumstemperatur medan mastermixen prepareras. 4. Preparera en mastermix med lyseringsbufferten, Proteinas K och blå färg såsom visas nedan: Reagens Mängd /Reaktioner Reaktioner (Antal som ska köras +1) Total Lyseringsbuffert 224 µl n+1 224 µl (n+1) Proteinas K 25 µl n+1 25 µl (n+1) Blå färg 1 µl n+1 1 µl (n+1) 5. Tillsätt 250 µl mastermix till varje provrör och vortexa i 5 sekunder. 6. Centrifugera provrören med 10,000 g i 20 sekunder för att separera skikten. Om en pellet går att se i det vattenhaltiga skiktet (det nedre blå skiktet), blanda försiktigt för att lösa upp pelleten. Låt båda faserna vara kvar i röret. 7. Flytta provrören till ett värmeblock inställt på 56 C och inkubera i 15 minuter. 8. Flytta provrören till ett värmeblock inställt på 80 C och inkubera i 1 timme. 9. Avlägsna provrören från värmeblocket och låt proven svalna till rumstemperatur i 15 minuter. Preparera, medan proven svalnar, DNas-blandningen i enlighet med beskrivningen i Steg 10. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 5 www.promega.com TM404 Reviderad 10/18

5.A. Preparering av FFPE-prov (fortsättning) 10. Preparera en blandning av MnCl 2, DNas-buffert och DNas I i den ordning som redovisas nedan: Reagens 1 Mängd /Reaktioner Reaktioner (Antal som ska köras +1) Total MnCl 2, 0,09 M 26 µl n+1 26 µl (n+1) DNas-buffert 2 14 µl n+1 14 µl (n+1) DNas I 3 10 µl n+1 10 µl (n+1) 1 Om reagenterna i DNas-blandningen tillsätts individuellt till provrören, se till att de tillsätts i ordningen som redovisas ovan. Integrera varje reagent genom noggrann pipettering innan nästa reagent tillsätts. 2 Förvara DNas-buffert i 15 30 C; den kan fällas ut om den förvaras i lägre temperaturer. Om bufferten innehåller fällningar, lös upp fällningarna genom att värma bufferten till 56 C i 2 minuter följt av en kort stunds blandning med vortex. 3 Förvara återstående rekonstituerad DNas I i 30 till 10 C. 11. Tillsätt 50 µl DNas-blandning till varje provrör. Blanda genom att pipettera 10 gånger. 12. Inkubera provrören i 15 minuter i rumstemperatur (15 30 C). 13. Centrifugera provrören på full hastighet i en mikrocentrifug i 5 minuter. 14. Flytta omedelbart den blå, vattenhaltiga fasen till brunn #1 i en Maxwell CSC-kassett. Se Avsnitt 5.B för instruktioner för preparering av kassetterna. 5.B. Maxwell CSC-kassettförberedelser 1. Byt handskar innan du hanterar Maxwell CSC-kassetter, CSC/RSC-kolvar och elueringsrör. Kassetterna placeras på Maxwell CSC-trågbrickan utanför instrumentet och trågbrickan innehållande kassetterna och proven överförs till instrumentet för rening. Placera kassetter som ska användas i Maxwell CSCtrågbrickan (Illustration 2). Placera kassetterna i trågbrickan med brunn #1 (kassettens största brunn) längst bort från elueringsrören. Tryck nedåt på kassetten för att fästa den på plats. Se till att båda kassettens ändar sitter fast i trågbrickan. Dra försiktigt tillbaka förseglingen så att hela förseglingen tas bort från kassettens ovansida. Kontrollera att all förslutningstejp och alla limrester tas bort från kassetten. Varning: Hantera kassetterna med försiktighet. Tätningskanterna kan vara vassa. 2. Placera en kolv i brunn #8 i varje kassett. Observera: Använd endast de kolvar som tillhandahålls med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Kolvarna till Maxwell 16 LEV och SEV Kit är inte kompatibla med Maxwell CSC Instrument. 6 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 TM404 Reviderad 10/18 www.promega.com

