Stabil och antibiotikafri läkemedelsproduktion i rekombinant Escherichia coli

Transkript

1 Stabil och antibiotikafri läkemedelsproduktion i rekombinant Escherichia coli Andrei Vlassov, Grim Elison Kalman, Hugo Swenson, Josefin Ågren, Kristina Benevides & Oscar Broström Beställare: Affibody AB Beställarrepresentant: Karin Stensjö Handledare: Magnus Lundgren 1MB332, Självständigt arbete i molekylär bioteknik, 15 hp, vt 2017 Civilingenjörsprogrammet i molekylär bioteknik Institutionen för biologisk grundutbildning, Uppsala universitet

2 Tack till, Vår handledare Magnus Lundgren som vägledde oss i projektet och stöttade oss med kunskap, råd och uppföljning. Professor Gerhart Wagner som med sin expertis inom prokaryot mikrobiologi hjälpte oss med optimering av genkassetten. Vår beställarrepresentant Karin Stensjö som bistod oss i planeringsfasen och kom med viktiga synpunkter på projektet.

3 Sammanfattning Den här rapporten presenterar ett antibiotikafritt, stabilt och kromosombaserat expressionssystem för läkemedelsproduktion i Escherichia coli på beställning av företaget Affibody AB. E. coli-stammen BL21(DE3) valdes som värdorganism för expressionssystemet. Systemet består av en genkassett som innehåller en T7-promotor, en 5 -UTR från genen ompa och en terminatorsekvens från RNA-operonet rrnb. Fyra kopior av genkassetten ska integreras i pseudogenerna caib, yjjm, hsds och yjiv. En datormodell som modellerar det egentliga kopietalet i cellerna har skapats i mjukvaran MATLAB, vilket visar att det uppskattas vara maximalt 32 kopior av genkassetten per cell på grund av replikation av kromosomen. Ett högt ph i fermentorn; att använda fed-batch och blandade kolhydratkällor; och att använda stammen BL21(DE3) minskar acetatproduktionen i cellen. En lägre acetatproduktion kan leda till en högre produkthalt. En proteinutbytesmodell för mjukvaran MATLAB har konstruerats för att uppskatta koncentrationen av Affibody -molekylen i en E. coli cell.

4 Innehåll 1 Vårt framtagna expressionssystem 1 2 Företaget och beställningen 4 3 Vårt tillvägagångssätt 5 Målet med projektet Hur vi nådde målet Avgränsningar Uppbyggnad av genkassetten 6 Promotor otranslaterat område och 5 -kodande region RBS och Shine-Delgarno UTR:s sekundärstruktur kodande region UTR för systemet otranslaterat område Terminator Stam viktig för produktionen 15 6 Antal kopior av genkassetten 17 Homolog rekombination Kopietal för systemet Område för integration 20 Integrationsplats Försumbara gener Inom högt uttryckt genkomplex Insertionssekvenser Pseudogener Omgivningen kring integrationsplatsen tsepod Nedströms en högt uttryckt gen Avstånd till oric Integrationsplatser för systemet Acetatbildning 27 Acetat bildas av cellen vid hög stress

5 Hur hanterar vi acetat i systemet? Modifiering av tillväxtmedium för reducering av acetat och dess bieffekter Modifiera cellen för minskad acetatproduktion Tillväxtmedium och fermentor 32 Kolhydratskällor ph och tillväxt Fermentor Batch Fed-batch Kontinuerlig Modellering och simulering 37 Kopietalsmodell Uppbyggnad av modellen Parametrar Proteinutbytesmodell Uppbyggnad av modellen Parametrar Initialvärden Etisk analys Slutsats Referenser Bilagor 65 A: Bedömningskriterier för stam och promotor B: Sekvens för genkassetten C: Härledningar till proteinutbytesmodellen Initialvärden D: Övriga resultat för protienutbytesmodellen E: MATLAB-kod för kopietalsmodell (FinalCopyNr.m) F: Bilaga: MATLAB-kod för proteinutbytesmodell MATLAB-funktionen med ODEs (ODEsForYield.m) MATLAB-skript som löser ODEs (YieldSimODE.m)

6 1 Vårt framtagna expressionssystem Vi har valt att göra expressionssystemet kromosombaserat, d.v.s. att genkassetten integreras på bakteriens kromosom istället för på en plasmid, då detta var något Affibody AB var intresserade av. I teorin ska detta medföra att systemet blir antibiotikafritt och bidra med stabilitet. En antibiotikaresistensgen på plasmiden i kombination med att antibiotika tillförs säkerställer att cellerna behåller plasmiden med den rekombinanta genen. Ingen antibiotika krävs i ett kromosombaserat system då risken för att cellen förlorar plasmiden med den önskade genen inte finns kvar. Med ett kromosombaserat system ökar även stabiliteten eftersom vi undviker den genetiska instabiliteten plasmidsystem har, exempelvis risken att det blir en ojämn fördelning av plasmider i dottercellerna och därigenom att vissa celler blir plasmidfria. Vi utgick från E. coli-stammen BL21(DE3) då denna är välanvänd inom rekombinant expression i industrin [1]. Den har reducerad acetat produktion, en förhållandevis hög tillväxthastighet jämfört med andra E. coli-stammar och kan uppnå en hög kvantitet av biomassa [2][3]. Då man har integrerat genen för T7-RNA-polymeras, som ligger under kontroll av en lacuv5-promotor, är den anpassad för att fungera med en T7-promotor [4]. Systemets genkassett har designats enligt Figur 1. Valet av T7- promotorn grundades i att det är en väletablerad promotor, är testad i kromosomala system och att den ger ett högt uttryck av den rekombinanta genen [5][6]. En sekundärstruktur likt en hårnål i 5 - UTR av mrna:t ökar mrna:ts stabilitet. Vi har utifrån detta valt att ta genen ompa:s 5 -UTR-sekvens, på grund av dess mrna:s höga stabilitet [7]. Termineringssekvensen från RNA-operonet rrnb som består av terminatorerna T1 och T2 valdes till genkassetten. Detta då T1 och T2 är effektiva och välanvända inom expressionsvektorer [8]. 1

7 Figur 1: Schematisk bild över vår designade genkassett där de huvudsakliga delarna visas. Genkassetten består av en T7-promotor (i orangeotranslaterade), 5 -UTR från genen till proteinet ompa (i grönt), Affibodygenen (i lila) och termineringssekvensen från RNA-operonet rrnb (T1 och T2 i rött och spacern i grålila). Linjalen ovanför mäter i baspar. Denna genkassett integreras i de fyra pseudogenerna caib, yjjm, hsds och yjiv på kromosomen. Dessa valdes på grund av att de saknar funktion och att integrationen av en genkassett därför inte stör cellens fysiologi [9]. Områdena ligger nära oric vilket ökar antalet kopior av genkassetten genom replikation av kromosomen [10]. De är inte en transcriptionally silent Extended Protein Occupancy Domain vilket kan orsaka repression av genen[11]. Slutligen ligger de inte nedströms någon högt uttryckt gen som skulle kunna sänka genuttrycket [11]. Valet av fyra kopior gjordes utifrån de studier som Gu m. fl. [12] och Su m. fl. [13] har gjort där produktionen ökade med antalet kopior upp till 2 4 stycken. Därefter verkade inte fler kopior ha någon större effekt på systemet. Cellerna med de integrerade genkassetterna ska sedan växa under fed-batch-fermentation. Fed-batch minskar acetatproduktionen och har relativt låga driftkostnader. Risken för mutationer i fed-batch är låg relativt kontinuerlig fermentation [14]. Ett självinducerande medium bestående av glukos, glycerol och laktos, där laktos fungerar som inducerare, används som tillväxtmedium. Att använda laktos istället för IPTG undviker nyttjandet av ett toxiskt ämne. Med detta medium undviker man de biverkningar som uppstår med glukos som primär kolkälla, t.ex. en högre acetatproduktion. Att systemet är autoinducerande är också en positiv aspekt då man inte behöver bevaka optisk densitet för inducering [15]. 2

8 Vi föreslår ett ph runt 7,5 8,5 i bioreaktorn utifrån den studie som Wang m. fl. [16] gjorde. Där fick de en ökad celltillväxt på 71 % vid ett ph på 7,5 jämfört med ph runt 6,5. Utöver detta erhölls även en minskning av intracellulärt acetat med 50 %. 3

9 2 Företaget och beställningen Affibody AB är ett bioteknikföretag med två unika plattformar för produktion av proteinläkemedel: Affibody -molekyler och Albumod. Affibody AB:s nuvarande expressionssystem för att producera sina proteinläkemedel i rekombinant Escherichia coli (E. coli) är plasmidbaserat och använder en gen för kanamycinresistens som selektionsmarkör. För att få en mer hållbar läkemedelsproduktion vill Affibody AB komma ifrån användandet av antibiotika. Företaget vill även öka sin produktion. Vi fick därför i uppdrag att ge förslag på strategier för att få Affibody AB:s expressionssystem för läkemedelsproduktion antibiotikafritt, mer stabilt och mer förutsägbart över flera generationer. 4

10 3 Vårt tillvägagångssätt Målet med projektet Med utgångspunkt från beställningen av Affibody AB är målet att ge ett förslag på ett expressionssystem. Expressionssystemet ska vara mer stabilt genom att vara kromosombaserat och även vara antibiotikafritt. Systemet ska innehålla en genkassett som är uppdelad i komponenter. För varje komponentval ska olika alternativ diskuteras. Expressionssystemet som föreslås ska inte producera en mindre mängd protein än Affibody AB:s nuvarande system. En översikt över fördelar och nackdelar ska ges för alla komponentalternativ. Förslaget och alternativen som diskuteras ska ge Affibody AB en överskådlig bild över alternativa expressionssystem och hjälpa dem i arbetet mot en mer hållbar läkemedelsproduktion. Hur vi nådde målet Expressionssystemet som presenteras har delats upp i komponenter. Komponenterna är genkassett, stam, kopietal, område för integration, acetatbildning och förhållande i bioreaktorn. Systemets genkassett består av en promotor, 5 -otranslaterade områden (på engelska: 5 -untranslated region, förkortat 5 -UTR ) och 3 -otranslaterade områden ( 3 -UTR ). Varje komponent utvärderas för att teoretiskt kunna fastställa att systemet inte producerar en avsevärt lägre mängd protein än det nuvarande. För vissa komponenter har vi sammanställt bedömningskriterier för utvärderingen. För att testa vissa delar av systemet byggdes två datamodeller med MATLAB. Avgränsningar Inom projektets ramar ingår endast teoretiska resonemang och därför utförs inga praktiska laborationer, utöver datamodelleringen. Detta medför att vi inte kan testa systemet och därmed inte kommer få några riktiga värden på stabilitet, proteinuttryck etc. 5

11 4 Uppbyggnad av genkassetten Olika steg av proteinproduktionen kan påverkas för att få en högre produktmängd. De två övergripande delarna som kan manipuleras är transkriptions- och translationssteget. En genkassetts potentiella komponenter påverkar en av dessa två steg för att öka halten protein som produceras. De komponenter som vi har valt för genkassetten är en promotor, ett 5 -otranslaterat område och ett 3 -otranslaterat område. Promotor Promotorsekvensen relateras till transkriptionssteget då promotorn påverkar hur pass ofta RNA-polymeras påbörjar transkriptionen av en gen. En starkare promotor ger upphov till att fler transkript som kan translateras till protein genereras. Beroende på vilken promotor som används kan även ett promotorspecifikt RNA-polymeras väljas. Dessa RNA-polymeras har hög affinitet för vissa promotorer. Inducering kan därmed styras genom att uttrycket av genen för RNA-polymeraset kontrolleras. Enligt Jia & Jeon [5] ska en promotor väljas utifrån fyra aspekter: 1. Promotorn ska vara så pass stark att den kan producera det rekombinanta proteinet till % eller högre av den totala proteinproduktionen som cellen har. 2. Promotorn ska också klara av att ha en väldigt liten aktivitet under de perioder då man inte vill att det rekombinanta proteinet ska uttryckas. 3. Promotorn ska på ett enkelt sätt kunna induceras, där det substrat som inducerar inte får kosta för mycket. 4. Promotorns aktivitet ska vara justerbart med hög specificitet. 6

