Bima 15 Mikrobiologi Rapport

Transkript

1 Bima 15 Mikrobiologi Rapport Laborationsrapport, Biomedicinprogrammet T2 Grupp 2: Mohanad Hayatleh Medarbetare: Tilde Andersson och Elin Arvidsson xx/03/2016

2 Abstract(Incomplete): I följande laboration undersöktes Verum Hälsoyoghurt påstående angående mängden Lactobacillus rhamnosus LB21 i deras yoghurt. Detta gjordes genom spädningserie samt odling av bakterien, där det försöktes beräknas om antalet CFU var korrekt till deras påstående. Dessutom studerades en okänd Bakterie X genom flera diverse metoder. Dessa innefattar OD beräkning, därav tillväxten av bakterien beräknas, med och utan en glukoslösning. Bakterien X fick även tillsättas på en platta med Ampicilin, för att bedöma om den hade antiresisitivet. Både plattorna genomgick en gramfärgning och undersöktes med ljusmikroskop för att bedöma kolonimorfologin.[1] Introduktion: Syftet i följande laboration undersöktes påståendet Verum Hälsoyoghurt har angående mängden Lactobacillus rhamnosus LB21 i deras yoghurt. Påståendet lyder: Det finns minst 10 miljarder av dem i varje paket Verum Hälsoyoghurt enligt bilden nedan. Under laborationens gång studerades även en okänd bakterie, benämnt bakterien X genom en serie av diverse laborationsmetoder. Bakterien X har en känd plasmid, som är benämnd pbad24 Bakterier har olikt människoceller plasmider, vilket är små genetiska DNA molekyler som består av ca 5000 baspar, pbad i detta fallet närmare 4500bp. Dessutom består bakterien oftast endast av en kromosom, som inte är lika tättpackad som människokromosmerna. Kromosomen är cirkulär och befinner sig omkring hela den prokaryota bakterien, bunden deras cellmembran, då prokaryota celler inte har ett kärnmembran. pbad24 används inom akademin.. Bakterier kan dela sig betydligt snabbare än vad en eukaryota cell gör. Detta är på grund av dennes skillnader i replikationsprocessen. En bakterie förökas genom en process som heter binär fission. Bakterien växer till dubbla sin storlek och sitt DNA, sedan delas den till två identiska bakterieceller, under denna process kan däremot bakterien utbyta delar av sitt DNA med andra bakterier omkring

3 den. En binär fission tar generellt sätt ca 30 minuter, alltså att en bakteriecell förökas till två dottersceller. Orsaken till varför en bakterie förökar sig snabbare är både för att den endast har en kromosom att kopiera. Dessutom har bakterien ingen cellkärna, samt inga centrosomer att arbeta med. Detta gör processen både mindre komplicerad samt mindre tidskrävande. Bakterierna Xs förmåga att föröka sig undersöktes under laborationen, genom undersökning av dennes optisk densitet. Däremot noteras det att bakterien växte i en laborativ miljö. Alltså befann sig bakterierna alltid i en näringsrik miljö samt en optimal temperatur för förökning. Ute i en vanlig miljö hade troligen bakteriens tillväxt varit lika snabb, då den både hade t.ex. kunnat vara utanför sin optimala temperatur,ph samt haft mindre näringsämnen att arbeta med. Antagandet att bakterien X tillväxtshastighet är annorlunda i och utanför laborationen är då rimlig. Gramfärgning[1] är en metod där förmågan av bakteriens cellvägen kan skiljas. En bakterie kan antingen ha en cell grampositiv eller en gramnegativ cellväg. Bakterien behandlas med ett kristallviolett jod komplex och safranin. Bakteriens cellväggen resulterar i att antingen erhåller en lila färg och är grampositiv. Medan den gram negativa cellväggen erhåller en rosa nyans. De grampositiva cellväggarna består av en cellvägg och långa peptidoglykan, ca nm. De gramnegativa har två cellväggar och kortare peptidoglykan kedja, ca 10nm lång. De gramnegativa är mer försvarade då två cellvägar då vid förstörelse av peptidoglykan, då den gramnegative bakterien har två membran och kortare peptidoglykan så är den därmed dessutom mindre beroende av peptidoglykanet. Vilket ger den gramnegativa har starkare försvar mot antibiotika såsom penicillin, binder in i cellväggen och stoppar påbyggnaden av peptidoglykan. Samtidigt är transporteringen mycket mer komplex, såsom diffundering av vatten molekyler. Detta innebär att den gramnegativa bakterien inte överlever lika bra i torra miljöer. Den grampositiva har en bättre förmåga att uppta vattenmolekyler och upplever inte samma problem. Samtidigt dör den positive bakterien omedelbart om dennes peptidoglykan förstörs. Orsaken till varför gramfärgning inte används på en människo cell är enkel, på grund av att den inte har en cellvägg. (dessa två metoder ska jag bara förklara lite på introduktionen) OD CFU Späddningserie Metod: Gramfärgning: Två glasplattor, i den ena tillsattes Bakterie X samt L. rhamnosus LB21 i den andre. Både plattor pågick samma metod. Först tillsattes kristall violett lösning under 1 minut. kristall violett lösningen sköljdes med Lugol s solution stabilized. Ytterligare Lugol s solution stabilized tillsattes under 1 minut och sköljdes sedan bort med vatten i 5 sekunder. Sedan tillsattes Decolorizing reagent 4 under ca 10 15, varvid en gråblå lösning erhölls. Sköljning av vatten återupprepades under 5 sekunder.