3. Placera ett tomt elueringsrör i elueringsrörspositionen för varje kassett i Maxwell CSC-trågbrickan. Observera: Använd endast de elueringsrör som tillhandahålls med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Andra elueringsrör är inte nödvändigtvis kompatibla med Maxwell CSC Instrument vilket kan påverka RNAreningsprestandan. 4. Tillsätt 50 µl nukleasfritt vatten i botten på varje elueringsrör. Elueringsrören måste förbli öppna under RNA-reningen. Observera: Använd endast det nukleasfria vatten som tillhandahålls med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Användning av annan elueringsbuffert kan påverka RNA-reningsprestandan eller efterföljande tillämpning. Kommentarer Maxwell FFPE-kassettförberedelser 1. Om färre än 16 prov behandlas ska kassetterna centreras på trågbrickan. 2. Rengör prov- eller reagensspill över hela Maxwell CSC-trågbrickan såsom indikeras i Maxwell CSC Instrument Manual. Använd inte blekmedel på någon av instrumentets delar. 1 2 3 4 5 6 7 8 1. Bindande lösning 2. Magnetiska partiklar 3. Tvättande lösning 4. Tvättande lösning 5. Tvättande lösning 6. Tvättande lösning 7. Tom 8. Tom 11339TC Brunnsinnehåll som tillsätts av användaren 1. Förbehandlade prov 8. CSC/RSC-kolv Illustration 1. Maxwell CSC-kassett. Denna illustration visar kassettens innehåll. Förbehandlade FFPE-prov tillsätts brunn #1 och en kolv tillsätts brunn #8. 10828TB Illustration 2. Inställning och konfiguration av Maxwell CSC trågbricka. Nukleasfritt vatten tillsätts till elueringsrören såsom indikerat. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 7 www.promega.com TM404 Reviderad 10/18

6. Instrumentkörning Metoden Maxwell CSC RNA FFPE Method kan laddas hem från Promegas webbplats: www.promega.com/ resources/tools/maxwellcscmethod. Se Maxwell CSC Methods Installation Technical Manual #TM401 för mer detaljerad information. Om du misstänker att ditt instrument är kontaminerat med RNas, rengör instrumentet innan körning med Steris LpH eller liknande rengöringslösning. Följ instruktionerna i avsnittet Rengöring och Underhåll i Maxwell CSC Instrument Operating Manual. 1. Sätt på Maxwell CSC Instrument och surfplattan. Instrumentets gränssnitt startas automatiskt och instrumentet går igenom en självtest och alla rörliga delar återgår till respektive utgångslägen. 2. Välj Start på Hem-skärmen. 3. Skanna eller skriv in metodens streckkod från Maxwell CSC RNA FFPE Kit-etiketten för att automatiskt välja den metod som ska köras (Illustration 3). Observera: Streckkoden för Maxwell CSC RNA FFPE Kit-metoden krävs för RNA-rening med Maxwell CSC Instrument. Kit-etiketten innehåller två streckkoder. Metodstreckkoden visas i Illustration 3. Kontakta Promegas tekniska support om streckkoden inte kan skannas. 12053TA Illustration 3. Kitetikett med indikation på vilken streckkod som ska skannas för metod. Metodstreckkoden som ska skannas på kitetiketten för att starta en reningskörning markeras med en röd fyrkant. 4. Välj kassettpositionerna som ska köras (se Maxwell CSC Instrument Operating Manual), och skanna eller ange manuellt den fordrade provspårningsinformationen. Avmarkera oönskade provpositioner. Välj Fortsätt när all provinformation har angetts. 5. Verifiera med surfplattan att prov att har tillsatts kassetternas brunn #1 (såsom beskrivs i Avsnitt 5.A), att kassetterna har laddats i instrumentet, att elueringsrör innehållande 50 μl nukleasfritt vatten finns med och är öppna, och att kolvar finns i brunn #8. 8 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 TM404 Reviderad 10/18 www.promega.com

