Gene expression from a cold-treated Swedish isolate of Haemonchus contortus Daniel Martinsson

Biomedicinska analytikerprogrammet vårtermin -09 Gene expression from a cold-treated Swedish isolate of Haemonchus contortus Daniel Martinsson Handledare: Johan Höglund, Sveriges Lantbruksuniversitet Annie Engström, Sveriges Lantbruksuniversitet Karin Troell, Uppsala universitet

ABSTRACT Totally 84 differentially expressed mrna clones from infective L3 larvae of the parasite Haemonchus contortus, a blood sucking nematode, were analyzed with single strand hybridization assay (SSH). Altogether 79 clones were sequenced, edited, and compared with proteins found via BLAST in GeneBank. The aim was to investigate gene expression and potential protein expression following storage at 5 C for 32 weeks. mrna was extracted from fresh and stored L3. The SSH derived products were cloned into E. coli, purified and sequenced with Big Dye Terminator v3.1, and then compared with uploaded sequences in GeneBank. BLAST showed 59 (70 %) reliable protein results, where 39 (66 %) were of nematode origin.. Three sequences (4 %) were recognized as H. contortus-related metabolic proteins. Further research is necessary to elucidate the role of these proteins in relation to storage. Many of the sequences (36 %) are also present in other nematodes, such as Caenorhabditis briggsae and C. elegans, where whole-genome projects have been conducted. Bigger and more accurate databases need to be developed. Maybe the most significant future project is to sequence the whole genome of H. contortus. Keywords: Single Strand Hybridization, BigDye Terminator, protein-blast, Nematode, Sheep

INLEDNING Haemochus contortus, eller fårets stora löpmagsmask, har länge setts som en tropisk parasit hos får och getter och masken trivs framför allt i tropiska områden. Parasiten finns dock även i tempererade områden och på senare år har man sett en ökning även i Sverige (Troell et al. 2006). Parasiten är en nematod som orsakar anemi som leder till alltifrån viktproblem till dödsfall, framförallt hos ungdjur med ett mindre utvecklat immunförsvar. Min uppgift var att avsluta ett arbete som påbörjades av Karin Troell, inom hennes doktorandstudier vid SWEPAR, Sveriges Lantbruksuniversitet (SLU), Uppsala. Ett av dessa avslutas genom att studera H. contortus genuttryck, och potentiella proteinuttryck, vid kyla, en liten fråga i en stor fråga om parasiten kan köldanpassa sig och ha förmåga att övervintra på kyligare breddgrader som larv? H. contortus är en blodsugare som skär upp ett snitt i de ytliga blodkärlen i löpmagsslemhinnan. Masken blir i sitt könsmogna stadium ~2-3 cm lång och då värddjuret är kraftigt infekterat leder detta till anemi, med viktnedgång och utvecklingsstörningar som följder (Troell, K 2006). En vuxen parasit bidrar med en blodförlust på cirka 0,05 ml/dag (Jambre 1994). Ett djur som är infekterat med 5000 maskar tappar alltså i medel runt 250 ml blod om dagen till följd av infektionen. Vid obduktion är det relativt enkelt att se de vuxna maskarna men diagnosen ställs oftast utifrån kliniska symptom och påvisande av ägg i faeces. För oss människor leder angreppen till ekonomiska problem eftersom djuret kan stanna i växt och utveckling (Hunt et al. 2007). - Figur 1. H. contortus livscykel frånägg i faces, infekterbara stadiet L3 och könsmogna L5-stadie. Figur från SVA H. contortus har en direkt livscykel där värddjuret infekteras på betet. Den behöver alltså inte någon mellanvärd, som många andra parasiter, för att utvecklas, utan kan direkt infektera värddjuret. På betesmarkerna kan maskäggen utvecklas till tredje larvstadiet (L3) på 10 dagar, som är det utvecklingsstadium hos H. contortus som infekterar fåren. Djuren blir infekterade med L3 som följer med gräset ned till löpmagen där den utvecklas vidare via L4-stadiet till L5 som är det vuxna könsmogna stadiet hos parasiten. Tiden för denna utveckling är runt 2-3 veckor (Thamsborg, Söland & Vigh- Larsen (2001); Urquhart et al. (1996)). En fertil hona kan utskilja ~7000 ägg/dag(coyne MJ et al 1991; Coyne & Smith (1992) som följer med djurets faeces som når betet där livscykeln kan börja om på nytt.