12 Utifrån de jämförelser som gjordes i Tabell 10 (se bilaga A) valde vi T7-promotorn. Denna promotor är med i det populära petplasmidsystemet, som är det mest använda systemet för rekombinant proteinuttryck. Detta gör T7-promotorn till en välanvänd och väldokumenterad promotor [5]. Den har även använts i ett kromosombaserat system med stammen BL21(DE3) [6]. T7-promotorn möter det första kravet Jia & Jeon [5] ställer då den kan generera rekombinant protein upp till 50 % av det totala proteinutbytet hos en cell [5][17]. I DE3-stammarna ligger även T7-RNApolymeraset under kontroll av en lac-operator vilket gör promotorn kontrollerbar [5]. Detta gör att den även uppfyller krav två och fyra eftersom man kan anpassa koncentrationen av induceraren, vilket leder till att man kan reglera uttrycksnivån [18]. En vanligt använd inducerare är isopropyl β-d-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) eftersom dess struktur gör att den kan binda till lac-repressorn. Till skillnad från den naturliga induceraren allolaktos (en omvandlad form av laktos) kan inte IPTG brytas ned av cellen. T7-promotorn har även ett lågt basalt uttryck när den inte är inducerad. Denna term refererar till att en mindre mängd rekombinant protein uttrycks, trots att systemet ej är inducerat. Även om detta är en fördel gentemot andra promotorer är det fortfarande gynnsamt om det basala uttrycket hålls till ett minimum. Problemet med att ha ett basalt uttryck konstateras genom att säga att promotorn läcker [17]. För att minska det basala uttrycket kan en lac-operator sättas mellan T7-promotorn och genen. Promotorn blir då en T7-lac-promotor [17]. T7-lac-promotorn fungerar genom att lac-repressorn, som kodas av genen laci, binder till lac-operatorn. Detta leder till att T7- RNA-polymeras inte kan transkribera den rekombinanta genen. När en inducerare tillsätts förändras strukturen på lac-repressorn så att den släpper från operatorn och genen kan då transkriberas [5]. T7- lac-promotorn ger ett högt uttryck av genen, är lätt att inducera, lätt att kontrollera och den läcker inte lika mycket som en vanlig T7-promotor. Den har även testats i kromosombaserade system [19]. 7

13 Vi har valt att inte använda T7-lac-promotorn på grund av det antal kopior av genkassetten som vi önskar att sätta in och att lac-operatorn destabiliserar genens mrna:s sekundärstruktur. Vi misstänker att antalet lac-repressorer som cellen producerar inte kommer att räcka till för att inhibera alla de kopior som vi vill ha i kromosomen. Detta utifrån beräkningar gjorda av Semsey m. fl. [20] som säger att det, i en cell, i snitt finns ca 15 stycken lac-repressorer för en laci-gen. BL21(DE3)-stammen har två laci-gener [21] vilket innebär att det i genomsnitt borde finnas ca 30 lac-repressorer i en cell. Dessa ska inhibera T7-RNA-polymerasgenen, lac-operonet och vår genkassett med ett kopietal på 16 eller 32 (se kapitel 6 och 10 sektion Kopietalsmodell) vid en given tid. I studien av Semsey m. fl. [20] hade man dock genen på en plasmid och försöket utfördes in vitro vilket gör att vi inte helt säkert vet hur många lac-repressorer som kommer att produceras i vårt system. Fortsättningsvis önskar vi att ha en speciell sekundärstruktur på det mrna som transkriberas för att öka dess stabilitet (se kapitel 4 sektion 5 -UTR:s sekundärstruktur) vilket blir omöjligt om vi har lac-operatorn efter T7-promotorn på grund av dess linjära struktur i början av sekvensen (se Figur 2). I och med detta och det faktum att vi inte kan vara helt säkra på att alla kopior av genkassetten blir inhiberade av lac-repressorn, så har vi valt att använda en T7- promotor utan en lac-operator. tac- och trc-promotorer diskuterades också för systemet. Dessa promotorer har ett högt basalt uttryck, vilket betyder att de producerar en del protein även i ett icke-inducerat tillstånd. I ett inducerat tillstånd ger dessa promotorer ett relativt högt genuttryck. De är inducerbara med IPTG och är därmed reglerbara. De kan få ut % rekombinant protein av det totala proteinuttrycket [22]. Efter jämförelse med T7 uteslöts dessa promotorer, då T7-promotorn är starkare och har ett lägre basalt uttryck [5], samt att relevant forskning om dessa promotorer i kromosomala system saknades. 8

14 Figur 2: Sekundärstrukturen för lac-operatorn när den är transkriberad till RNA. Den är linjär i 5 änden. Strukturen är predikterad av mfold web server. Var tjugonde bas markeras i bilden. Vi tittade också på den värmeinducerade pl/pr-promotorn från λ- fagen som undviker nyttjandet av toxiska induceringsmedel såsom IPTG (läs mer om detta i kapitel 9). Man inducerar genom att höja temperaturen till över 37 C vilket, utöver den metaboliska stressen som den rekombinanta proteinproduktionen ger, leder till en ytterligare stressreaktion hos cellen. Denna stressreaktion orsakar att cellen börjar bryta ned det proteinet som inhiberar promotorn och därmed aktiveras promotorn. 9

15 pl/pr-promotorn är lätt att justera, men eftersom det tar längre tid att ändra temperaturen när volymen är större kan man inte skala upp produktionen allt för mycket [23]. Efter jämförelse med T7-promotorn valde vi att inte gå vidare, då relevant forskning om pl/pr-promotorn i kromosomala system saknades. Ytterligare en anledning till valet av T7 över pl/pr är att pl/pr vid ett optimalt system har ett rekombinant proteinuttryck motsvarande 30 % av cellens totala proteinuttryck [23] medan T7-promotorn har ett rekombinant proteinuttryck motsvarande 50 % [5]. 5 -otranslaterat område och 5 -kodande region Komponenterna 5 -otranslaterat område (5 -UTR) och 5 -kodande regionen av en genkassett påverkar translationssteget i proteinproduktionsprocessen. 5 -UTR är regionen vid 5 -änden av genkassetten som transkriberas till mrna men som inte translateras i steget därpå. Allt som ligger mellan transkriptionsstarten efter promotorn och startkodonet är en del av 5 -UTR (se Figur 3). Figur 3: 5 -UTR är den region mellan det första transkriberade basen och startkodonet på genen. På bilden är 5 -UTR (markerat i grönt) mellan sista G:et i T7- promotorn (markerat i brunt) och startkodonet GTG (markerat i lila). T7-promotorn är markerad i orange. En essentiell komponent av 5 -UTR är ribosomets bindningsställe (på engelska: ribosome-binding site, förkortat RBS ). RBS:en består i sin tur av en Shine-Delgarnosekvens (SD) vilket är en sekvens på mrna:t som ribosomen basparar till för att kunna påbörja translation. 10

16 5 -kodande regionen är gensekvensen mot 5 -änden som till skillnad från 5 -UTR translateras till aminosyror (se Figur 4). Det är inte definierat vilket intervall som den 5 -kodande regionen är mellan utan den bestäms utifrån vilket sammanhang som regionen diskuteras. Figur 4: Förenklad bild av en typisk 5 -kodande region. I detta fall är den 5 -kodande region de första kodonen i själva genen (markerat i lila). I figuren syns även 5 -UTR (markerat i grönt) och en T7-promotor (markerat i orange). RBS och Shine-Delgarno Shine-Delgarno (SD) är en sekvens uppströms om startkodonet som basparar med 16S rrna av ribosomen och är en del av RBS:en. SD-sekvensen är viktig för en ökad expression av en gen [24]. Flera RBS:er randomiserades för en gen för proteinet β-galaktosidas av Barrick m. fl. [24]. De noterade att aktiviteten av proteinet varierade mycket med olika RBS:er och att i vissa fall var aktiviteten noll. Det är rimligt att anta att RBS:en har en hög påverkan på uttrycket, då oavsett hur mycket och snabbt mrna skapas i transkriptionssteget har detta ingen betydelse om ribosomen inte binder lätt till mrna:t för att påbörja translation. 5 -UTR:s sekundärstruktur Utöver själva sekvensen i 5 -UTR är dess sekundärstruktur, när det transkriberats till RNA, viktig för en hög expression. Sekundärstrukturen av 5 -UTR i mrna:t påverkar dess stabilitet och livslängd [5][7]. Det kan ske en 600-faldig skillnad i proteinproduktion när nukleotider i 5 -UTR ändras så att sekundärstrukturen av mr- NA:t blir annorlunda [5]. Naturliga gener med stabila mrna brukar ha distinkta hårnålssekundärstrukturer i 5 -UTR. Dessa fungerar som skydd mot ribonukleaser, enzym som bryter ner RNA. 11

17 Membranproteinet outer membrane protein (ompa) har ett stabilt mrna på grund av en sådan struktur (se Figur 5). Genen som uttrycker ompa har samma namn som proteinets förkortning: ompa. Livslängden av geners mrna kan ökas genom att slå samman genen med ompa:s 5 -UTR [7]. Figur 5: En hårnålssekundärstruktur i 5 -änden på mrna:t skyddar den från nedbrytning av ribonukleaser. Sekvensen upptill de lila baserna är ompa:s 5 -UTR transkriberat till RNA. En stor hårnålssekundärstruktur finns vid 5 -änden av mrna:t. De lila baserna är början på genen och de orangea baserna är Shine-Delgarnosekvensen. Strukturen är predikterad av mfold web server. 12

18 5 -kodande region Även den kodande regionen mot 5 -änden av en gen är relaterad till translationsinitiering och proteinexpression. Detta är eftersom ribosomen interagerar med nukleotider på vardera sida av startkodonet [5]. Startkodonet och de första kodonen är en del av den kodande regionen som är viktig för en hög expression av en gen [24]. Ringquist m. fl. [25] jämförde olika startkodon och observerade att translationsinitieringen skedde mer effektivt med det vanligare startkodonet AUG. De noterade även att beroende på vilket startkodon som används kan det andra kodonet i olika grad ha en inflytelse på translationsinitieringen och därmed expressionsnivån av en gen. 5 -UTR för systemet För att öka stabiliteten av mrna:t för Affibody -genen har vi fuserat den med 5 -UTR från genen ompa. Detta kommer öka antalet mrna som translateras och kommer därför resultera i en högre produkthalt. RBS:en och SD-sekvensen från ompa har lämnats kvar för att undvika den potentiella risken att systemet inte fungerar på grund av att samspelet mellan 5 -UTR från ompa och en ny RBS inte är möjlig. 3 -otranslaterat område Terminator Terminatorer som stoppar transkriptionen är viktiga för en funktionell genkassett. Effektiva terminatorer ökar antalet RNA-polymeras som är tillgängliga för transkription. I prokaryoter finns det två huvudsakliga typer av transkriptionsterminering: Rho-beroende eller Rho-oberoende. Vid Rho-beroende terminering krävs proteinet Rho vilket får det transkriberade RNA:t att lossna från DNAsträngen. Rho-oberoende beror istället på en signal som kodas i DNA-strängen, mer specifikt en palindromisk region som kodar för en GC-rik hårnålsstruktur som efterföljs av flera T-baser [26][27]. 13

19 Vi har valt tandem termineringssekvenserna T1 och T2 till vårt expressionssystem. Dessa sekvenser kommer från rrnb-operonet i E. coli och är vanligt förekommande delar i terminatorer för expressionsvektorer. Operonet rrnb är ett av sju som kodar för ribosomalt RNA (rrna) i E. coli. Gemensamt för dessa rrna-operon är att de avslutas med Rho-oberoende transkriptionsterminatorer och i fallet med rrnb är dessa T1 och T2. Terminatorerna T1 och T2 är båda effektiva terminatorer och det har visats att de delar karaktärsdrag med icke-ribosomala Rho-oberoende terminatorer. Exempel på detta är att alla har komplicerade hårnålsstrukturer med GC-rika regioner [8]. 14

20 5 Stam viktig för produktionen Olika stammar av E. coli har tagits fram för diverse ändamål där de vanligast förekommande är understammar från B- och K-12- stammarna. Till en början användes B-stammar för att undersöka virulenta bakteriofager under 1940-talet [28]. Idag finns det en mängd olika framtagna B-stammar för bland annat storskalig proteinproduktion [29]. K-12 vildtypstammen isolerades från en patient på 1920-talet och har sedan dess haft en stor betydelse för forskningsexperiment och har även gett upphov till stammar för produktion [30]. Vi valde att fokusera på B-stammar då dessa har vissa fördelar över K-12-stammar för industriell proteinproduktion. För vårt expressionssystem har vi valt stammen BL21(DE3) då vi utifrån våra kriterier bedömer att BL21(DE3)-stammen är den mest lämpade (se Bilaga A; Tabell 8 och Tabell 9). Stammen är väletablerad i industrin och vanligt förekommande för industriell rekombinant proteinproduktion [1]. För storskalig produktion är BL21(DE3) intressant då stammen producerar mindre acetat (för mer information, se kapitel 8; Acetatbildning) jämfört med andra i industrin vanligt förekommande stammar som K-12-stammar. Dessutom kan den uppnå högre biomassa och högre tillväxthastighet [2][3]. BL21(DE3) är en understam av BL21. En viktig skillnad mellan dem är att genen för T7-RNA-polymeras har förts in i genomet hos BL21(DE3) och kontrolleras av den inducerbara lacuv5-promotorn [4]. Därmed används stammen rutinmässigt med T7-promotorn. Eftersom vi valde att gå vidare med T7-promotorn var detta alternativ alltså intressant. Två andra införda mutationer hos BL21(DE3) inaktiverar två proteaser (lon, ompt) vilket är fördelaktigt för proteinproduktion då det ökar det rekombinanta proteinets stabilitet [1]. 15