6. Flytta Maxwell CSC-trågbrickan innehållande de förberedda kassetterna till tråget i Maxwell CSC Instrument. Kontrollera att trågbrickan har placerats i Maxwell CSC Instrument med elueringsrören närmast luckan. Trågbrickan passar endast i instrumentet med denna orientering. Om du har problem med att få trågbrickan att passa på plattformen, kontrollera att den är vänd åt rätt håll. Se till att trågbrickan står jämnt i instrumentets tråg. Observera: Håll Maxwell CSC-trågbrickan i dess sidor för att undvika att kassetter lossnar från den. Varning: Risk för klämskada. 7. Bekräfta att alla de indikerade förberedelserna har genomförts och tryck på Starta för att stänga instrumentluckan och starta behandlingen. 8. Maxwell CSC Instrument kommer omedelbart att påbörja reningskörningen. Skärmen kommer att visa stegen som utförts och ungefärlig återstående tid av körningen. Observera: Om körningen avbryts innan den är slutförd kommer instrumentet att tvätta bort partiklarna från kolvarna och mata ut kolvarna i kassettens brunn #8. Proven kommer att gå förlorade. Försök inte att rena om prov från en avbruten instrumentkörning. 9. När den automatiserade reningskörningen är klar visar surfplattans skärm meddelandet Körning avslutad som bekräftar att metoden är avslutad. Körning avslutad 10. Följ skärminstruktionerna i slutet av metoden för att öppna luckan. Kontrollera att kolvarna befinner sig i kassettens brunn #8 i slutet av körningen. Avlägsna trågbrickan från instrumentet och avlägsna de eluerade proven från trågbrickan. Om kolvarna inte har avlägsnats från kolvstången: Följ skärmanvisningarna för att genomföra rengöringsmetod för avbruten körning eller välj rengöringsmetoden i Inställningsskärmen för en framgångsrikt genomförd körning för att avlägsna återstående kolvar. 11. Avlägsna och sätt lock på elueringsrören innehållande RNA omedelbart efter körningen för att förhindra att eluater avdunstar. Avlägsna Maxwell CSC trågbricka från instrumentet. Observera: För att avlägsna trågbrickan från instrumentets plattform, håll den i dess sidor. I syfte att undvika skador på den renade nukleinsyran, se till att proven avlägsnas från instrumentet innan instrumentets UV-saneringsprotokoll körs. RNA-prov kan förvaras över natt i 30 C till 10 C, eller under 60 C under längre tid. 12. Avlägsna kassetter och kolvar från Maxwell CSC-trågbrickan och gör dig av med farligt avfall i enlighet med rutinerna för din inrättning. Kassetter, kolvar och elueringsrör är avsedda för engångsbruk. Återanvänd inte Maxwell CSC-kassetter, CSC/RSC-kolvar eller elueringsrör. 7. Efter rening. Säkerställ att det renade RNA-provet uppfyller ingångskraven på utfall och renhet för tillämpliga efterföljande diagnostiska analyser innan provet används. Kitets prestanda utvärderades baserat på rening av förstärkningsbart RNA. Andra kvantifieringsmetoder, såsom absorbering eller bindning med flourescerande färg korrelerar inte nödvändigtvis med förstärkning (1). Absorberingsmätning på FFPE-prov kan överskatta utfallet. Vi rekommenderar mer noggranna metoder för att mäta utfallet (1). Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 9 www.promega.com TM404 Reviderad 10/18

8. Felsökning För övriga frågor ska du kontakta din lokala Promega-återförsäljare. Kontaktinformation finns på: www.promega.com. E-post: techserv@promega.com Symptom Lägre RNA-koncentration än förväntat i eluat (ett typiskt FFPE-snitt ska ge förstärkningsbart RNA i utfall beroende på vävnadsstorlek, cellularitet, formalinfixeringsskick och hantering). Orsaker och kommentarer Kitprestandan har utvärderats genom att RNA har isolerats från FFPE-vävnadsprov i storleksintervallet 0,1 mm 3 till 2,0 mm 3. Kitet utformades inte för prov utanför detta intervall. Använd snitt som ligger innanför detta intervall. Kitet utformades för att användas tillsammans med mänskliga FFPE-vävnadsprov hämtade från bröst, lunga eller kolon. Det utformades inte för att användas tillsammans med icke-ffpe-prov såsom färska eller frysta vävnadsprov eller med mänskliga FFPEvävnadsprov av annan vävnad bröst, lunga och kolon. Inkubationstider och -temperaturer testades endast för mänsklig bröst-, lung- och kolonvävnad. Använd endast mänsklig bröst-, lung- och kolonvävnad. Kitet utformades inte för att användas med vävnadsprov som har preparerats med andra fixeringsmetoder än 10 % neutralbuffrat formalin. Bekräfta att alternativ fixering inte har använts. RNas kan ha tillsatts under provbehandling eller kvantifiering. Se Avsnitt 9 för information om hur en ribonukleasfri miljö skapas. Vävnad från ett smutsigt objektsglas eller snitt användes. Inga garantier lämnas för smutsiga objektsglas eller snitt. Gör om reningen med rena objektsglas eller snitt. Kitets prestanda utvärderades baserat på rening av förstärkningsbart RNA. Andra kvantifieringsmetoder, såsom absorbering eller bindning med flourescerande färg korrelerar inte nödvändigtvis med förstärkning. Använd en förstärkningskvantifieringsmetod för att utvärdera utfallet. 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 TM404 Reviderad 10/18 www.promega.com

