Cyanocobalamin, B12. Shahed Humam. Farmakognosi, biologisk aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling 7,5 hp. Uppsala universitet

Transkript

1 Cyanocobalamin, B12 Farmakognosi, biologisk aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling 7,5 hp Uppsala universitet Shahed Humam 1

2 Sammanfattnig: Vitamin B12 förekommer naturligt i livsmedel, främst lever, lax samt mjölk, ost, ägg, jästextrakt och hjälper t.ex. kroppen att producera röda blodkroppar, funktionen i det centrala nervssystemet, metabolismen av fettsyror och folat. Vitamin B12 är värmebeständigt men är känsligt för ljus, syre, alkaliska och sura lösningar. I livsmedelsindustrin berikas livsmedel, t.ex. barnmat, med cyanocobalamin som är en syntetisk form av vitamin B12. Det är viktigt att livsmedel innehåller avsedda mängder av vitamin B12. Perniciös anemi är en autoimmun sjukdom som kännetecknas av vitamin B12 brist och orsaken är oförmågan hos patienter att absorbera B12 i magsäcken. Patienter kan behandlas med tillskott av B12 intramuskulärt. 2

3 INNEHÅLLSFÖRTECKNING sidonummer HISTORIA OCH BACKGRUND 4 OLIKA ANALYS METODER TILL ANALYS AV VITAMIN B12 I FARMACEU- TISKA OCH LIVSMEDELS PRODUKTER 5 LÄKEMEDELS UTVECKLING OCH EFFEKT 7 VITAMIN B12 9 REFERENSLISTA 10 3

4 HISTORIA OCH BAKGRUNG Cyanobakterier beräkans vara en av de första levande organismer som fanns på jorden sedan 3,6 miljarder år. De deltog i syrebildning av atmosfären eftersom de har Sin egen fotosyntes. De har kvävefixering också. Kallades då för blågröna alger. Cyanocobolamin är en vanlig källa för B 12 vitamin.b 12 vitamin är namn för många olika prekursorer till ab 12 vitamin, medan cyanocobolamin är en sort av hela familjen. Den förekommer inte hos varken växter eller djur, inte human kroppen heller kan göra det, utan den syntetiseras bara av bakterier framför allt cyanobakterier. Men djur kan omvandla cyanocobolamin till den aktiva formen metylkobalamin. Männoskokroppen är hela tiden i behov av B 12 vitamin, då den involveras i cellomsättning, DNA syntes och reparation samt i bildning av röda boldceller. Denna vitamin upptäcktes i samband med sjukdomen anemi. Den är mest kompliserad molekyl inom vitamingrupperna. B 12 vitamin är en stor molekyl men p.g.a. dess stabilitet så den är lätt att krystalisera samt syntetisera. Den produceras från fermentering (1) av bakterier, vilket är lätt att renas ut sen. Den kan ge mörkröda kristaller eller amorf pullver. Hela syntesen av B 12 vitamin upptäcktes år 1972 av kemisterna Albert Eschenmoser och Robert Burns Woodward. 4

5 B12 vitamin upptäcktes genom en lång historia av sjukdomen perniciös anemi som orsakas av defekt i en inre faktor som i magsäcken som har en uppgift att underlätta absorption ab B12 vitamin i kroppen. (1) Fermentering: innebär en ofullständig oxidation av organiska molekyler i frånvaro av syra. OLIKA ANALYS METODER TILL ANALYS AV VITAMIN B12 I TISKA OCH LIVSMEDELS PRODUKTER: FARMACEU- Vitamin B12 finns i små mängder (30-50ng/g) så det är viktigt att ha god provberedning och känsliga analysmetoder. Traditionell analysmetod för vitamin B12 sker genom mikrobiologiska tester med Lactobacillus leishmannii och turbiditetsmätning. Nackdelarna är relativt svag noggrannhet (accuracy), känslighet (sensitivity) och att det tar tid (inkubering över natt). Eftersom vitamin B12 finns i olika former blir det ofta nödvändigt att analysera totala halten vitamin B12. En annan komplexitet är att analysmetoder ofta behöver tillämpas något olika beroende på vilket slags livsmedel som analyseras. Så olika metoder att analysera vitamin B 12 är : Mikrobiologiska mikrotiterplattor: metoden används för att bestämma halten av vitamin B 12 i farmaceutiska och livsmedel produkter samt för att addera vitamin B 12 till produkter såsom kapslar eller mix vitamins produkter. Metoden går ut på att extrahera vitamin B12 från ett prov och extraktet utspädds.vitamin B12- assay medium och det utspädda extraktet pepitteras till brunnar av mikrotitter platta, vilket är beklädd av Lactobacillus delbrueckii subp. Lactis. Det är en anaerobisk bakterie. Tillväxt av denna bakterie är beroenda av mängden av vitamin B12. När halten av vitaminet tar slut så stoppas tillväxt av denna bakterie. Så ju mer man adderar vitaminet desto mer tillväxt av denna bakteria tills all b12 är konsumerad. Detta utföras under inkubation i mörkret mellan tim i 37 C. Densitiet av metabolism eller tillväxt av bakterien i relation till den extraherade vitamin B12 mätts och gemgörs med en standard kurva. Mättningen sker genom mikrotiterlattläsare mellan nm eller nm. 5