21 Det finns en version av BL21(DE3)-stammen, BL21(DE3)pLysS, som uttrycker T7-lysozym. T7-lysozymet binder och inhiberar T7- RNA-polymeraset innan induktion sker. Detta medför att T7-promotorns basala expressionsnivå dämpas och uttrycket blir tajtare. En nackdel med detta är dock att man sett en minskning i tillväxthastigheten, vilket kan bero på att T7-lysozymet även klipper en specifik bindning i bakteriens peptidoglykanlager. E. coli dör inte av lysozymet, då det inte kan ta sig genom innermembranet till peptidoglykanlagret. Vid nedfrysning kan dock innermembranet ta skada och orsaka lysering även vid låga koncentrationer av T7-lysozym [31]. 16

22 6 Antal kopior av genkassetten Med en genkassett konstruerad och en stam vald är nästa steg att välja hur många kopior det ska vara på kromosomen. Frågan om hur kopietalet påverkar uttrycket besvaras olika beroende på vilken källa som studeras. Detta antyder på att kopietalets påverkan beror på kontexten. Vilka komponenter genkassetten består av, vart genen integreras och många andra faktorer som påverkar uttrycksnivån av genen kan lägga olika grunder för diskussionen om hur kopietal påverkar genuttryck. Detta kan i sin tur leda till att olika källor hävdar helt olika påståenden om samband mellan kopietal och genuttryck. Om en genkassett är optimalt konstruerad och positionerad kan ett lägre kopietal vara tillräckligt, medan om systemet är mindre optimalt kan ett högre kopietal vara nödvändigt. Su m. fl. [13] testade olika kopietal av en genkassett som uttryckte genen för enzymet xylos reduktas. Systemet bestod av en P43- promotor och integrerades i insertionssekvens-5-områden (IS-5) i E. coli-stammen K-12 MG1655. I deras fall fann de att när kopietalet ökade så ökade även proteinproduktionen. Det fanns dock inget linjärt samband mellan dem då proteinproduktionen stagnerade efter 2 4 kopior. Gu m. fl. [12] hade liknande resultat när de uttryckte genen arok där proteinproduktionen inte ökade när kopietalet var högre än två. Yin m. fl. [32] införde hela 50 kopior av en gen och fick ett utbyte som motsvarade det korresponderande plasmidbaserade systemet med samma medel-kopietal. Definitionen av medelkopietal varierar bland forskare men det brukar vara runt kopior av en plasmid per cell [33]. I andra fall har en kopia varit tillräcklig för gynnsamma resultat. Schulga m. fl. [34] fick ett högre uttryck av en gen än det korresponderande plasmidbaserade systemet med en kopia. Kontexten i detta sammanhang var att en T7-promotor användes och genen introducerades i lacz-genen i stammen BL21(DE3). Striedner m. fl. [6] använde, likt det tidigare fallet, en kopia av en gen med en T7-promotor. De testade även en T7-lac-promotor. I deras system 17

23 var genkassetten positionerad i locus atttn7 i E. coli-stammen BL21(DE3). De lyckades få en produktkoncentration på 5,7 7,5 g/l. Yin m. fl. [35] införde en kopia av en gen i genkomplexet för den naturligt högt uttryckta poringenen och producerade 9,16 g/l produkt. Man kan tänka sig att ett högre kopietal skulle kunna leda till ett mer stabilt system. Utifall att en av de införda generna skulle muteras, och på så vis inte skulle koda för det sökta proteinet längre, finns det fortfarande fler kopior kvar av samma gen och cellen skulle därmed fortsätta produktionen. Det finns argument för att ett högre kopietal även skulle kunna göra systemet mer instabilt på grund av homolog rekombination. Homolog rekombination I bakterier används homolog rekombination huvudsakligen för reparation av DNA-sekvenser i kromosomen under replikering. Denna process leder till att identiska sekvenser mellan den nya kromosomen och den gamla kromosomen byter plats. Alltså att en del av ursprungskromosomen hamnar på dotterkromosomen och den motsvarande delen av dotterkromosomen hamnar på den ursprungliga kromomen [36]. När det finns flera närliggande identiska sekvenser på samma kromosom är det rimligt att anta att det skulle finnas fall där det sker homolog rekombination mellan dessa, istället för med den identiska sekvensen på ursprungskromosomen. Just på grund av att en del av de identiska sekvenserna byter plats under homolog rekombination kan de konsekvenser som syns i Figur 6 hända. Om de identiska sekvenserna har riktningar i motsatt håll sker en inversion av sekvensen mellan dem. Om de istället ligger i samma riktning kan det ske en deletion av sekvensen mellan dem och att man förlorar en kopia av genkassetten. Beroende på vad som ligger mellan sekvenserna kan detta ge olika stora konsekvenser. Är det exempelvis oric som ligger mellan kan detta leda till att cellen dör. 18

24 Figur 6: A: Homolog rekombination mellan två homologa sekvenser på samma kromosom med motsatt riktning leder till att den mellanliggande sekvensen blir omvänd. B: Om de homologa sekvenserna ligger i samma riktning kan en deletion ske. Kopietal för systemet Hur kopietalet påverkar uttrycket beror, som nämnt innan, på kontexten. Ett mindre optimalt system kan behöva ett högre kopietal för att uppnå en hög proteinproduktion. Det är smidigast att testa olika kopietal för ett system för att bedöma kopietalets påverkan. Då vi inte kan testa vårt system praktiskt antas det, som en säkerhetsåtgärd, att vårt system inte uppfyller de optimalitetskriterier som krävs för att bara ha en kopia. Ett för högt kopietal ökar risken för att genkassetterna deleteras via homolog rekombination. Vi valde därför att ha fyra kopior av genkassetten på kromosomen, med stöd från forskningen bedriven av Su m. fl. [13] och Gu m. fl. [12]. I och med valet av fyra kopior kommer vi att med tiden få ett högre kopietal i en viss cell på grund av överlappande replikation (se kapitel 10). 19

25 7 Område för integration Integrationsplats När en gen ska integreras i en bakteries kromosom är det rimligt att leta efter neutrala platser att göra detta i. Neutrala platser har egenskapen att handlingen av att tillsätta en önskad gen i en sådan plats inte resulterar i att cellens fysiologi påverkas negativt på något vis, utöver effekten av att den nya genen uttrycks. Sådana platser söks efter då expression av en tillförd gen kan maximeras om bakteriens hälsa tas hänsyn till, eftersom bakterien lättare reproducerar och därmed producerar fler bakterier med den tillförda genen. Det finns olika typer av integrationsplatser som definitivt inte resulterar i att cellens fysiologi påverkas negativt. Detta är givet att klassificeringen av integrationsplatsen är korrekt. Finns det någon osäkerhet kring klassificeringen så kan något som inte är känt men nödvändigt för cellen ligga i det området. Introduktionen av en gen kan då störa processer som den nödvändiga komponenten är delaktig i, vilket kan vara skadligt för cellen. Försumbara gener Gener som inte är viktiga för bakterien, givet rådande omständigheter, är neutrala integrationsplatser. Generna lacz, lacy och laca är försumbara gener i stammen BL21(DE3) [9], förutsatt att laktos inte används som inducerare eller som beståndsdel i näringsmediet. Slås dessa gener ut genom integrationen av en genkassett sker inte några oönskade fysiologiska effekter. lacz-genen har manipulerats i tidigare experiment utan att tillväxten hos E. coli förminskats [34]. Integration av en genkassett som bestod av mänskligt växthormon i lacz-genen har utförts tidigare, där genexpressionen var högre än det korresponderande plasmidbaserade systemet [34]. 20

26 Inom högt uttryckt genkomplex Det går att utnyttja det faktum att vissa proteiner redan har ett högt uttryck. Idén är att sätta in en gen i samma genkassett som det högt uttryckta proteinet tillhör. Den gen som önskas uttryckas ska alltså sättas in någonstans mellan promotorn och terminatorn för det högt uttryckta proteinet, utan att slå ut det. Yin m. fl. [35] introducerade en kopia av en gen nedströms poringenen, som har ett naturligt högt uttryck, i bakterien Halomonas sp (se Figur 7). Med det systemet producerades 9,16 g/l produkt. Figur 7: Genom att sätta in sin gen efter en naturligt högt uttryckt gen kunde Yin m. fl. [35] uttrycka stora mängder protein i bakterien Halomonas sp. Mellan generna var en 15 bp lång sekvens innehållande en RBS. Insertionssekvenser Insertionssekvenser är områden där en önskad gen kan integreras utan att bakteriens överlevnad påverkas [13]. Dessa sekvenser kodar för enzym som förflyttar insertionssekvensen till en annan plats på kromosomen. Insertionssekvenser kallas därför för mobila element. På vardera änden av generna som kodar för förflyttningsenzymen finns identiska men omvända sekvenser (se Figur 8). Figur 8: Schematisk bild av en typisk insertionssekvens. LIR står för Left inverted repeat och RIR för Right inverted repeat (markerade i lila). Transposaset är det enzym som medger en förflyttning av insertionssekvensen. 21

27 En genkassett kan integreras i kromosomen genom att de två omvänt identiska sekvenserna för en insertionssekvens placeras på vardera änden av genkassetten. Detta kan göras på en plasmid. Via homolog rekombination överförs konstruktionen från plasmiden till kromosomen (se Figur 9). Det som sker är att förflyttningsenzymen på kromosomen byts ut med genkassetten. Genkassetten kan bara överföras till områden i kromosomen där samma insertionssekvens, från var de omvänt identiska sekvenserna tagits, är närvarande. Figur 9: Översiktlig bild på en integration av en genkassett i kromosomen m.h.a. en insertionssekvens via homolog rekombination. CmR står för kloramfenikolresistens gen och IS för insertionssekvens. Att införa en genkassett i insertionssekvens 5 (IS5) via reca-assisterad homolog rekombination har visats fungera [13]. Den homologa rekombinationen skedde med hjälp av rekombinationsenzymet reca. En kloramfenikolresistensgen användes som selektionsmarkör för att säkerställa att genkassetten integrerats, men klipptes bort efteråt. I BL21(DE3)-stammen finns det inga IS5-sekvenser men det finns totalt 49 insertionssekvenser utifrån genomsekvensen som Jeong m. fl. [21] publicerat. Pseudogener Pseudogener är sekvenser som tidigare varit funktionella men som med tiden tappat sin funktion. Genkassetter kan integreras i pseudogener utan att cellens funktioner påverkas [9]. Nakashima m. fl. [9] utförde två olika experiment där de i det första använde pseudo- 22

28 genen yghx och i det andra pseudogenen ygem som integrationsplats i E. coli-stammen MG1655. Genen för det detekterbara proteinet mcherry uttrycktes i båda experimenten. Visserligen hade dessa system lägre uttryck än de korresponderande plasmidbaserade systemen, men detta förklarade artikelförfattarna med att det kromosombaserade systemet hade ett lägre kopietal. De testade även pseudogenerna ybfg och yeel som integrationsplatser. E. coli-stammen BL21(DE3) har 70 pseudogener [21]. Pseudogenen yeel finns i denna stam men inte yghx, ygem och ybfg. Omgivningen kring integrationsplatsen Utöver den position genkassetten introduceras i är även omgivningen kring denna position av vikt för att få ett högt uttryck [11][10]. Omgivningen kan orsaka ett lägre än optimalt uttryck eller till och med inget uttryck alls av en gen. Exempelvis kan repression ske om genen integreras i en s.k. transcriptionally silent Extended Protein Occupancy Domains (tsepod). Faktorer som avståndet till andra delar av kromosomen, till exempel replikationsstart (oric) eller andra högt uttryckta gener, kan tilläggningsvis vara av stor betydelse. tsepod När Bryant m. fl. [11] satte en genkassett inom en transcriptionally silent Extended Protein Occupancy Domain (tsepod) noterade de att genen uttrycktes i lägre grad relativt när genen integrerades i ett locus som inte var av denna typ. Enligt artikelförfattarna sker repression av genen när den placeras i en tsepod. Det går att kringgå detta problem genom att istället byta ut tsepod:en med genkassetten. 23

29 Nedströms en högt uttryckt gen Bryant m. fl. [11] hävdar att repression av en gen kan ske om den placeras nedströms relativt andra högt uttryckta genkomplex. De drog denna slutsats när de noterade att uttrycket av en genkassett var lägre när denna integrerades nära operon som kodar för rrna och trna gentemot andra loci. Detta trodde de beror på den hårdare tvinningen av DNA:t framför RNA-polymeraset som påverkar transkriberingen nedströms. Det är viktigt att notera skillnaden mellan att placera en genkassett nedströms relativt ett högt uttryckt genkomplex och att placera en gen inom ett högt uttryckt genkomplex. Det senare fallet kan snarare höja uttrycket av genen och behandlas i det tidigare avsnittet Inom högt uttryckt genkomplex. Avstånd till oric Genuttrycket beror på hur nära en gen är replikationsstart (ORI). I Escherichia coli kallas replikationsstarten på kromosomen för oric. Replikeringen av kromosomen orsakar att det existerar fler kopior av de gener som är nära oric (se Figur 10) [10]. Då det finns fler kopior av genen kan genen komma att uttryckas mer. Figur 10: Genens position på kromosomen gör att en kopia motsvarar fyra efter en viss tid vid överlappande replikation (för mer information se kapitel 10). Den ursprungliga kromosomen indikeras i brunt medan påbörjade kromosomer visas i blått, rött och lila. 24