4 Plattan täcktes av en Safranin lösning under 1 minut och sköljdes med vatten under 5 sekunder igen. Plattan torkades innan den togs och undersöktes under ett ljusmikroskop. Formen och färgen på bakterierna bedömdes och noterades. Od beräkning: 4 olika 50mL falcon rör förberedes, alla med sina enskilda markeringar. Rören blev namngivna: LB Stilla, LBG Stilla, LB Skak, LBG Skak. I varje rör tillsattes 10 ml LB lösning. 100 µl LB förberedes och tillsattes i ett eppendorfrör. En platinöss användes för att samla åt sig bakterien X ur agarplattan och tillsattes i eppendorfröret. Eppendorfröret vortexades för att jämtfördelat tillblanda bakterien X i lösningen. 20 µl ur eppendorfrörets lösning tillsattes i varje falcon rör. Alla fyra inkuberas i 37 C, därav de med Skak markeringen skall skakas och de återstående proverna inkuberas stillastående. Dessa proverna uthämtades en gång per timme fyra gånger. Under varje tillfälle togs 1,5mL av varje prov och tillsattes i en kyvett. Kyvetten absorbansmättes med våglängden 620 nm. Efter det fjärde provet var fulländat användes mätdatan för att framställa en graf som beskrev bakterie X tillväxt. CFU; Ett provrör av Verums hälsoyoghurt togs och späddes ut med LB. Det späddes till 5 gånger, därav spädningen hade en 10:1 koncentration mellan LB och yoghurten. En lösning av 100 CFU/100µL erhölls. Tre blod agarplattor förberedes, med benämningen P1, P2 och P3. Dessa tre plattor hade sina individuella mängder bakterier tillsatta, värden givna på Tabell 1, och sedan spred de omkring plattan med hjälp av en plattinös. Dessutom förberedes två blod agarplattor, en med ampicillin och en utan. I dessa plattor tillsattes en bakterien X. Parafilm täcktes över på alla stängda plattor och inkuberades på 37 C. En viss tid efteråt togs plattorna ut ur inkuberingen och kolonier hade formats. Kolonierna beräknades på P1,P2 samt P3 för att återberäkna de ordinarievärderna filen hade. Dessutom noterades skillnaden mellan X bakterien i ampicillin och den utan. Resultat: Blodagar plattan med bakterien X som innehöll ampicillin samt den utan hade samma tillväxt. Detta antyder alltså att bakterien X är opåverkad av ampicillin. Bakterien X växer snabbare under skakning än vid stillastående tillstånd. Det kan även observeras på Figur 1 att bakterien X använder glukos för att försnabba sin tillväxt, då dennes absorbans ökar under förhållandena med glukos tillgängligt Slutligen kan man observera att bakterien X växer snabbare under ett förhållande därav skakning utan glukos är tillgänglig, LB Skak, än denne med glukos fast utan skakning, LBG Stilla.

5 Figur 1: OD beräkning vid våglängden 620nm på bakterien X. Som figuren visar så motsvarar varje färg varje provrör som användes. Observera att den LBG Skak ökar biomassa snabbast de 3 första timmarna. Vad som även observeras är under den fjärde timmen så sjunker ökningshastigheten för LBG Skak. LBG Stilla påbörjar likt LB stilla, men kommer sedan under en längre tid att bilda mer biomassa. Gramfärgningen gav oss en bild på våra två bakterier. Bakterien X visade sig vara gramnegativ, som visas på Figur 2a. Den syntes att vara coccus struktur. L. rhamnosus LB21, Figur 2b, visade sig vara grampositiv. L.rhamnosus erhöll en bacilli form.