Fårets stora löpmagsmask har en optimal utveckling på betesmarken vid 28 C och >70 % luftfuktighet (Rossanigo & Gruner 1995). I Sverige är klimatet kallare, men det har visat sig att temperaturen måste sjunka under 9 C för att den externa utvecklingen hos äggen till infektiva L3 ska avstanna (Troell et al 2006)). Figur 2. Huvud H. contortus L4 hane 20x. Nematoder Figur 3. Svans H. contortus L4 hane i 20x förstoring skiljer sig från varandra tydligast i huvudpartiet, Figur från SVA svansen och könsorgan. Figur från SVA Karin Troell har, som tidigare nämnts, utfört en studie i hur genuttrycket hos H. contortus påverkas av långtidsförvaring i kyla, ett arbete jag nu har avslutat. Parasitisolatet som använts i försöket isolerades år 2000 från får vid en gård i Noraström i Medelpad (Troell, K. 2006). Parasiterna har sedan dess fram till 2005 årligen passerats genom att inokulera nyligen avvanda parasitfria lamm med 2000-3500 L3 i oral suspension. Ursprungligen isolerades parasiten genom att plantera vuxna maskar direkt i löpmagen hos får vid kirurgiska ingrepp, under narkos. Ägg i faeces samlades sedan dagligen under flera veckor och inkuberades vid rumstemperatur under 10 dagar för att larverna skulle nå L3-stadiet. L3 förvarades slutligen i kranvatten med Fungizon ( 0,25 mg l -1 PBS, ph 7,5 ) i cellodlingsflaskor och användes sedan till att infektera nya lamm. I detta försök, innan jag tog vid, odlades larverna i faeces 10 dagar till L3 och delades upp i 2 grupper, varav en grupp utsattes för kyla, 5 C i 32 veckor, medan den andra frystes ned. Målet var att se skillnad i genuttryck hos larver som frysts ned utan köldinkubation mot larver som långtidsförvarats i 5 C. Från L3 extraherades mrna framför allt med QuickPrep micro mrna Purification kit för att tekniskt sedan översättas till cdna vid SSH-PCR. För att ta reda på om de köldförvarade L3 hade ett unikt genuttryck användes supression subtractive hybridization (SSH) PCR. Detta är en teknologi som möjliggör PCR-baserad amplifiering av unik cdna. Tekniken bygger på att man sorterar bort allt cdna som bildas när man hybridiserar enkelsträngat mrna från de båda grupperna. Detta leder till att det cdna som förekommer i samma koncentration hos de båda grupperna elimineras. I detta fall gav det cdna som var unikt och/eller som uttrycktes i olika hög grad hos larverna i det köldinkuberade provet. De unika cdna sekvenserna klonades sedan in i E. coli tillsammans med en ampicillin-resistent gen för möjliggöra selektiv odling av bakterier med ett insert av det unika parasit-cdnat. När jag tog vid fanns bakterierna förvarade i glycerol i -80 C.