30 Integrationsplatser för systemet Vi valde fyra integrationsplatser i E. coli-stammen BL21(DE3). De aspekter vi tog hänsyn till var att platserna skulle vara neutrala integrationsplatser, inte vara tsepod:s, inte vara nära nedströms relativt högt uttryckta gener och att avståndet till oric skulle vara minimalt. Loci som jämfördes var: De fyra pseudogenerna som är närmast oric: caib, yjjm, hsds och yjiv. Pseudogener testade av Nakashima m. fl. [9]: yeel. lac-gener: lacz, lacy och laca. Alla loci var neutrala integrationsplatser och inte tsepod:s. Det återstod att välja de platser med lägst avstånd till oric och sedan att undersöka att det inte fanns högt uttryckta gener i närheten. De fyra pseudogenerna caib, yjjm, hsds och yjiv var närmast oric och hade varken rrna- eller trna-gener i närheten. Dessa platser valdes därför som primära kandidater för integrationen av genkassetten. Positionerna och avstånden till oric för alla kandidater presenteras i Tabell 1. Avstånden till oric från de rrna- och trna-generna som är närmast de fyra pseudogenerna caib, yjjm, hsds och yjiv visas i Tabell 2 och 3. Värdena presenterade i Tabell 1 3 är tagna från det annoterade helgenomsdata för BL21(DE3) publicerat av Jeong m. fl. [21]. 25

31 Tabell 1: Locuskandidaterna, dess position på kromosomen och avstånd till oric. Positionerna anges som ett intervall mellan basparet (bp) i början och slutet av locus. Avståndet till oric anges i bp. Locus Typ Position [bp] Avstånd till oric [bp] caib Pseudogen yjjm Pseudogen complement( ) hsds Pseudogen complement( ) yjiv Pseudogen yeel Pseudogen complement( ) lacz Gen complement( ) lacy Gen complement( ) laca Gen complement( ) Tabell 2: Avstånden till oric från de fyra rrna-generna som är närmast de fyra pseudogenerna caib, yjjm, hsds och yjiv. rrna gener Position [bp] Avstånd till oric [bp] rrsh rrlh rrfe rrle Tabell 3: Avstånden till oric från de sex trna-generna som är närmast de fyra pseudogenerna caib, yjjm, hsds och yjiv. trna gener Position [bp] Avstånd till oric [bp] ilev alav leuq leup complement( ) leuv complement( ) leux

32 8 Acetatbildning Acetat bildas av cellen vid hög stress Då E. coli producerar rekombinanta proteiner i stora kvantiteter uppstår det en stressreaktion där den bland annat producerar acetat som biprodukt. Denna process är speciellt påtaglig när glukos nyttjas som primär kolkälla. Acetat bildas från pyrovat via pyruvatoxidas eller acetyl-coenzym-a (acetyl-coa) [37][38]. Denna process sker då glykolysen håller ett högre tempo än citronsyracykeln [37]. Acetatproduktion kan också vara en respons på att det finns för lite upplöst syre lokalt i cellen, vilket aktiverar reaktionsvägen för jäsning, som i sin tur leder till en hög acetatproduktion [39]. Acetatbildning är ett stort problem eftersom det påverkar cellen, och därmed expressionen, på flera fronter. Acetat kan lätt förflytta sig över cellmembranen när den är i sin icke-dissocierade form, d.v.s. när den är neutralt laddad. Detta gör att det acetat som cellen producerar dels kan ta sig ut i tillväxtmediet, men också att det sedan kan ta sig tillbaka in i cellen. När den kommer tillbaka in i cellen kan den deprotonera och bli till anjon och proton på grund av att ph:t är högre inne i cellen. Dessa kan inte passera tillbaka över cellmembranet p.g.a. sina laddningar och konsekvensen är att cellen okontrollerat fylls med protoner. Detta gör att protonpotentialen ( proton-motive force ) störs [39] vilken är viktig för bakteriens energiproduktion. Det acetat som blir kvar i tillväxtmediet kommer att ackumulera, vilket medför en ph-sänkning. Om ph-sänkningen blir tillräckligt stor leder det till denaturering av proteiner och DNA, vilket i sin tur resulterar i att cellerna lyseras [39]. Det har också visats att acetat påverkar den reaktionsväg som producerar metionin och kan på så vis hämma celltillväxt. Acetatet inhiberar steget då homocystein ska bli metionin. Metionin är av stor vikt för cellen då det är en aminosyra och därmed en viktig komponent i det centrala dogmat. Den är, utöver detta, även en 27

33 komponent av S-adenosylmetionin [40] som är livsviktigt då den har hand om många av cellens metyleringsprocesser och är en del av biosyntesen för polyaminer [41]. Då metioninbildningen inhiberas bildas ansamlingar av homocystein, vilket även det är inhiberande för celltillväxten [40]. Man vet dock inte orsaken till detta. Hur hanterar vi acetat i systemet? Vi har reducerat mängden acetat i vårt system genom att välja BL21(DE3) som stam för vårt system. Denna stam är känd för låga acetatkoncentrationer vilket beror på att den vid höga glukoshalter aktiverar den reaktionsväg för glyoxylat som gör att acetatet används som energikälla istället [42][38]. Vi har också valt att följa det exempel som Wang m. fl. [16] presenterar, där celltillväxt vid ph 7,5 jämfördes med vid ph 6,5. Resultatet visade en celltillväxtökning på ca 71 % och en minskning av intracellulärt acetat med ungefär 50 %. Detta tror de är en konsekvens av att det acetat som bildas i cellerna diffunderar till den sida av membranet som har högst ph, vilket i studien var tillväxtmediet. I denna miljö kommer acetatet sedan dissocieras och kan därmed inte fritt diffundera tillbaka in i cellen, vilket leder till en minskad mängd intracellulärt acetat [16]. Den tredje åtgärden vi har tagit är en kontrollerad matningshastighet eftersom vi har valt fed-batch-fermentation (se kapitel 8). En långsammare matningshastighet kan hindra att cellerna tar upp för mycket glukos och på så vis hämmas stressreaktionen där acetat bildas. Glykolysen regleras alltså via ett strypt intag av glukos. Ett problem som kan uppstå med detta tillvägagångssätt är att cellen inte får tillgång till tillräckligt mycket glukos för att den önskade proteinmängden skall kunna produceras. Mycket specifika multidimensionella beräkningar krävs för att optimera systemet via denna metod [43]. 28

34 Modifiering av tillväxtmedium för reducering av acetat och dess bieffekter Det finns andra modifieringar av tillväxtmediet, utöver en ph-ökning och en kontrollerad matningshastighet, som kan leda till en minskning av effekterna från acetatbildning. Roe m. fl. [40] provade att tillsätta metionin i tillväxtmediet, vilket ledde till en ökning av celltillväxten med upp till 80 % vid jämförelse med en kontroll. Utifrån detta påstår de att den ph-sänkning som acetat orsakar i cytoplasman inte har en lika stor påverkan på celltillväxten jämfört med den minskade produktionen av metionin. Celltillväxten påverkas alltså mer av att metionin inte produceras än av det minskade ph:t i cytoplasman [40]. Metionin kostar 108,87 $ per 100 g [44]. Roe m. fl. [40] använde 2 mm metionin i tillväxtmediet. Detta skulle innebära ca 0,3 g metionin per liter tillväxtmedium, vilket skulle innebära en total merkostnad runt 0,32 $/l för tillväxtmediet. Att nyttja andra primära kolkällor än glukos har visats vara en effektiv metod för att reducera acetatbildning. Aristidou m. fl. [45] ersatte glukos med fruktos i LB-medium, vilket resulterade i en 40 % ökning av biomassa samt % minskning av acetat. De argumenterar att detta resultat beror på att cellen har en mer kontrollerad upptagningsförmåga av fruktos jämfört med glukos. Fruktos är mindre attraktiv vid storskalig produktion då det är dyrare än glukos [46][47]. Modifiera cellen för minskad acetatproduktion Andra förfaranden kan handla om att genetiskt modifiera E. coli-cellerna för en minskad acetatbildning, genom att inaktivera de steg som är involverade i denna process. Exempelvis kan detta göras genom att inaktivera de enzymer som finns med i syntesvägen för acetat. acka, poxb och pta är tre gener som kodar för olika i enzymer delaktiga i denna reaktionsväg. Inaktivering av dessa gener förhindrar cellen från att producera acetat (se Figur 11). Detta tillvägagångssätt kan reducera koncentrationen av acetat markant, men bidrar istället till en ökning av andra oönskade biprodukter såsom pyruvat, laktat och format [48]. 29

35 Man kan också attackera det system som tar upp glukos från mediet. Här gäller samma logik som vid en långsammare matningshastighet. Om cellen inte kan ta upp en för stor mängd glukos uppnås inte samma stressnivå, vilket leder till en minskad halt acetat. Detta kan uppnås genom att inaktivera en av generna som är relaterade till fosfotransferas-systemet. Exempel på sådana gener är ptsg (se Figur 11), ptsh och ptsi [48]. Ett begränsat glukosupptag kan dock leda till att cellen inte får tillräckligt mycket näring för att producera det rekombinanta proteinet i önskad kvantitet [37]. Kang m. fl. [49] testade att mutera gener relaterade till reaktionsvägen för acetat och glukosupptag i E. coli. De inaktiverade poxb, pta, ptsg och iclr, vilket ledde till en 270 % ökad ackumulation av biomassa samt 90 % minskat utsläpp av acetat [49]. iclr är en gen som påverkar citronsyracykeln. När den inaktiveras kan glyoxylatsyntesvägen aktiveras, vilket minskar acetatkoncentrationen [48]. En inaktivering av iclr är troligtvis mer attraktivt att göra när man inte har en BL21-stam, eftersom BL21-stammen redan aktiverar glyoxylat-reaktionsvägen när glukoshalten är hög [42][38]. Kim m. fl. [50] undersökte effekterna av att inaktivera generna acka och pta i en stam. I en annan stam testade de att inaktivera acka, pta och ldh. ldh är en gen som kodar för laktas dehydrogenas och är med i syntesvägen för laktat (se Figur 11). Båda de muterade stammarna påvisade en lägre acetatkoncentration, men i stammen som saknade mutation i ldh-genen genererades dubbelt så hög produktion av laktat. Stammen med acka, pta och ldh utslagna visade sig få en 67 % högre celldensitet vid jämförelse med kontrollstammen [50]. 30

36 Figur 11: Här visas de steg som i samband med glykolysen och citronsyracykeln bildar acetat. Acetatproduktionen kan förminskas genom att inhibera olika gener hos E. coli som antingen har med glukosupptagningen eller syntesvägen för acetat att göra. Några av dessa är ptsg, ldh, poxb, pta och acka (markerade i rött). 31

37 9 Tillväxtmedium och fermentor För tillväxtmedium och dess effekter på expression, bör hänsyn tas till mediets kemiska sammansättning och vad som önskas uppnås via odling. Affibody AB:s nuvarande medium är ett IPTG-inducerat LB-system. Enligt Briand m. fl. [51] finns det dock ett flertal begränsningar med att använda IPTG: 1. Det måste tillsättas vid optimal celldensitet och därför krävs kontroll av cellkulturer. 2. Det medför toxiska begränsningar (särskilt för humanterapeutisk proteinproduktion). 3. Det är inte kostnadseffektivt. Detta resulterar i onödiga merkostnader för företaget i form av inköp och går emot det mer miljövänliga expressionssystem vi ämnar ta fram. Vi lämnar istället förslag på alternativa kolhydratskällor, autoinduktion som alternativ till induktion via IPTG samt förslag på övriga faktorer som kan påverka tillväxt och proteinutbyte positivt. Kolhydratskällor Då ett av Affibody AB:s mål är att gå över till mer storskalig produktion, har vi valt att fokusera på ett autoinducerbart system bestående av glycerol, glukos och laktos. Denna metod går ut på att cellen först utnyttjar glukos som kolkälla. När mängden glukos inte längre är tillräcklig övergår cellen istället till att utnyttja laktos som kolkälla. Laktosen fungerar även som inducerare i detta steg, då det inte finns någon betydande mängd inhiberande glukos kvar som hindrar laktosen från att inhibera lac-repressorerna [15]. Glycerolet är för att hjälpa till med tillväxt, men inhiberar inte expression. Mediet konstrueras genom att dessa kolhydratskällor adderas till en buffert innehållande trypton och jästlösning. 32