8. Felsökning (fortsättning) Symptom Lägre kvalitet än förväntat. (Elutatet innehåller starkt fragmenterat RNA eller komponenter som kan inhibera efterföljande analyser.) DNA i eluaterna. (Eluaterna är kontaminerade med DNA vilket kan påverka efterföljande analyser.) Orsaker och kommentarer Formalinfixering och därpå följande korslänksomkastning kommer att fragmentera RNA:t. komm Om RNA:t fragmenteras innan extraktion/rening kommer det fragmenterade RNA:t renas med detta kit. Upprepa behandlingen med intilliggande snitt för att avgöra om problemet har med provet eller med processen att göra. Vissa förstärkningsprocesser är särskilt känsliga för inhiberande komponenter. Efterföljande analyskontroller bör identifiera närvaron av förstärkningshämmare i eluatet. Det är användarens ansvar att verifiera denna produkts kompatibilitet med efterföljande analyser. DNas-blandningen som tillsattes provet skapar ett överflöd av DNas-aktivitet om det används med FFPE-vävnadsprov i storleksintervallet 0,1 mm 3 till 2,0 mm 3. Den utformades inte för prov utanför detta intervall och kan vara suboptimal för dessa. Använd snitt som ligger innanför detta intervall. Otillräcklig blandning av DNas-blandningen i provet under förbehandlingen kan leda till ofullständig nedbrytning av DNA:t. Se till att DNas-blandningen blandas noggrant i provet. Om DNas-blandningens ingredienser tillsätts provet separat, se till att de tillsätts i den ordning som beskrivs i Avsnitt 5.A, Steg 10. Se dessutom till att blanda alla komponenter noggrant när de tillsätts. Om komponenterna tillsätts i en annan ordning än den beskrivna eller blandas otillräckligt kan DNaser inaktiveras. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 11 www.promega.com TM404 Reviderad 10/18

9. Bilaga 9.A. Skapa en ribonukleasfri miljö Ribonukleaser är extremt svåra att inaktivera. Säkerställ att RNas-aktivitet i dina RNA-prov förhindras under och efter isolering. Detta är särskilt viktigt om startmaterialet bara finns i begränsad mängd. Följande kommentarer kan hjälpa till att förhindra oavsiktlig RNas-kontaminering av dina prov. 1. De två vanligaste källorna till RNas-kontaminering är användarens händer och bakterier eller mögel som kan finnas på luftburna dammpartiklar. För att förhindra kontaminering från dessa källor, tillämpa antiseptisk teknik när reagenserna som levereras med systemet hanteras. Bär alltid handskar. Byt handskar efter varje möjlig kontakt med ribonukleoser. 2. Använd om möjligt sterila engångsartiklar i plast när RNA:t hanteras. Dessa material är i allmänhet RNasfria och kräver inte förbehandling för att inaktivera RNas. 3. Behandla ickesterila glasartiklar och plastartiklar innan de används, för att säkerställa att de är RNas-fria. Kör glasartiklar i ugn i 200 C över natten, skölj noggrant plastartiklar med 0,1N NaOH, 1 mm EDTA, följt av RNas-fritt vatten. Kommersiellt tillgängliga produkter för RNas-borttagning kan också användas i enlighet med tillverkarens instruktioner. 4. Behandla lösningar som inte levererats med systemet genom att tillsätta dietylpyrokarbonat (DEPC) i 0,1 % i ett dragskåp. Inkubera över natten med omrörning i rumstemperatur i dragskåpet. Autoklavera i 30 minuter för att avlägsna eventuella spår av DEPC. Varning: DEPC misstänks vara cancerframkallande och ska bara hanteras i dragskåp. DEPC reagerar snabbt med aminer och kan inte användas för att behandla trisbuffertar. Observera: Det är avgörande för alla efterföljande tillämpningar att RNA-proven fortsatt skyddas från RNaser. 9.B. Referens 1. Bonin, S. et al. (2010) Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Arch. 457, 309 17. 10. Sammanfattning av ändringar Följande ändring gjordes till 10/18-revisionen av detta dokument: 1. Uppdaterades för att inkludera kraven från EG Direktivet för in vitro-diagnosticering (98/79/EG). 12 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 TM404 Reviderad 10/18 www.promega.com

2013 8 Promega Corporation. Med ensamrätt. Maxwell är ett registrerat varumärke som tillhör Promega Corporation. Produkter kan vara skyddade av sökta eller utfärdade patent eller ha vissa begränsningar. Besök vår webbplats för mer information. Alla priser och specifikationer kan ändas utan föregående meddelande. Produktanspråk kan ändras. Kontakta Promegas tekniska support eller öppna Promegas katalog online för den senaste informationen om Promegas produkter. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Avgiftsfritt i USA 800-356-9526 608-274-4330 Fax 608-277-2516 13 www.promega.com TM404 Reviderad 10/18