E. coli med inklonade parasit-dnafragment odlades på agarplattor. Efter odlingen utfördes en koloni- PCR, vilket gav svar på om kloningen hade lyckats och som även visade att bakterierna inte hade fryst sönder under förvaringen i glycerol vid -80 C. I de fall koloni-pcren lyckades odlades bakterierna i LB-agarmedium varefter plasmiderna preparerades med ett E-colikit(Plasmid DNA Purification User manual Nucleospin Plasmid, MACHEREY-NAGEL). I de fall koloni PCRen lyckades, odlades bakterierna, varefter det unika cdna-insertet från parasiten sekvenserades med APPLIED BIOSYSTEMS Big Dye Terminator (BDT) v3.1 och de erhållna sekvenserna jämfördes med träffar i Gene Bank. I mitt projekt var syftet att identifiera unika genuttryck efter en inkubationstid för larverna på 32 veckor i 5 C. MATERIAL & METOD Analyserade prov Infektiva larver (L3) av H. contortus, ursprungligen från får på en gård i Noraström, Medelpad, analyserades. Det material som jämfördes var dels mrna från ett kontrollprov L3, dels från ett prov som inkuberats i 5 C under 32 veckor. mrna från parasiterna hade extraherats med QuickPrep micro mrna Purification kit. För att isolera unika mrna-fragment som uttrycks hos långtidsförvarade parasiter, hade Karin Troell utfört SSH-PCR och klonat in de presenterade sekvenserna i E. coli som, när jag tog vid, fanns förvarade som glycerolstockar i -80 C. Odling på platta För att öka bakterieantalet och ta fram en klon, odlades bakterierna från 84 glycerolstockar på Laura Bertani (Lb)-agarplattor med Ampicillin (50 mg/ml) tillsatt. Plattorna inkuberades över natt i 37 C. Koloni-PCR PCR Från de inkuberade plattorna togs en koloni/prov till 25 µl Super-Q H 2 O och kokades i 5 min. Därefter centrifugerades proverna vid 11 000 g i 30 sek. Sedan togs 1 µl prov som tillsattes till 49,0 µl PCR-mix, i PCRrör, innehållandes 40,8 µl Super-Q H 2 O, 1,5 mm ABI 10x PCR Buffer ( MgCl 2 ), 0,2 µm TR1, 0,2 µm TR2 (Tabell 1), 0,2 mmol dntp och 1 unit ABI AmpliTaq DNA Polymerase. Proven amplifierades på MJ-Research PTC-200 i 30 cykler med 96 C i 15 sek denaturering, 68 C i 20 sek annealing och 72 C i 60 sek elongering. Till negativ kontroll togs 1 µl Super-Q H 2 O till 49 µl PCR-mix.

Analys av koloni-pcr på agarosgel Produkterna från koloni-pcren kördes ~40 min, på en 1,5 % agarosgel innehållande ethidium bromid (~0,8 µg/ml) i 1x TAE-buffer och till samtliga prover tillsattes även Gel Loading Solution (GLS)(0,2 µl/µl prov). Banden visualiserades med UV-ljus och fotograferades med Kodak Digital Science Electrophoresis Documentation and Analysis System 120. Tabell 1. Primers som användes under projektet. Primernamn Primersekvens Nested primer 1 (TR1) 5 - CTA ATA CGA CTC ACT CAC TAT AGG GC - 3 Nested primer R2 (TR2) 5 AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT 3 M13F 5 GTA AAA CGA CGG CCA GT 3 M13R 5 GGA AAC AGC TAT GAC CAT G - 3 Plasmid-preparation och koncentrationsmätning En koloni från agarplattan sattes även till en 50 ml E-kolv innehållande 5,0 ml LB-medium och Ampicillin (50 mg/ml) som inkuberades på skak över natt (~16 h) i 37 C. Proverna från övernattskulturen pipetterades därefter stegvis (1,0 ml åt gången) till eppendorfrör och centrifugerades vid 11 000 g, 30 s. Supernantanten hälldes av, varefter ytterligare 1,0 ml överfördes. Steget upprepades till dess att all övernattskultur hade förts över till eppendorfrören. Därefter följde plasmidpreparation enligt MACHEREY-NAGEL Plasmid DNA Purification User manual Nucleospin Plasmid kap. 6. Efter preparationen mättes koncentrationen av plasmiddna i proverna med TECHTUMLAB Picodrop med programmet ALPHA INNOTEC Alpha Spec Picodrop där 3,0 µl prov analyserades i en spektrofotometer och koncentrationen dsdna uttrycks som kvoten 260/280 nm. DNA-sekvensering Sekvensering De renade plasmiderna sekvenserades med BDT, reverse och forward sekvensering, där 1 µl prov sattes till en BDT-mix bestående av 1,0 µl BDT v3.1, 5 pmol M13F eller M13R (Tab. 1), 0,5 µl BDT v3.1 Buffer 5x, 0,5 µl Super-Q H 2 O. Understeg plasmiddna-koncentrationen 150 ng/µl togs 1,5 µl prov, men 0,5 µl Super- Q H 2 O tillsattes ej då totalvolymen ej fick överstiga 5 µl. Var plasmiddna-koncentrationen 300 ng/µl användes 0,5 µl prov och 1,0 µl Super-Q H 2 O i BDT-mixen. Proverna kördes på ABI 2720 Thermal cycler i 30 cykler med 96 C i 10 sek denaturering, 50 C i 5 sek annealing och 60 C i 4 min elongering.