38 Man undviker de problem som finns då enbart glukos används som kolhydratskälla genom att nyttja laktos, samt så undviker man det dyra och toxiska IPTG som inducerare. Systemet är automatiserat efter den initiala nedbrytningen av glukos och passar därmed bättre för en storskalig produktion. I en studie blev den slutgiltiga produktnivån med detta system fyra gånger större jämfört med komplext LB-medium och IPTG [15]. ph och tillväxt Utöver kolhydratskällor, spelar även ph:t i tillväxtmediet en stor roll, då ett för lågt ph till följd av sura restprodukter markant kan sänka expressionen hos E. coli. Ett ph med en nivå mellan 7,5 8,5 har visats vara optimalt för tillväxt, då ph runt 6,5 eller lägre påträffats en minskad tillväxt på 42 %, samt en 33 % ökning av intracellulärt acetat [16]. Det expressionssystem vi presenterar för Affibody AB bör därmed ta dessa fakta i beaktning och en buffert med ph runt 8,0 ± 0,5 bör nyttjas för att minimera effekterna av acetatbildning. Fermentor Vid val av fermentorstrategi hade vi tre huvudsakliga alternativ att välja på: kontinuerlig-, batch- och fed-batch-fermentation. Utifrån de för- och nackdelar som diskuteras nedan har vi valt systemet fed-batch-fermentation. Vi har valt ett autoinducerade media som presenteras i en studie med batch-fermentation [15]. Samma autoinducerande media används även i annan en studie av Fruchtl m. fl. [52] med fed-batch-fermentation. De använde sig då av en exponentiell matningsstrategi där glycerol var den kolkälla som tillfördes. Det är denna matningsstrategi som vi skulle efterlikna i systemet. 33

39 I studien av Fruchtl m. fl. [52] jämfördes glukos mot glycerol som matningsmedium. Dessutom jämfördes IPTG, laktos och autoinduktion med laktos för induktion. Alla exempel utfördes under fedbatch-fermentation där modifierat M9-saltmedium användes i själva fermentorn. Resultatet i denna studie visade att de fick ut mest protein när de använde glukos-matning och IPTG för induktion. Detta berodde på att cellerna växte till en högre densitet i detta fall jämfört med de andra. Det tillvägagångssätt som fick högst avkastning per cell var autoinduktion med glycerol-matning. Alltså växte cellerna bättre i glukos, men de producerade mer rekombinant protein per cell vid autoinduktion med glycerol. Batch Detta är en väldigt enkel strategi för att odla cellerna. Det finns inget in- och utflöde av medium, utan det tillväxtmedium som processen startas med är kvar genom hela förloppet. Det tillsätts celler till den volym som är i reaktorn och där får de växa på det tillväxtmedium som finns. Detta gör batch-fermentation attraktivt genom att det är en enkel metod som inte behöver regleras speciellt mycket. Det är en relativt liten risk för mutationer hos cellerna eftersom de inte får växa över en längre period. Det är också en mindre risk för kontaminering eftersom bioreaktorn töms kontinuerligt och då även rengörs ordentligt. Om en sats har blivit kontaminerad innebär det inte jättestora konsekvenser för produktionen eftersom processen ändå kommer att startas om. Tyvärr blir det en del ineffektiv tid när bioreaktorn ska tömmas och rengöras. Denna tid blir förlorad produktionstid, vilket gör systemet mindre effektivt. I och med detta blir det även högre driftkostnader [14]. 34

40 Fed-batch Fed-batch börjar precis som en batch-fermentation, med varken ineller utflöde av medium, där cellerna får växa till en viss optisk densitet (OD) och där de har förbrukat en viss mängd av kolkällan i mediet. Därefter startar man ett långsamt inflöde av tillväxtmedium. I detta steg brukar man också börja inducera produktionen av det önskade proteinet. Den metaboliska stressen hos cellen minskas genom att mata cellerna på detta vis och acetatproduktionen sjunker därmed (se kapitel 8). Denna metod innebär även lägre produktionskostnader än batch-fermentation eftersom man inte behöver avbryta produktionen lika ofta. Risken för mutationer är ganska låg eftersom cellerna endast växer över en begränsad tid. Det som är negativt med denna process är att bioreaktorn måste tömmas efter en viss tid och processen behöver startas om. Detta leder till en del ineffektiv tid som gör produktionen mindre gynnsam [14]. Kontinuerlig I ett kontinuerligt system finns det hela tiden ett inflöde av medium samtidigt som det finns ett utflöde med samma hastighet som inflödet. Målet i detta system är att det ska bli konstant, alltså att parametrar såsom matningshastighet, substratkoncentrationer, volym av medium etc. är oberoende av tiden och därmed konstanta. Detta gör att man kan förvänta sig att det som kommer ut från systemet också är konstant som t.ex. koncentrationen av biomassa. Fördelarna med att använda kontinuerlig fermentation är att produktiviteten är högre och att driftkostnaderna är lägre än för både batch- och fed-batch-fermentation. Detta eftersom cellerna får växa och producera protein över en längre period vilket gör att själva driften blir lättare och på så vis billigare, samt att den tid som produktionen inte är igång minskas genom att man inte behöver tömma och göra rent bioreaktorn lika ofta som vid de andra två metoderna [14]. 35

41 Anledningen till att vi valde bort kontinuerlig fermentation är på grund av risken för mutationer och kontaminering. Vid kontaminering kan hela det konstanta systemet störas och produktionen minskas. Det är också en hög risk för mutationer eftersom cellerna får växa över en lång period. Detta innebär då också en hög risk för mutationer som påverkar cellens produktion av det rekombinanta proteinet [14]. Om en mutation skulle ske i kromosomen som gör att uttrycket för det önskade rekombinanta proteinet skulle hämmas kan man tänka sig att dessa celler skulle få ett övertag eftersom de inte skulle behöva producera höga kvantiteter av ett för cellen onödigt protein. Dessa celler kan då gynnas på grund av lägre metabolisk stress och på så vis kunna konkurrera ut de proteinproducerande cellerna i bioreaktorn. Ett system med kontinuerlig fermentation skulle vara önskvärt på grund av den höga produktiviteten. Dock skulle man vilja ha någon form av selektionssystem för den genen som kodar för det rekombinanta proteinet, eftersom att den i nuläget lätt kan muteras bort. Vi har inte stött på något selektionssystem som direkt selekterar efter en gen på kromosomen. Om man hittar ett system där detta skulle uppfyllas borde ett kontinuerligt system vara mer gynnsamt. Striedner m. fl. [6] gjorde en studie där de integrerade genen för ett rekombinant fluorescerande protein i kromosomen på en BL21(DE3)- stam, där de även testade hur länge systemet fungerade vid kontinuerlig fermentation i kemostat. Genkassetten innehöll en T7- promotor och kunde induceras med IPTG. Vid ett inducerat tillstånd kunde cellerna hålla ett högt genuttryck i cirka tio generationer. Vid ett icke inducerat tillstånd behöll cellerna sin förmåga för att uttrycka det rekombinanta proteinet i höga kvantiteter i cirka 40 generationer. 36

42 10 Modellering och simulering I och med att arbetet endast är teoretiskt tyckte vi som grupp att det skulle vara roligt att ha någonting mer som stärker våra resonemang än bara litteratur. Därför valde vi att sätta upp två matematiska modeller. Den ena beskriver hur det totala kopietalet av en eller flera kopior av vår genkassett förändras med tiden. Den andra ger oss ett approximativt värde på utbytet av Affibody -molekyler i vårt expressionssystem. Med kopietalsmodellen kommer vi även kunna se hur avståndet mellan genens position och oric påverkar antalet kopior över tiden. Modellerna implementerades i MATLAB (MATLAB R2017a). Eftersom verkligheten är mycket komplex är det svårt att beskriva den exakt, därför behövde vi göra vissa avgränsningar i våra modeller. Det innebär att vi inte kommer att ta hänsyn till vissa cellulära processer och att vissa processer antas vara konstanta för att förenkla vårt arbete. Efter att ha kört kopietalsmodellen där tiden t = [s] erhölls följande figur (se Figur 12). Det maximala kopietalet vi får för vår genkassett är 32 då vi satte in generna på våra valda positioner vilka kan hittas i Tabell 1. Övriga parametrar för körningen hittas i Tabell 5. Att kopitetalet blev så högt var något som vi inte hade förväntat oss och det visar hur viktigt valet av integrationsplatser är. 37

43 Figur 12: Hur kopietalet varierar med tiden. Det initiala kopietalet var lika med antalet gener: NrGenes = 4 och tiden t = användes för körningen. Figuren skapades med MATLAB-funktionen stairs. När ett approximativt värde på koncentrationen av Affibody -molekyler togs fram erhölls flera figurer eftersom systemet som vi modellerade innehåller många parametrar. Den figur vi ansåg vara mest intressant är Figur 13 då den dels visar hur koncentrationen av Affibody -molekyler förändras med tiden och hur laktos koncentrationen förändras med tiden. Övriga bilder (18, 19 och 20) hittas i bilaga D. Parametrarna som användes hittas i Tabell 6 och initialvärdena hittas i Tabell 7. Simuleringstiden sattes till 300 minuter. 38

44 Figur 13: Koncentrationsfärdringar med tiden för laktos och Affibody -molekyler. Initialvärdena för laktos och Affibody -molekyler sattes till 0 mm respektive 2, 328 mm. Vi kan se i resultatet att vi börjar med en ganska hög initialkoncentration av Affibody -molekyler. Det beror på som vi nämnt innan att T7-systemet läcker vilket gör att man får ett högt basalt uttryck. Vi resonerade att en operatorsekvens i 5 -UTR-området skulle förstöra mrna:ts sekundärstruktur men det här resultatet visar på vikten av att inkludera någon typ av operator. Det finns alternativa operatorer som fungerar uppströms om promotorn genom att påvera DNA-strukturen nedströms så att polymeraset inte kan avläsa DNA-strängen [53] eller genom att påverka initieringen av elongeringen [54] och hålla kvar polymeraset. Dessa alternativ hade inte påverkat veckningen av mrna:t och skulle teoretiskt sätt fungera men eftersom vi inte har hunnit utvärdera det så valde vi att inte inkludera det i vårt system. Kopietalsmodell För att kunna modellera kopietalet för gener måste vi förstå vissa delar av de olika perioderna i cellcykeln hos E. coli. Dessa perioder 39

45 är replikationsinitieringen, DNA-replikeringen, segregering av kromosomer och till sist själva celldelningen. Hur långa dessa perioder är beror på i vilken tillväxtfas E. coli cellerna befinner sig i och hur tillgången till näring ser ut. Med de värdena vi använde i resultatet antar vi att cellerna befinner sig i den maximala tillväxtfasen eftersom miljön som cellerna odlas i är lämpad för maximal tillväxt. De intressanta tiderna vi hade med där var generationstiden och tiden det tar för en cellcykel att bli färdig. Det har nämligen visat sig att tiden det tar för en cellcykel (med cellcykel menar man DNA-replikeringen och segregeringen av kromosomer) är 60 minuter vid 37 C nästan oavsett vilken fas av tillväxt E. coli befinner sig i [55]. Generationstiden kan däremot variera mellan cirka 20 till 180 minuter [55][56]. Att generationstiden kan vara kortare än tiden för en cellcykel kan verka vara konstigt, men E. coli har en lösning på det här problemet. Lösningen är överlappande replikation (se Figur 14). Överlappande replikation innebär att en ny cellcykel kan inledas innan den första är klar [57]. 40

46 Figur 14: Överlappande replikation gör att E. coli kan ha en kortare generationstid än vad cellcykeln tillåter. Detta innebär att, vid celldelning, replikation av kromosomen redan är igång sedan den tidigare generationen. I bilden ser vi hur en ny gul kromosom håller på att bildas från den svarta. Från den gula och den svarta kromosomen inleds sedan nya cykler där nya kromosomer i grönt och blått håller på att bildas. Den första perioden är replikationsiniteringen där replisomet ska kunna binda till oric. Initieringen styrs av proteinet DnaA som binder till så kallade DnaA boxar på DNA-strängen. Nära boxarna sitter AT-rika segment som har en svagare basparning vilket gör det lättare för replisomet att binda till DNA-strängen [58]. I vår modell bortser vi ifrån den tid det tar för DNA:t att bli tillgängligt för replisomen att binda in. Modellen kommer alltså att starta ifrån då replisomet är bundet till oric. Dessutom antar vi att oric endast består av en bas för att göra det enklare att hantera avstånd på kromosomen. Efter initieringen är färdig inleds själva DNA-replikationen. Det sker genom att den dubbelsträngade DNA-strukturen öppnas och replikationen inleds. Replikationsprocessen genomförs i två riktningar vilket innebär att det är två stycken replisom som arbetar samtidigt. Replisomen kommer sedan att mötas på andra sidan av den cirkulära kromosomen i en termineringspunkt som kallas terminus [57]. Det vi antar i vår modell är att de två replisomen utför 41