6 Figur 2a: Bakterien X uttrycker en rosa färg, Figur 2b : L.rhamnosus LB21 erhåller en blandning vilket antyder att den är gram negativ. av rosa och blå färg, lilaliknande färg. Detta Den erhåller en coccus struktur. antyder alltså att den är gram positiv. Den erhåller en bacillus/stavformad struktur. Antalet CFU/ml på gruppens plattor är överstämmer med påståendet, därav återberäkning från antalet CFU på plattan i alla tre värderna återgav ett värde högre än 1, CFU/ml. Tabell 1: Värden och medelvärde av CFU/ml i yoghurten för gruppen: Prov: antal CFU Beräknat antal CFU Antal CFU/ml P1: ,68 x 10 7 P2; x 10 7 P3: x 10 7 Pmedel 3,8467 x 10 7 Antalet CFU/ml på alla plattor är gemensamt med påståendet, där alla bakterier överstiger 1, CFU/ml. Vid beräkning av medelvärdet för plattornas CFU,synes på Tabell 1, visade sig antalet bakterier vara mellan 4 5 fler än minimivärdet.

7 Tabell 2: Värden samt medelvärdet av CFU/ml i yoghurten för alla grupper: Prov Antal CFU/ml 1.68 x x x x x x x x x x x x 10 7 Medelvärde 4,67 x 10 7 Diskussion: Verums hälsoyoghurt påstående är korrekt, det finns mer än 10 miljarder per liter hälsobakterier i deras fil. Både utgående från gruppens medelvärde, Tabell 1, vilket blev 38,5 miljarder bakterier per liter samt alla gruppernas medelvärde, Tabell 2, 46,7 miljarder per liter är resultatet densamme, mer än 10 miljarder bakterier finns per liter i filen. Resultatet överstämmer med påståendet, däremot är kan det tillägas att påståendet är oklart. mer än 10 miljarder kan betyda allt som är större än 10 miljardet, vilket ger den enorma felkällan att det blir svårt att precisera vilka värden företaget hävdar att filen har. Vad orsaken till varför skillnader kan åstakomma är dock beroende på hur grupperna laborerade och en jämförelse av värderna hävdar att det finns felkällor.

8 Orsaken till varför värdena är baserat på gruppen medelvärde är för att det inte gick att utgå från en av provlösningarnas värde, då det inte finns ett korrekt svar. Samtidigt är medelvärdet alltid närmare i värden än vartera prov skall vara. En jämförelse med alla gruppernas medelvärde gjordes också, då det även innehöll fler värden. Samtidigt utgick inga jämförelser mellan enstaka av de andre gruppernas medelvärde, då vi varken vet hur de jobbade och ifall de beräknade korrekt. Värdet vår grupp erhöll var det 3de högsta, dock var det mindre än medelvärdet. Om resultatet är för högt eller för lågt är dock ännu oklart. Orsaken till varför våra var för många kan ha skett på grund av att det beräknades för många punkter, som må varit kontamineringar, på plattan. Även kan det förekomma att utspädningen varit inkorrekt, och orsakat en större mängd bakterier än önskades sattes på plattan. En faktor kan även att de begått misstag och orsakat annorlunda värden än, såsom t.ex. inte ha räknat alla punkter på plattan. Alltså är det svårt att veta vad som är mer rätt än det andre, dock kan man skilja mellan vilka misstag grupperna må ha gjort. På en av gruppens blodagarplattor noterades en stor gul prick, och antogs omedelbart vara kontaminering. Det hade skett en hemolys på blodagarplattan. Kontamineringen kan ha skett av många orsaker, blodagarplattans lock må ha varit öppen för länge, och bakterier från luften kan ha landat på plattan. Miljön må inte ha varit steril nog, eller så må någon ha talat för nära plattan och spred bakterier från munnen på plattan. Bakterier är trots allt väldigt förekommande, generellt sägs det att finnas 10 bakterier för varje människocell vi har. Det finns alltså många platser där kontaminationen kan ha kommit ifrån, då de finns överallt på huden, i munnen och tänderna, men även överallt i luften och bordet. Från tillväxtkurvan på Figur 1 observeras det att bakterien X växer snabbare med glukos och skaktillstånd än i alla andra förhållanden. Bakterien X växte snabbare med glukos, vilket innebär att X föredrar att ha glukos som sockerkälla och använder det till att erhålla energi. Bakterie X tillväxthastighet ökade dessutom utav skaktillstånd. Detta antyder alltså att bakterien växte snabbare föredrar att växa snabbare i en syrerik miljö, då bakterierna blandades och hamnade längst den syrerika ytan. X är däremot inte aerob, då den även hade en tillväxt om bakteriena befann sig på botten av provrören, dock inte lika snabbt, Bakterien X är alltså fakultativ anaerob. När X kommer i kontakt med glukos i en syrerik miljö sker vad som kallas för en cellular respiration, vilket är väldigt lik den eukaryota cellandningen. Den påbörjas med att glukoset undangår en glykolys, därav pyruvat utvinns. Därefter hade pyruvatet undangått i en citronsyracykel. Med produkterna från citronsyracykeln, NADH, GTP och FAD 2 hade slutligen omvandlats till ATP i elektrontransportskedjan. Vid en syrefattig miljö, vid bottnet av provet fermenterades glukosen istället. Glukos fermentering innefattar nedbrytning av glukos till mjölksyra och en betydligt mycket mindre utvinst av ATP. Med en mindre energivinst ges även en långsammare tillväxtshastighet, vilket förklarar varför tillväxten var långsammare på de stillastående proven, Bakterien X pbad24 plasmid huvudsakligen positiva resultat. Under laborationen så växte X lika opåverkat av ampicillin, bakterien är alltså resistivitet. Detta är på grund av dennes plasmid pbad24, vilket har ett operon som gör bakterien antibiotikaresistiv. Detta är alltså väldigt fördelaktigt för bakterien, då det försäkrar dennes överlevnad i miljöer som laboratoriet men även från vardagliga läkemedel, vilket gör bakterien väldigt skyddad.om bakterien däremot befinner sig i miljöer där ingen antibiotika används är plasmiden onödvändig, och kostar bakterien energi att återbygga vid varje förökning.