Rening av sekvens Sista steget innan sekvensanalysen var att rena produkterna vilket utfördes med MILLIPORE Montage SEQ 96 Sequencing Reaction Clean up Kit. Instruktionerna i medföljande instruktionsmanual följdes och proverna analyserades efter reningen på ABI 3100 Genetic Analyzer. Sekvensanalys Sekvenserna analyserades från en dator med programmet ContigExpress, som ingår i programserien Vector NTI Advance 10 INVITROGEN. För de båda sekvenserna, forward och reverse, gjordes så kallade contigs för varje klon. Övriga nukleotider klipptes bort vilket resulterade i en konsesussekvens som jämfördes mot sekvenser i databasen GeneBank i NCBI - Blast, National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool (090422). Vid BLAST-sökning jämförs sekvenserna procentuellt och inom alla läsramar mot träffarna eftersom det vid ren BLAST finns en chans att det ingår flera stoppkodon vid kompletmentär BLAST, se fig. 4. 5... TAA CCC TCA ATT AAG GGA CTA GTC CTG CAG GTT TAG ACG...3 I G S * F P A G A V G I V Figur 4. Exempel på vad som hänt vid 13 aminosyror direktblast då ATT kodar för UAA, ett stoppkodon, *. I figuren har sekvensen BLASTats direkt istället för procentuellt. Vid procentuell BLAST ignoreras stoppkodonen vilket i detta fall skulle resultera i 12/13 träffar alltså 92 % träff. Sekvensering I denna studie användes BDT vid sekvensering. Principen för BDT bygger på dideoxynukleotider som är märkta med fluorescens och som ersätter OH-gruppen, som är platsen där nukleotiderna binder till varandra. Tillsammans med dntp körs en BDT som är linjär, till skillnad frånpcr som är exponentiell. Elongering är förlängd till 4 min och stannar när en fluorescensinmärkt nukleotid klistras in eftersom det är omöjligt för ytterliggare en nukleotid att binda in. För att primrarna skall visualiseras, men främst för att om man har ett dåligt fragment, sekvenseras nukleotiderna från båda hållen dels med en forward, dels en reverse primer. Fragmenten överlappas med två sekvenser så att man lätt ska upptäcka fel vid basecall, alltså nukleotider som satts fel.

Exempel: ATGCCGTATAGCCCGTCGATG F-primer TACGGCATATCGGGCAGCTAC R-primer TACGGCATATCGGGCAGCTA* TACGGCATATCGGGCAGCT* TACGGCATATCGGGCAGC* TACGGCATATCGGGCAG* TACGGCATATCGGGCA* TACGGCATATCGGGC* TACGGCATATCGGG* TACGGCATATCGG* TACGGCATATCG* TACGGCATATC* TACGGCATAT* O.s.v till: T*A*C*G*G*C*A*T*A*T*C*G*G*G*C*A*G*C*T*A*G*C* Figur 5. Sekvensanalys med programmet CongExpress där en övre Forward-primer sekvens jämförs med en nedre Reverseprimer sekvens. N* är fluorescerande nukleotider där OH-gruppen ersatts med en fluorofor, ddntp*. Efter sekvensering analyseras klonerna med ABI 3100 Genetic Analyzer. Proverna körs genom en kapillär som separerar sekvenserna enligt storleksordning samtidigt som ddntp* visualiseras genom fluorescensinmärkningen. Cytosin har en unik inmärkning, Guanin en annan vilket gör att analysmaskinen kan avgöra vilken nukleotid som märkt in varje sekvens (fig. 5). Reaktionen har så många repriser så att alla möjligheter kommer att bildas. När sedan denna mix av sekvenser körs genom sekvensanalysatorn färdas små fragment fortare genom