47 replikationen lika fort och att replisomhastigheten är konstant under hela replikationen. Ett annat antagande vi gör, som är kopplat till antagandet om längden av oric, är att replisomen börjar från samma bas. När replikationen är färdig behöver dotter-kromosomerna separeras. För vår modell är den här fasen endast viktigt på grund av den ungefärliga tid det tar för cellen att separera kromosomen inför celldelningen. Vi antar att tiden det tar för kromosomseparationen är konstant. Slutligen har vi själva delningen som i sin tur markerar en viktig punkt i vår modell då kopietalet antas halveras. Ett annat antagande vi gör är att celldelningen inte tar någon tid. Uppbyggnad av modellen Modellen är uppbyggd så att användaren kör MATLAB-skriptet FinalCopyNr.m (se Bilaga E) och får börja med att ange följande parametrar (dessa kommer inte förändras under simulationen): Generationstiden (i sekunder). Tiden det tar för en cellcykel att ske (i sekunder). Replisomets hastighet (i baspar per sekund). Antalet gener användaren tänkt placera på kromosomen. Avståndet mellan oric och de insatta generna (i antal baspar). Hur lång tid simulationen ska köras (i sekunder). Modellen beräknar varje enskild gens kopietal var för sig och summerar slutligen ihop antalet kopior innan resultatet visas i ett trappstegsdiagram. Rent beräkningsmässigt är modellen inte speciellt komplicerad eftersom vi antar att kopieringen och celldelningen sker binärt. Det leder till att den huvudsakliga beräkningen som genomförs är f(m) = 2 m, m N (1) som beskriver kopietalet där m kan anta de naturliga talen. Ef- 42

48 tersom vi beräknar varje gen för sig kommer m alltid starta med värdet 0. Med tiden kommer dock m att variera och förändringar av värdet på m sker vid tre viktiga tidpunkter i modellen (distf romori- T ime är tiden det tar för replisomet att replikera fram till en insatt gen, gt ime är generationstiden, cct ime är tiden det tar för en cellcykel och n är antalet avkommor från den ursprungliga kromosomen): 1. Då simulationen inleds (när tiden t = 0). 2. Då replisomet replikerar en gen när: t = distf romorit ime + n gt ime, n N (2) 3. Då en cellcykel är färdig och delning sker: t = cct ime + n gt ime, n N (3) När simulationen startas kommer m att sättas till 0 och kopietalet för en gen kommer att evalueras med ekvation (1) till 1. I och med replikeringen av en gen kommer en helt ny kopia av den genen skapas vilket då kräver att värdet på m ökar med 1. Värdet på m kommer att öka med 1 då ekvation (2) uppfylls. När en cellcykel är färdig kommer istället värdet på m minska med 1 (då ekvation (3) uppfylls) vilket innebär att kopietalet av en gen halveras enligt ekvation (1). Nu vet vi när ekvation (2) och (3) används, men vad är deras ursprung? Deras ursprung är den överlappande replikationen som Fossum m. fl. [57] beskrev. Varje replikering av en gen sker som vanligt en gång per generation och cellcykler kommer att börja överlappa varandra då en generationstid har passerat. Det här innebär att det är en förskjutning med en generationstid mellan modercell och dottercell (se Figur 15 nedan). 43

49 Figur 15: Överlappningen mellan cellcyklerna. Varje nytt block representerar början på en ny kromosom vilket leder till en fördubbling av generna när kopieringen av en gen sker. När en cellcykel är färdig och cellen delas halveras kopietalet vilket är slutet på ett block. Steglängden i simuleringen sattes till en sekund vilket innebär att alla händelser och tider är begränsade till diskreta punkter med en sekunds mellanrum. Eftersom händelserna i vår simulering utspelar sig med ett mellanrum som är större än en sekund finns det ingen anledning till att minska steglängden. Ifall vi hade valt en kortare steglängd hade vi fått en mer högupplöst lösning men det hade inneburit att modellen hade tagit betydligt längre tid att köra. Redan nu är modellen inte speciellt effektiv (se Tabell 4, mätningar gjorda av MATLAB). En extern timer mätte själva körtiden till ungefär 40 sekunder. Den här körningen simulerade sekunder vilket är strax över ett dygn (24 timmar = sekunder), vilket är ungefär så länge det känns relevant att simulera med tanke på att odlingen inte lär ske under en längre period än så. 44

50 Tabell 4: Tid att köra olika funktioner i MATLAB. Körningstiden var satt till sekunder. Resultaten är något missvisande eftersom MATLAB räknade även med den tid det tog att skriva in skriptets parametrar (cirka 20 sekunder). I tabellen visas egentid som beskriver tiden det tar för funktionen att köra utan några underfunktioner. Funktionsnamn Kallelser Totaltid Egentid FinalCopyNr 1 60,181 s 59,927 s close 1 0,133 s 0,001 s stairs 1 0,111 s 0,042 s close>request_close 1 0,099 s 0,007 s closereq 1 0,088 s 0,087 s close>safegetchildren 1 0,033 s 0,010 s Stair.Stair>Stair.Stair 1 0,021 s 0,005 s newplot 1 0,018 s 0,007 s setdiff 2 0,017 s 0,001 s setdiff>setdiffr2012a 2 0,015 s 0,008 s Parametrar Vår kopietalsmodell är skriven så att den fungerar med en mängd olika parametrar och konstanter. Vi ville dock se hur kopietalet varierade i vårt system och för det behövde vi sätta värden på parametrarna. Dessa går att finna i tabellen nedan (se Tabell 5). Värdena är både tagna ur litteraturen och valda av gruppen. Många av värdena är inte samma under olika reaktionsbetingelser. Eftersom vi har använt värden från flera olika källor finns det ingen garanti att alla genomförda experiment hade exakt samma betingelser och därmed medförs en viss osäkerhet med modellen. 45

51 Tabell 5: Parametrar och konstanter för vår kopietalsmodell. Ett minustecken innebär att det inte finns någon enhet. Att några av genavstånden inte är negativa som i Tabell 1 beror på replikationen är bidirektionell och att vi bortser från vilken DNA-sträng genen ligger på. Parametrar/konstanter Värde Enhet Källa gtime 1200 s Cooper & Helmstetter [56] cct ime 3600 s Fossum m. fl. [57] ReplisomeSpeed 1000 bp/s Moran [59] N rgenes 4 - Vald utifrån vårt system GeneDistance_caiB bp Jeong m. fl. [21] GeneDistance_yjjM bp Jeong m. fl. [21] GeneDistance_hsdS bp Jeong m. fl. [21] GeneDistance_yjiV bp Jeong m. fl. [21] SimulationT ime s Vald Proteinutbytesmodell För att modellera expressionen av Affibody -molekylen i vårt expressionssystem ställde vi upp ett differentialekvationssystem som beskriver reaktionsvägen från upptaget av laktos till färdigt protein. Eftersom vårt system bygger på T7-systemet ligger vår genkassett under indirekt kontroll av lac-operatorn som kontrollerar uttrycket av T7-RNA-polymeraset (se Figur 16). Repressorn som uttrycks konstitutivt binder till lac-operatorn och blockerar transkriptionen av T7-RNA-polymeraset tills två allolaktos-molekyler binder till den. När detta sker släpper repressorn och produktionen av T7-RNA-polymeras påbörjas [60]. T7-RNA-polymeraset binder i sin tur till T7-promotorn i vår genkassett och påbörjar transkriptionen [61]. För att modellera uttrycket av Affibody -molekylen innebär detta att man först behöver modellera hur allolaktoskoncentrationen förändras med avseende på tid och laktoskoncentrationen. 46

52 Figur 16: En överblick över det cellulära systemet vi modellerat. 1 beskriver upptaget av laktos vilket motsvarar ekvation (4). 2 beskriver nedbrytandet av laktos. 3 är steget då laktos binder in till β-galaktosidas. Vi har även nedbrytningen av β-galaktosidas som syns vid 4. 5 beskriver återigen nedbrytningen av laktos. Det finns två pilar med siffran 6, vilket är bildningen av allolaktos från β-galaktosidas. Allolaktoset förs vidare med 7 för att binda till lac-repressorn. 8 beskriver då lacrepressorn släpper från operonet. 9 innefattar både transkriptionen och translationen som ger oss β-galaktosidas. 10 beskriver nedbrytningen av allolaktos. 11 illustrerar bildandet av T7-RNA-polymeras, både genom transkription och translation. T7- RNA-polymeras bryts även ned vilket syns vid 12. Polymeraset kommer även binda till T7-promotorn vilket syns vid beskriver transkriptionen och translationen som ger upphov till Affibody -molekyler. Slutligen beskriver 15 nedbrytningen av Affibody -molekyler. Modellen som vi satt upp grundar sig på en tidigare matematisk modell som beskriver återkopplingen i lac-operonet av Yildirim & Mackey [60]. Beräkningarna är utförda i MATLAB och sker numeriskt med ode45 som kan ses i koden (se Bilaga F). Härledningarna av vissa ekvationer kan ses i Bilaga C. För att förenkla beräkningarna valde vi, istället för att ta hänsyn till upptaget av laktos via laktospermeaset, att upptaget av laktos kan approximeras till en logistisk funktion: f(t) = Z 1 + e k(t t 0) (4) Z är den maximala koncentrationen, k anger lutningen på kurvan och t 0 förskjutningen i t-led (tidpunkten då halva koncentrationen av laktos tagits upp). 47

53 Detta är ett rimligt antagande eftersom laktospermeaset också ligger under kontroll av lac-operonet vilket gör att det blir en positiv återkoppling när laktos finns tillgängligt [20] och därmed borde intaget av laktos öka exponentiellt tills den bromsas in när mättnad uppnås (se Figur 17). Figur 17: Sigmoidfunktionen som är undantagsfallet av den logistiska funktionen då t 0 = 0 och Z = 1. I denna figur är k satt till 1. Vidare har vi inte tagit någon hänsyn till diffusion av reaktanterna och produkterna, och antog att koncentrationsförändringarna och bindningstiderna är omedelbara. Vi antar också att de stora talens lag gäller vilket gör att vi kan använda oss utav kvoterna i modellen och gör att vårt resultat blir ett medelvärde i en population. I verkligheten är aktiviteten i en gen binär d.v.s. antingen på eller av och aldrig t.ex. 1/7 på. Enzymernas bindning till liganderna involverade i vår modell beskrivs med Michaelis-Menten-kinetik och den mer generella Hill ekvationen. 48

54 Uppbyggnad av modellen Konversionen av laktos till allolaktos sker med hjälp av enzymet β-galaktosidas som i sin tur är beroende av koncentrationen av β- gal mrna. Uttrycket av β-gal mrna styrs av lac-operonet och är beroende av allolaktos vilket gör att systemet regleras med positiv återkoppling vilket kan ses i den förenklade figuren 16. Även vid maximal repression läcker systemet vilket innebär en basal uttrycksnivå av β-galaktosidas som gör att systemet kan reagera på en förhöjning av laktos [60]. Förändringen av β-gal mrna med avseende på tid ställdes upp på följande sätt: dm βgal dt = α Mβgal 1 + K R A n K + K R A n γ M βgal M βgal (5) Kvoten i högerledet representerar kvoten av fria operatorer där α Mβgal är den maximala transkriptionshastigheten när inga repressorer är bundna till operatorn. K R är jämnviktskonstanten för repressorallolaktos bindningsreaktionen. 1/K är förhållandet mellan det maximala och basala uttrycket av mrna (när A = 0 uppnås den maximala repressionen och den basala uttryckshastigheten av mrna:t är α Mβgal /K). n är Hill koefficienten och tolkas som det antal allolaktosmolekyler som binder till repressorn innan den släpper från operatorn. A är allolaktoskoncentrationen, γ Mβgal nedbrytningshastigheten på mrna:t och M βgal mrna koncentrationen. Koncentrationen av enzymet β-galaktosidas beror av mrna- koncentrationen och nedbrytningshastigheten av enzymet vilket ger oss följande differentialekvation: dp βgal dt = α Pβgal M βgal γ Pβgal P βgal (6) α Pβgal är translationshastigheten av mrna:t. M βgal är mrnakoncentrationen, γ Pβgal nedbrytningshastigheten av enzymet och P βgal enzymkoncentrationen. 49