9 En plasmid är relativt små, de består generellt sätt ungefär av 5000 baspar medan en kromosom, på t,ex bakterien Escherichia Coli K12 innehåller 4,64 miljoner baspar. Därför är en plasmid inte essentiell till bakterien, utan den tillför extra egenskaper. Vid vissa fall, kan bakterier få vissa plasmider, genom konjugering, vilket är en pili pili utbyte mellan två bakterier. Vid dessa fall dessutom icke specifika plasmider, alltså egenskaper som antingen kan gynna eller missgynna bakterien. Vid dessa fall slängs antingen plasmiden bort, eller så selekteras bakterien bort med tiden. Bakterien kan även uppta nytt genetiskt material genom andra metoder, som t,ex transformering. Bakterien plockar fritt DNA utanför cellvägen och packar ihop det själv. Detta ger självklart också ospecificitet som kan vara en risk, däremot är det även bra för bakterier att erhålla nytt genetiskt material. Detta ger många olika bakterier av samma släkte en större chans av överlevnad, vid risk av en selektionsprocess. Genetiskt, vid närvaro av glukos inhiberas pbad24 plasmiden som bakterie X har, detta är på grund av att pbad24 promotor, pbads operon, L arabinos operonet aktiveras av Arabinos + camp. camp inhiberas när bakterier kommer i närvaro av glukos. Vad som specifikt inhiberas är camp producerande enzym adenylatcyklas vid närvaro av glukos. Detta resultetar i att produktionen av PBADs rekombinanta protein inhiberas. Om bakterie X hade t.ex. varit obligate aerob, som t.ex. mycobacterium tuberculosis som hade den troligen dött om de hamnade på botten av de stillastående proverna, då obligate aeroba måste ha syre för att kunna överleva. Om X hade varit microaerophile, hade den ha gynnats av att ha syre, däremot dör de av för höga koncentrationer syre. Därför hade t.ex. släktet Campylobacer inte varit nöjd i skak tillstånd, då den troligen hade dött av syreförgiftning om de hamnade på ytan av proverna. Bakterien X kan däremot påverkats av andra faktorer i provlösningarna om det hade önskats. Man hade t.ex. kunnat testa hur bakterien påverkades av olika ph, salt eller tillsättning av vissa medium som endast specifika bakterier kan använda som t.ex. Nitrat och svavel. Även ändring av koncentrationen i mediumlösningen hade påverkat tillväxthastigheten, då t.ex. glukosen eventuellt hade tagit slut och bakterierna hade varit tvungna att använda andra energikällor. Under gramfärgningen erhölls 2 former, X bakterien erhöll en coccus form och L.rhamnosus LB21 erhöll en stavformad struktur. Men förutom deras stort varierande storlek har bakterier desutom många olika former. Andra former såsom Spiriller. som antyder att bakterien är spiralvriden och spirocheter, som är långa, helixformade bakterier. Dessutom om ett starkare mikroskop hade använts så hade en mer detaljrik bakterie visats, som mån givit oss en ledtråd till vilken sorts bakterie eller egenskaper bakterien har. Observationer som t.ex. pili, som är tunna trådliknande utskott som har funktion att överföra genetiskt material till andra bakterier. Även t.ex. flageller hade kunnat noteras, som då hade sagt hur bakterien förflyttade sig. Däremot behövs det slutligen noteras att X bakterien skulle ha en stavform. Slutligen skall identiten av bakterien X listas ut. Bakterie X visar alltså många tendenser och tecken på att vara Escherichia Coli. (Motiveringen kommer komma från allt ovanför men görs tills på fredag! Dessutom kommer troligen detta stycket vara ovanför det mesta av diskussionen) Källor(INTE KLARA ALLS ) :

10