kolonnen än större. Eftersom de olika nukleotiderna avger olika ljus kan maskinen översätta provet till en enda stor sekvens. Varje cdna-prov från parasiten kontrollerade genom att analysera samtliga prov både med en forward- och en reverse-primer. På detta vis dubbelcheckas att den erhållna sekvensen är riktig oavsett från vilket håll den läses. RESULTAT Som tidigare nämnts, i material & metod, krävdes en koncentration på 150-300 ng/µl plasmiddna till sekvenseringen. Trots att dessa koncentrationer endast fanns i 38 prover lyckades totalt 76 prover sekvenseras. De uppmätta koncentrationerna varierade mellan 5 och 370 ng/µl. De prover som lyckades sekvenseras presenteras i figur 6 där uppmätt koncentration redovisas tillsammans med de prover som jag inte lyckades sekvensera och de prover som inte gav någon träff vid BLAST. Figur 6. Redovisning av koncentrationsfördelningen cdna mellan proverna uppmätta på picodrop 260/280 nm. ProteinBLAST Totalt 79 unika sekvenser BLASTades varav 76 gav en träff i databasen NCBI Gen Bank (fig. 7), vilket resulterade i sammanlagt 21 olika organismer varav 6 nematoder. Organismer som gav träff presenteras i figur 8. För varje BLAST av sekvens fick vi svar på de 5 bästa träffarna klonerna träffat mot. Vi har i detta försök endast tagit med den bästa träffen. Trots flera försök växte inte klonerna i 5 prov på plattorna och de har därmed inte kunnat sekvenseras. Prover med en koncentration <150 ng/µl där sekvensreaktionen lyckades, har tagits med i resultatet tillsammans med övriga prover som hade en koncentration mellan 150 och 300 ng/µl. De flesta sekvenserna gav resultatet hypotetiska proteiner som visar att proteinet i databasen existerar men inte blivit påvisat

exprementiellt i en organism. Figur 7. Resultat vid BLAST av sekvenserades kloner. Genuttrycken har jämförts i en databas med proteinblast där de flesta träffade hypotetiska träffar. I denna figur har vi inte tagit hänsyn till E-värde utan bara bästa BLAST-träff. Figur 8. Procentuell fördelning mellan organismer vid BLAST av editerade sekvenser. Av Totalt 79 sekvenser gav 43 (54%) träff med nematoder och 3 (4%) specifikt med H. contortus. De erhållna sekvenserna var olika långa, och varierade mellan ~150-1400 N. Fördelningen sekvenserna emellan visas i figur 9 där 27 kända proteinträffar (32 %) presenteras tillsammans med övriga organismer som fått proteinträffar på kända proteiner.

Figur 9. Längd på sekvenserade kloner med, vid BLAST, kända proteinuttryck. Sekvensernas längd stämde bra överens med fragmenten vi fick ut vid analys av koloni-pcr på agaros-gel. Totalt 27, varav 14 stycken var nematoder. Vid resultat-analysen visade de olika sekvenserna träffar mot sammanlagt 21 olika organismer, varav 4 (Caenorhabditis briggsae, Caenorhabditis elegans, Clostridium nexile och Brugia Malayi ) ofta var återkommande (Fig. 8). Fig. 10 visar E-värdena för samtliga träffar. Signifikanta E-värden, <E-5 (X. Bai et al. 2009), uppmättes hos 59 (77 %) av 76 av de BLASTade sekvenserna. Flest träffar gav de närbesläktade nematoderna Caenorhabditis briggsae och C. elegans. Nematoder återfanns hos så många som 39 (66 %), av 59 träffar med lägre E-värde än cut-offnivån (Fig 11). Bakterier sågs endast hos 12 (20 %) träffar, medan övriga organismer såsom amfibier, fiskar och däggdjur återfanns bland 8 (14 %) av samtliga 59 träffar med ett E-värde <E-5. 3 prover träffade inget protein i databasen och kan därmed inte redovisas. Figur 10. Den procentuella andelen BLAST träff med ett signifikant E-värde (<10-5 )visade sig vara högt, 75 %.