55 Laktoskoncentrationsförändringen kan modelleras genom att anta att konversionen från laktos till allolaktos katalyserat av β- galaktosidas sker enligt Michaelis-Menten-kinetik och att tillförseln av laktos beskrivs av en logistisk funktion: dl dt = f L (t) α L P βgal K L1 + L γ LL (7) Den första termen i högerledet är derivatan av logistikfunktionen ekvation (4) som beskriver hastigheten av laktostillförseln. Kvoten i andra termen i högerledet är Michaelis-Menten-ekvationen som beskriver reaktionshastigheten för omvandlingen av laktos till allolaktos och nedbrytningen av laktos till glukos och galaktos där α L är den maximala nedbrytnings- och omvandlingshastigheten. P βgal är β-galaktosidas koncentrationen. L är laktos koncentrationen, K L1 är den substratkoncentration som ger den halva maximala reaktionshastigheten och γ L är nedbrytningshastigheten av laktos i cellen. Med lösningarna på de ovanstående differentialekvationer kan man nu beskriva hur allolaktoskoncentrationen förändras med tiden. Denna hastighet beror av β-galaktosidaskoncentrationen, laktoskoncentrationen och allolaktoskoncentrationen: da dt = α L AP βgal K L2 + L β A AP βgal K A + A γ AA (8) Den första termen i högerledet tar hänsyn till omvandlingen av laktos till allolaktos med hjälp av β-galaktosidas. Kvoten i den första termen i högerledet är Michaelis-Menten ekvationen för reaktionen. α A är den maximala reaktionshastigheten. P βgal är β- galaktosidaskoncentrationen. L är laktoskoncentrationen och K L2 den substratkoncentration som ger den halva maximala reaktionshastigheten för denna reaktion. Den andra termen i högerledet är nedbrytningshastigheten av allolaktos till glukos och galaktos återigen katalyserat av β-galaktosidas där β A är den maximala nedbrytningshastigheten. A är allolaktoskoncentrationen och K A är den substratkoncentration som ger halva maximala reaktionshastigheten. Den tredje och sista termen i högerledet beskriver den spontana 50

56 nedbrytningshastigheten och degraderingen av allolaktos där γ A är hastigheten för detta. På samma sätt som i ekvation (5) kan vi nu ställa upp hur koncentrationen av T7-RNA-polymeras mrna förändras med tiden: dm T 7 dt = α MT K R A n K + K R A n γ M T 7 M T 7 (9) A är allolaktoskoncentrationen och M T 7 T7-RNA-polymeras mr- NA koncentrationen. Hastigheterna och konstanterna antar vi är samma som i ekvation (5). Anledningen till vårt antagande är att båda transkriptionshastigheter beror av samma typ av polymeras och att längden på generna är ungefär lika långa [21]. Därför har vi α MT 7 = α Mβgal. T7-RNA-polymerasets mrna antar vi är lika stabilt som för β-galaktosidasets mrna, vilket ger oss samma nedbrytningshastighet: γ MT 7 = γ Mβgal. Förändringen av koncentrationen av T7-RNA-polymeras kan ställas upp på samma sätt som i ekvation (6): α PT 7 dp T 7 dt = α PT 7 M T 7 γ PT 7 P T 7 (10) är translationshastigheten, M T 7 är mrna koncentrationen, γ PT 7 nedbrytningshastigheten och P T 7 protein koncentrationen. Konstanten α PT 7 uppskattas i detta fall ha samma värde som i ekvation (6), α PT 7 = α Pβgal, med samma typ av resonemang som tidigare då translationshastigheten bör vara likvärdiga för T7-RNApolymeraset och β-galaktosidas. Med T7-RNA-polymeraskoncentrationen kan vi äntligen modellera koncentrationsförändringen av mrna för Affibody -molekyler: α MAffi dm Affi dt = α MAffi C DNA P T 7 γ MAffi M Affi (11) är den maximala transkriptionshastigheten av genen, vilket kommer vara högre än de tidigare eftersom det nu är T7-RNApolymeraset som transkriberar. C DNA är koncentrationen av vår insatta gen och är framräknad från värden från kopietalsmodellen och 51

57 antas vara konstant. P T 7 är koncentrationen av T7-RNA-polymeras. γ MAffi är nedbrytningshastigheten av mrna:t som återigen antas ha samma värde som tidigare nedbrytningshastigheter, γ Mβgal = γ MT 7 = γ MAffi. M Affi är mrna koncentrationen. Slutligen har vi förändringen av Affibody -molekylen per tidsenhet, vilket var det vi från början ville modellera: α PAffi dp Affi dt = α PAffi M Affi γ PAffi P Affi (12) är translationshastigheten av mrna:t till färdigt protein. I denna modell sätts den till samma hastighet som för tidigare translationshastigheter α Pβgal = α PT 7 = α PAffi. M Affi är mrna koncentrationen, γ PAffi är nedbrytningshastigheten av Affibody molekylen och P Affi är protein koncentrationen. γ PAffi sätts till eftersom vi saknar data för nedbrytningshastigheten av Affi- γ Pβgal body -molekylen. Detta är antagligen i överkant eftersom Affibody -molekylen är en av de snabbast veckade protein man känner till, vilket säger något om dess termodynamiska stabilitet [62]. Parametrar Parametrarna och konstanterna som användes till vår modell är tagna och framräknade från data ur litteraturen och specificeras i Tabell 6 nedan. Eftersom dessa parametrar är varierande beroende på reaktionsbetingelser såsom temperatur, ph, stam med mera måste man tolka resultaten med försiktighet. Resultatet ger bara en fingervisning och för att få ett mer rättvisande resultat krävs det att man bestämmer dessa parametrar experimentellt för sitt egna system. 52

58 Tabell 6: Parametervärden som används i modellen. - indikerar att konstanten är enhetslös. Konstant Värde Enhet Källa α A 1,76e4 min 1 Yildirim & Mackey [60] α MAffi 3,36e6 mm 1 min 1 Újvári & Martin [63] α Pβgal = α PT 7 = α PAffi 1,66e-2 min 1 Yildirim & Mackey [60] α L 3,60e3 min 1 Semsey m. fl. [20] α Mβgal = α MT 7 9,97e-4 mm/min Yildirim & Mackey [60] β A 2,15e4 min 1 Yildirim & Mackey [60] γ A 5,20e-1 min 1 Yildirim & Mackey [60] γ Pβgal = γ PAffi 8,33e-4 min 1 Yildirim & Mackey [60] γ L 0 min 1 Uppskattad γ Mβgal = γ MT 7 = γ MAffi 4,11e-1 min 1 Yildirim & Mackey [60] γ PT 7 1,40e-2 min 1 Arnold m. fl. [64] K 7,20 - Yildirim & Mackey [60] K R 2,52e1 mm 2 Yildirim & Mackey [60] K A 1,95 mm Yildirim & Mackey [60] K L1 1,40e-3 mm Semsey m. fl. [20] K L2 9,70e-4 M Yildirim & Mackey [60] Z 3,70e-4 mm Yildirim & Mackey [60] k 1,00 - Vald t 0 10,0 min Vald C DNA 3,58e-5 mm Framräknad med data från Kubitschek & Friske [65] n 2 - Yildirim & Mackey [60] 53

59 Initialvärden Initialvärdena till differentialekvationssystemet i Tabell 7 valdes med hänsyn till parametrarna och representerar fortvarighetstillståndet då ingen förändring med avseende på tiden sker, d.v.s. när df dt = 0 gäller. Anledningen till varför vi sätter initialvärdena till detta är att vi antar att det råder en jämnvikt i systemet innan tillförseln av laktos sker. Härledningarna finns i Bilaga C. Tabell 7: Initialvärdena till differentialekvationssystemet. Ekvation Initialvärde Enhet (5) & (9) 3,3692e-04 mm (6) 0,0067 mm (7) 0 mm (8) 0 mm (10) 3,9949e-04 mm (11) 0,1168 mm (12) 2,3275 mm 54

60 11 Etisk analys Vi har valt att göra projektets etiska analys ur ett konsekvensetiskt perspektiv. Inom konsekvensetiken avgörs om en handling är rätt eller fel utifrån värdet hos de konsekvenser den får, då ofta relativt de alternativa konsekvenserna [66]. Vi anser att detta projekt ur ett konsekvensetiskt perspektiv har flera fördelar. Detta grundas i att vi, via de förslag som ges till Affibody AB, ämnar reducera mängden antibiotika som nyttjas, något som är viktigt i och med det snabbt växande folkhälsoproblemet med antibiotikaresistens världen över. Idag medför antibiotikaresistens stora kostnader för sjukvården i form av förlängda vårdtider och dyrare läkemedel. Dessutom äventyras livet på de människor som behöver transplantationer, cancerbehandlingar eller andra behandlingar som leder till försämrat immunförsvar. Värdet av att föreslå ett expressionssystem som är plasmidfritt och därigenom ska vara antibiotikafritt väger tung, menar vi, då det kan bidra till en större samhällsnytta. Utöver att göra systemet antibiotikafritt försöker vi även, via ett autoinducerbart system, eliminera användningen av IPTG. I teorin kan detta även göra systemet mindre kostsamt eftersom IPTG är dyrt. På så vis blir läkemedlet billigare och därmed mer lättillgängligt för allmänheten. De negativa aspekterna som vi har identifierat är att projektet omfattar genetisk rekombination av bakterien E. coli. En möjlig konsekvens av detta är att projektet kommer mötas med motstånd eftersom det är en process många finner skrämmande. Det finns även en riskfaktor med att genmodifiera en organism, då oväntade och skadliga mutationer potentiellt kan uppstå till följd av otillräcklig kunskap. Med dessa saker i åtanke ämnar vi till största möjliga grad ta beslut från en kunskapsbas som bedöms som tillräcklig för ändamålet. Detta för att minimera risken för skadliga eller etiskt förkastliga konsekvenser. 55

61 12 Slutsats Det system som föreslagits för Affibody AB bör troligen leda till ett högre utbyte vid rekombinant produktion av protein. Systemet är antibiotikafritt. Arbetet och all data är strikt teoretiskt, något som bör tas i beaktning. Vi anser att vi i grova drag uppfyllt de mål som sattes, men har även under projektets gång behövt förändra dessa utefter de begränsningar som uppenbarades då arbetet fortskred. Sammantaget är vi är nöjda med vår prestation och det förslag som presenterats för Affibody AB. 56

62 13 Referenser 1. Marisch, K., Bayer, K., Scharl, T., Mairhofer, J., Krempl, P. M., Hummel, K., Razzazi-Fazeli, E. & Striedner, G. A Comparative Analysis of Industrial Escherichia coli K 12 and B Strains in High-Glucose Batch Cultivations on Process-, Transcriptome- and Proteome Level. 8, e70516 (aug. 2013). 2. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S. & Kim, J. F. Understanding the Differences between Genome Sequences of Escherichia coli B Strains REL606 and BL21(DE3) and Comparison of the E. coli B and K-12 Genomes. Journal of Molecular Biology 394, (dec. 2009). 3. Shiloach, J., Kaufman, J., Guillard, A. S. & Fass, R. Effect of glucose supply strategy on acetate accumulation, growth, and recombinant protein production by Escherichia coli BL21 (DE3) and Escherichia coli JM , (febr. 1996). 4. Studier, F. W. & Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. 189, (maj 1986). 5. Jia, B. & Jeon, C. O. High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives. en. Open Biology 6, (aug. 2016). 6. Striedner, G., Pfaffenzeller, I., Markus, L., Nemecek, S., Grabherr, R. & Bayer, K. Plasmid-free T7-based Escherichia coli expression systems. eng. Biotechnology and Bioengineering 105, (mars 2010). 7. Emory, S. A., Bouvet, P. & Belasco, J. G. A 5 -terminal stemloop structure can stabilize mrna in Escherichia coli. en. Genes & Development 6, (jan. 1992). 8. Orosz, A., Boros, I. & Venetianer, P. Analysis of the complex transcription termination region of the Escherichia coli rrnb gene. eng. European Journal of Biochemistry 201, (nov. 1991). 57

63 9. Nakashima, N., Akita, H. & Hoshino, T. Establishment of a novel gene expression method, BICES (biomass-inducible chromosome-based expression system), and its application to the production of 2,3-butanediol and acetoin. eng. Metabolic Engineering 25, (sept. 2014). 10. Sousa, C., de Lorenzo, V. & Cebolla, A. Modulation of gene expression through chromosomal positioning in Escherichia coli. Microbiology 143, (1997). 11. Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J. W. & Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Research 42, (okt. 2014). 12. Gu, P., Yang, F., Su, T., Wang, Q., Liang, Q. & Qi, Q. A rapid and reliable strategy for chromosomal integration of gene(s) with multiple copies. en. Scientific Reports 5, 9684 (april 2015). 13. Su, B., Zhang, Z., Wu, M., Lin, J. & Yang, L. Construction of plasmid-free Escherichia coli for the production of arabitol-free xylitol from corncob hemicellulosic hydrolysate. eng. Scientific Reports 6, (maj 2016). 14. Villadsen, J., Nielsen, J. & Lidén, G. Bioreaction Engineering Principles en (Springer US, Boston, MA, 2011). 15. Li, Z., Kessler, W., Heuvel, J. v. d. & Rinas, U. Simple defined autoinduction medium for high-level recombinant protein production using T7-based Escherichia coli expression systems. 91, 1203 (aug. 2011). 16. Wang, H., Wang, F., Wang, W., Yao, X., Wei, D., Cheng, H. & Deng, Z. Improving the expression of recombinant proteins in E. coli BL21 (DE3) under acetate stress: an alkaline ph shift approach. eng. PloS One 9, e (2014). 17. Rosano, G. L. & Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology 5 (april 2014). 58