Figur 11. Fördelning mellan huvudgrupper med E-värde <E-5 där huvuddelen träffade släktingar till H. contortus, nematoder. DISKUSSION Denna studie baseras på 84 unika mrna-kloner från L3 av H. contortus förvarade vid 5 C under 32 veckor. Bara 4 % av sekvenserade kloner gav träff med H. contortus vid BLAST-sökningen, vilket kan förklaras med att det pågående hel-genomsprojekt med parasiten är långt ifrån avslutat. Den största delen av proteinblasten, 21 %, träffade Caenorhabditis briggsae, en nematod som är helgenomsekvenserad (L D. Stein et al. 2003). Den är nära släkt med en annan helgenomsekvenserad nematod, C. elegans (R. Ainscough et al. 1998) vilket var den nematod med näst flest träffar, 15 %. Övriga nematoder som påträffades var Brugia malayi, som även den är helgenomsekvenserad (Scott A. L & Ghedin E 2009), Ancylostoma caninum och Dictyocaulus viviparus som genomgår helgenomsekvensering (Abubucker S et al. 2008; Ranganathan S et al. 2007). Sammanlagt 15 % av träffarna var med Clostridium nexile, som är en anaerob gram-positiv bakterie i Clostridium-släktet (Wiegel J. Et al 2006) Vi satte en cut-off gräns på < E-5 vid BLAST för att sekvensen skulle betraktas som signifikant. Totalt 70 % av de erhållna sekvenserna hade ett lägre värde än detta, vilket visar att de flesta av de unika cdnaklonerna som upptäcktes i detta projekt har likheter med andra redan identifierade proteiner. Sekvenserna som träffade H. contortus kodar för proteiner som ingår i cellmetabolism cytochrome c oxidase subunit 1 och 2 (Roderick A, et al. 1990) och ett protein, GBR-2A, som ingår i glutamat-receptorerna (Catherine L. et al 2001) som ivermectin (nervgift) binder till vid avmaskning. Informationen i databaser utökas ständigt och vid BLAST-sökning av samma sekvenser vid senare tillfällen leder sannolikt till fler träffar och delvis andra slutsatser. Uttryck som kunde förväntats av långtidsförvaringen är till exempel någon sekvens som kodar för metabolisk stress då larverna har lipidreserver som måste ta slut. Dock säger Lettini et al. (2006) att larver i torka, klarar sig bättre i låga temperaturer (0 C) även fast de inte änvänder sig av egen metabolism och det hade varit ett spännande resultat om vi hittat något stressrelaterat.

Ett fåtal prover växte inte på agarplattorna vilket har flera förklaringar. En möjlighet är att bakterierna inte överlevt förvaringen i glycerolstocken vid -80 C under flera år. Ytterligare en möjlighet är att bakterier med ett insert inte kom med vid utstryken till plattorna. Det förekommer att plasmiderna spottas ut, jobbiga att bära på, särskilt när antibiotikan börjar bli gammal. Vi brukar därför förnya våra stockar. Enligt instruktionsmanualen till BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit protocol skall sekvensreaktionen fungera normalt vid plasdmiddna-koncentrationer mellan 150-300 ng/µl. Vi har dock i vissa prov haft koncentrationer med endast ~10 ng/µl, tillsatt 2x volym prov och trots detta fått ut rena sekvenser (fig. 12). Det visade sig alltså att det inte behövs 150 ng/µl för att för att sekvenseringen skall lyckas. Den lägsta möjliga koncentrationen som krävs måste dock undersökas vidare. Figur 12. Sekvensering av ett prov med koncentrationen 16,0 ng/µl Framöver kan vi göra realtids-pcr för att detektera och mäta mängden cdna i klonerna. Vi skulle också kunna undersöka den verkliga biologiska funktionen hos sekvenserna vi fått fram. Vi måste ta reda på vad sekvenserna kodar för och undersöka eventuella proteiners egenskaper med till exepmel 2-D elektrofores som visar proteiners pi och storlek i kda. Då måste vi dock först ta ut vår sekvens ur nuvarande vektor och klona in den i en expressionsvektor. Sammanfattningsvis kan det konstateras att 76 (90 %) av 84 undersökta klonerna gav en lyckad sekvensreaktion som varierade i längd mellan ~150 och ~1350 N. 76 prover har alltså uttryckt något differentiellt vid köldförvaringen 5 C i 32 veckor, vilket är fantastiskt och bör undersökas vidare. Av dessa sekvenser gav 70 (92 %) träff mot en känd organism inlagd i GeneBank, varav hela 43 st (61 %) var med nematoder och då företrädesvis med sådana arter där helgenomprojekt är avslutade eller pågår. Vi kan inte dra några slutsatser om funktionen eller betydelsen av de specifika genuttrycken hos de köldförvarande larverna, utan bara presentera vilka proteiner i databasen våra resultat stämde bäst med vid det aktuella tillfället då BLAST-sökningen gjordes (090422). Eftersom H. contortus ännu inte är helgenomsekvenserad kan vi just nu inte få ut de svar vi söker.

ACKNOWLEDGEMENTS Jag vill fram för allt tacka mina handledare Johan Höglund och Annie Engström på SLU som hjälpt mig med projektet på Ultuna. Tillsammans med dem vill jag också hjärtligt tacka Karin Troell vars projekt jag hjälpt till med. Till sist vill jag tacka alla underbara medarbetare på SWEPAR, både forskning och diagnostik, som hela tiden visat intresse och velat hjälpa till i mitt projekt, ni har varit till stor hjälp. Jag hoppas detta i framtiden kan bidra till en bättre förståelse om Haemonchus contortus. REFERENSER Abubucker S. et al 2008. The canine hookworm genome: analysis and classification of Ancylostoma caninum survey sequences. Molecular and Biochemical Parasitology 157: 187-192 Catherine L. et al. 2001. High-affinity ivermectin binding to recombinant subunits of the Haemonchus contortus glutamate-gated chloride channel. Molevular and Biochemical Parasitology 114: 161-168 Hunt P. W. et al. 2008. Genetic and phenotypic differences between isolates of Haemonchus contortus in Austrailia. International Journal for Parasitology 38: 885-900 Jagannathan S. 1999. Ligand-gated chloride channel subunits encoded by the Haemonchus contortus and Ascaris suum orthologues of the Caenorhabditis elegans gbr-2 (avr-14) gene*1. Molecular and Biochemical Parasitology 103: 129-140 Jambre L. F 1995. Relationship of blood loss to worm numbers, biomass and egg production in Haemonchus infected sheep. International Journal of Parasitology 25: 269-278 Lettini S. E. & Sukhdeo M. V. K 2006. Anhydrobiosis increases survival of Trichostrongyle nematodes. Journal of Parasitology 92: 1002-1009 Ranganathan S. et al 2007. A transcriptomic analysis of the adult stage of the bovine lungworm, Dictyocaulus viviparous. BMC Genomics 8: 311 Roderick A. Capaldi 1990. Structure and function of cytochrome c oxidase. Annual review of Biochemistry. 59:569-596

Rossanigo C. E. & Gruner L. 1995. Moisture and temperature requirements in faeces for the development of free-living stages of gastrointestinal nematodes of sheep, cattle and deer. Journal of helminthology 69: 357-362 Scott A. L & Ghedin E 2009. The genome of Brugia malayi All worms are not created equal. Parasitology International. 58: 6-11 Stein L. D., et al. 2003. The Genome Sequence of Caenorhabditis briggsae: A Platform for Comparative Genomics. PloS Biology 1: 166-192 Thamsborg S. M. 2001. Klinisk haemonchose hos får. Dansk veterinärtidskrift 84: 6-9 The C. elegans Sequencing Consortium et al. 1998. Genome Sequence of the Nematode C. elegans: A Platform for Investigating Biology. Science 282: 2012-2018 Troell K. 2006. Genotypic and phenotypis characterization of Haemonchus contortus in Sweden. Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala. Acta Universitatis Agriculturae Sueciae, No 2006:36 ISBN 91-576-7085-4. Troell K et al. 2005. The development and overwintering survival of free-living larvae of Haemonchus contorts in Sweden. Journal of Helminthology 79: 373-379 Urquhart G.M et al.1996. Veterinary parasitology. 2nd edition. Blackwell Science Ltd. Oxford 307 pp. Wiegel J, Tanner R & Rainey F. 2006. An Introduction to the Family Clostridiaceae. Prokaryotes 4: 654-678 Xiaodong B. et al. 2009. Transcriptomic analysis of the entomophatogenic nematode, Heterorhabditis bacteriophora TTO1. BMC Genomics 10: 1-14