64 18. Sadeghi, H. M. M., Rabbani, M., Rismani, E., Moazen, F., Khodabakhsh, F., Dormiani, K. & Khazaei, Y. Optimization of the expression of reteplase in Escherichia coli. Research in Pharmaceutical Sciences 6, (2011). 19. Koma, D., Yamanaka, H., Moriyoshi, K., Sakai, K., Masuda, T., Sato, Y., Toida, K. & Ohmoto, T. Production of P- aminobenzoic acid by metabolically engineered escherichia coli. eng. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 78, (2014). 20. Semsey, S., Jauffred, L., Csiszovszki, Z., Erdossy, J., Stéger, V., Hansen, S. & Krishna, S. The effect of LacI autoregulation on the performance of the lactose utilization system in Escherichia coli. eng. Nucleic Acids Research 41, (juli 2013). 21. Jeong, H., Barbe, V., Lee, C. H., Vallenet, D., Yu, D. S., Choi, S.-H., Couloux, A., Lee, S.-W., Yoon, S. H., Cattolico, L., Hur, C.-G., Park, H.-S., Ségurens, B., Kim, S. C., Oh, T. K., Lenski, R. E., Studier, F. W., Daegelen, P. & Kim, J. F. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). eng. Journal of Molecular Biology 394, (dec. 2009). 22. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. eng. Applied Microbiology and Biotechnology 72, (sept. 2006). 23. Valdez-Cruz, N. A., Caspeta, L., Pérez, N. O., Ramírez, O. T. & Trujillo-Roldán, M. A. Production of recombinant proteins in E. coli by the heat inducible expression system based on the phage lambda pl and/or pr promoters. eng. Microbial Cell Factories 9, 18 (mars 2010). 24. Barrick, D., Villanueba, K, Childs, J, Kalil, R, Schneider, T. D., Lawrence, C. E., Gold, L & Stormo, G. D. Quantitative analysis of ribosome binding sites in E.coli. Nucleic Acids Research 22, (april 1994). 25. Ringquist, S., Shinedling, S., Barrick, D., Green, L., Binkley, J., Stormo, G. D. & Gold, L. Translation initiation in Esche- 59

65 richia coli: sequences within the ribosome-binding site. eng. Molecular Microbiology 6, (maj 1992). 26. Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. 60, (sept. 1996). 27. Singh, V. Recent advancements in synthetic biology: current status and challenges. eng. Gene 535, 1 11 (febr. 2014). 28. Delbrück, M. Interference Between Bacterial Viruses. 50, (aug. 1945). 29. William Studier, F., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W. [6] Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Gene Expression Technology 185, (jan. 1990). 30. Kuhnert, P., Nicolet, J. & Frey, J. Rapid and accurate identification of Escherichia coli K-12 strains. 61, (nov. 1995). 31. Bahreini, E., Aghaiypour, K., Abbasalipourkabir, R., Goodarzi, M. T., Saidijam, M. & Safavieh, S. S. AN OPTIMIZED PROTOCOL FOR OVERPRODUCTION OF RECOMBI- NANT PROTEIN EXPRESSION IN Escherichia coli. 44, (juli 2014). 32. Yin, J., Wang, H., Fu, X.-Z., Gao, X., Wu, Q. & Chen, G.-Q. Effects of chromosomal gene copy number and locations on polyhydroxyalkanoate synthesis by Escherichia coli and Halomonas sp. en. Applied Microbiology and Biotechnology 99, (juli 2015). 33. Cohrt, K. O. How to Manipulate Plasmid Copy Number < bitesizebio. com/ 22824/ how- to- manipulateplasmid-copy-number/> (2015). 34. Schulga, A. A., Mechev, P. V., Kirpichnikov, M. P., Skryabin, K. G. & Deyev, S. M. Construction of the plasmid-free strain for human growth hormone production. Biochimie , (sept. 2016). 60

66 35. Yin, J., Fu, X.-Z., Wu, Q., Chen, J.-C. & Chen, G.-Q. Development of an enhanced chromosomal expression system based on porin synthesis operon for halophile Halomonas sp. en. Applied Microbiology and Biotechnology 98, (nov. 2014). 36. Nelson, D. L. & Cox, M. M. Principles of Biochemistry. 6th Edition (Macmillan Higher Education, Basingstoke, MA, 2013). 37. March, J. C., Eiteman, M. A. & Altman, E. Expression of an Anaplerotic Enzyme, Pyruvate Carboxylase, Improves Recombinant Protein Production in Escherichia coli. en. Applied and Environmental Microbiology 68, (nov. 2002). 38. Phue, J.-N. & Shiloach, J. Transcription levels of key metabolic genes are the cause for different glucose utilization pathways in E. coli B (BL21) and E. coli K (JM109). eng. Journal of Biotechnology 109, (april 2004). 39. De Mey, M., De Maeseneire, S., Soetaert, W. & Vandamme, E. Minimizing acetate formation in E. coli fermentations. eng. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 34, (nov. 2007). 40. Roe, A. J., O Byrne, C., McLaggan, D. & Booth, I. R. Inhibition of Escherichia coli growth by acetic acid: a problem with methionine biosynthesis and homocysteine toxicity. eng. Microbiology (Reading, England) 148, (juli 2002). 41. Sekowska, A., Kung, H. F. & Danchin, A. Sulfur metabolism in Escherichia coli and related bacteria: facts and fiction. eng. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 2, (april 2000). 42. Waegeman, H., Maertens, J., Beauprez, J., De Mey, M. & Soetaert, W. Effect of iclr and arca deletions on physiology and metabolic fluxes in Escherichia coli BL21 (DE3). eng. Biotechnology Letters 34, (febr. 2012). 43. Sandén, A. M., Prytz, I., Tubulekas, I., Förberg, C., Le, H., Hektor, A., Neubauer, P., Pragai, Z., Harwood, C., Ward, A., Picon, A., De Mattos, J. T., Postma, P., Farewell, A., 61

67 Nyström, T., Reeh, S., Pedersen, S. & Larsson, G. Limiting factors in Escherichia coli fed-batch production of recombinant proteins. eng. Biotechnology and Bioengineering 81, (jan. 2003). 44. VWR. Methionine VWR < catalog/product.jsp?product_id= > (2017). 45. Aristidou, A. A., San, K.-Y. & Bennett, G. N. Improvement of Biomass Yield and Recombinant Gene Expression in Escherichia coli by Using Fructose as the Primary Carbon Source. en. Biotechnology Progress 15, (jan. 1999). 46. Sigma-Aldrich. Fructose Sigma-Aldrich <http : / / www. sigmaaldrich. com / catalog / substance / fructose ?lang=en&region=se> (2017). 47. Sigma-Aldrich. Glucose Standard Solution G6918 Sigma- Aldrich <http : / / www. sigmaaldrich. com / catalog / product/sigma/g6918> (2017). 48. Waegeman, H. & Mey, M. D. Increasing Recombinant Protein Production in E. coli by an Alternative Method to Reduce Acetate. en (2012). 49. Kang, Z., Geng, Y., Xia, Y. z., Kang, J. & Qi, Q. Engineering Escherichia coli for an efficient aerobic fermentation platform. Journal of Biotechnology. Industrial Biotechnology: Current Status and Future Development for the Sustainability of Human Society 144, (okt. 2009). 50. Kim, T.-S., Jung, H.-M., Kim, S.-Y., Zhang, L., Li, J., Sigdel, S., Park, J.-H., Haw, J.-R. & Lee, J.-K. Reduction of Acetate and Lactate Contributed to Enhancement of a Recombinant Protein Production in E. coli BL21. eng. Journal of Microbiology and Biotechnology 25, (juli 2015). 51. Briand, L., Marcion, G., Kriznik, A., Heydel, J. M., Artur, Y., Garrido, C., Seigneuric, R. & Neiers, F. A self-inducible heterologous protein expression system in Escherichia coli. 6, (sept. 2016). 62

68 52. Fruchtl, M., Sakon, J. & Beitle, R. Alternate carbohydrate and nontraditional inducer leads to increased productivity of a collagen binding domain fusion protein via fed-batch fermentation. Journal of Biotechnology 226, (maj 2016). 53. Mossing, M. C. & Record, M. T. Upstream Operators Enhance Repression of the lac Promoter. Science 233, (1986). 54. Garcia, H. G., Sanchez, A., Boedicker, J. Q., Osborne, M., Gelles, J., Kondev, J. & Phillips, R. Operator Sequence Alters Gene Expression Independently of Transcription Factor Occupancy in Bacteria. Cell reports 2, (juli 2012). 55. Nordström, K. & Dasgupta, S. Copy-number control of the Escherichia coli chromosome: a plasmidologist s view. EMBO Reports 7, (maj 2006). 56. Cooper, S. & Helmstetter, C. E. Chromosome replication and the division cycle of Escherichia coli Br. Journal of Molecular Biology 31, (febr. 1968). 57. Fossum, S., Crooke, E. & Skarstad, K. Organization of sister origins and replisomes during multifork DNA replication in Escherichia coli. en. The EMBO Journal 26, (okt. 2007). 58. Donachie, W. D. The Cell Cycle of Escherichia Coli. Annual Review of Microbiology 47, (1993). 59. Moran, L. A. DNA Replication in E. coli: The Solution (). 60. Yildirim, N. & Mackey, M. C. Feedback Regulation in the Lactose Operon: A Mathematical Modeling Study and Comparison with Experimental Data. Biophysical Journal 84, (maj 2003). 61. Arnaud-Barbe, N., Cheynet-Sauvion, V, Oriol, G, Mandrand, B & Mallet, F. Transcription of RNA templates by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Research 26, (aug. 1998). 63

69 62. Orlova, A., Feldwisch, J., Abrahmsén, L. & Tolmachev, V. Update: affibody molecules for molecular imaging and therapy for cancer. eng. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 22, (okt. 2007). 63. Újvári, A. & Martin, C. T. Thermodynamic and Kinetic Measurements of Promoter Binding by T7 RNA Polymerase. Biochemistry 35, (jan. 1996). 64. Arnold, S., Siemann, M., Scharnweber, K., Werner, M., Baumann, S. & Reuss, M. Kinetic modeling and simulation of in vitro transcription by phage T7 RNA polymerase. en. Biotechnology and Bioengineering 72, (mars 2001). 65. Kubitschek, H. E. & Friske, J. A. Determination of bacterial cell volume with the Coulter Counter. Journal of Bacteriology 168, (dec. 1986). 66. Nationalencyklopedin. konsekvensetik - Uppslagsverk - NE < www. ne. se/ uppslagsverk/ encyklopedi/ l% C3% A5ng/konsekvensetik> (2017). 67. New England Biolabs. What is the promoter sequence of T7 RNA Polymerase? NEB < 2015/01/30/what- is- the- promoter- sequence- of- t7- rna-polymerase> (2017). 68. Feldwisch, J. & Tolmachev, V. Engineering of affibody molecules for therapy and diagnostics. eng. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.) 899, (2012). 64

70 14 Bilagor A: Bedömningskriterier för stam och promotor Tabell 8: Några bedömningskriterier för utvärdering av stammar där + indikerar bra och - indikerar dåligt. Stam Väletablerat Proteinproduktion Låg acetatproduktion Bl BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS K Tabell 9: Fler bedömningskriterier för utvärdering av stammar där + indikerar bra och - indikerar dåligt. Stam Hög tillväxthastighet Gen för T7-RNA-polymeras Bl BL21(DE3) + + BL21(DE3)pLysS - + K Tabell 10: Bedömningskriterier för utvärdering av promotorer där + indikerar bra och - indikerar dåligt. Promotor Väletablerat Styrka Låg basal expressionsnivå Inducering Finjustering T T7-lac tac trc pl/pr

71 B: Sekvens för genkassetten 5 -TAATACGACTCACTATAGGGCCAGGGGTGCTCGGCATAAGC CGAAGATATCGGTAGAGTTAATATTGAGCAGATCCCCCGGTGA AGGATTTAACCGTGTTATCTCGTTGGAGATATTCATGGCGTAT TTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAAAGTGGATAACAAATTTAA CAAAGAACAGCAGAACGCGTTTTATGAAATTCTGCATCTGCCG AACCTGAACGAAGAACAGCGCAACGCGTTTATTCAGAGCCTGAA AGATGATCCGAGCCAGAGCGCGAACCTGCTGGCGGAAGCGAAAA AACTGAACGATGCGCAGGCGCCGAAATAATAACAAATAAAACG AAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGT TTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGC GGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCA GGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGC CATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTCCT GTCG-3 T7-promotor [67]. ompa-5 -UTR [7]. Affibody-gen (framtagen från aminosyrasekvens) [68]. rrnb-termineringssekvens [8]. 66