6 en mikrotiterplatta ELISA (Ensyme Linked Immuno Sorbent Assay): principen för metoden är att mikrotiter brunnar äe beklädda med specifika antikroppar mot vitamin B12. Vitamin B12 standard, provlösing och enzymmärkta vitamin B12( enzym konjugat) adderas till brunnar. Båda fria och anzymmärkta vitamin B12 kommer att tävla om bindningstället i antikropparna( kompitetiv bindning). De obundna enzymmärkta B12 kommer att avlägsnas med ett tvättningssteg. Sedan adderas substrat/ kromogen till brunnarna. Bunden enzym konjugat kommer att färga kromogen till blått. Tillsättning av stopp reagens leder till färg omslag från blått till gult. Mättningen görs fotometriskt vid 450 nm. De resultat värden av asorbans är omvänt proportionellt mot vitamin B12 halten i provet. Några av teknikens fördelar är att den är känslig, snabb, säker och robust. Något som också bidragit till dess popularitet är att tekniken är användarvänlig och att den lämpar sig för automatisering. ELISA, en immunokemisk mätmetod där antikroppar eller antigener som mäts har märkts med enzymer. Närvaro av antigen eller antikropp påvisas via enzymernas förmåga att t.ex. framkalla en färgförändring i testet. 6

7 Immunoaffinitetskolonner (IAC) för provrening inför HPLC-detektion. Metoden går ut på att monoklonala antikroppar som har hög affinitet till vitamin B12. Syftet att extrahera B12 från andra komponentet i ett prov och haltbestämma det. Ett prov eller lösning som innehåller B12 kommer att hällas på en kolumn därefter hälls de monoklonala antikropparna i en gel suspension kommer att binda direkt till vitamin B12 i provet. Kolumn tvättas med vatten för att få bort alla andra komponenter och bara antikropparna bunda till B12 kommer att stanna kvar i klumnen. Sedan frisätta vitamin B12 från antikropparna med tillsättnig av metanol. Eluatet (metanol med B12) kommer att evaporeras ) för att få torrt B12 som nu är färdig för att köras i HPLC. Läkemedels utveckling och effekt Perniciös anemi upptäcktes år1849 av Tomas Addison och behandlingen av denna sjukdom upptäcktes av George whipple runt Whipple var den första som upptäckte behandlingen mot perniciös anemi och det var rå lever som han kom på som botade hela sjukdomen. Han använde sig av hundar i sina experiment. Genom att lät de insjukna i sjukdomen först sedan gav en del av de lever vilket gjorde att de tillfrisknades. Medan andra fortsatt vara sjuka. Så patienterna fortsatt att dricka lever saft eller äta lever dagligen för att tillfriskna i många år. Den aktiva substansen i lever som botade sjukdomen var okänd tills två kemister kunde isolera den från lever år Kemisterna hette Karl A. Folkers från USA och Alexander R. Todd från store Britannien. Substansen var kobalamin som fick namnet B12 vitamin. År 1950 blev B12 vitaminen kraktäriserad och renat från lever som kunde även injiceras intramuskulärt. Efter detta upptäckten så började produktionen av vitaminen utvecklas från bakterien. Som nämnt ovan år 1972 upptäcktes hela syntesen av bakterie fermentering av kemisterna Albert Eschenmoser och Robert Burns Woodward. Det finns studier om relationen mellan vitamin B12 och neurodegnerativa sjukdomar såsom Alzheirmers och parkinson. (studien, Treatment of Alzheimer-type dementia with intravenous mecobalamin) Andra studier fann relation mellan vtamin B12 kan minskning av illamåendet hos gravida kvinnor.( Management of common symptoms of pregnancy) 7

8 Andra studie visade en bra effekt av mekobalamin för behandling av Alzheimers typ dimens utan biverkningar. En åldersrelaterad försämring av vitamin b12 status har dokumenterats väl. Tidigt upptäckt av vitamin B12 brist kan förhindra utveckling av allvarliga kliniska symptom, men plasma koncentration av vitamin B12 är känt att vara ofullständig mått på vitamin B12 brist. Där för urin metylmalonyra (MMA) kan vara mer informativ bio markör av vitamin B12 brist, men kost och andra livsstil faktorer avgörande är okända. Studiens mål är att identifiera faktorer för MMA koncentrationer hos friska män och kvinnor i 65 års ålder. Slutsatser drogs av studien, var att holotranscobalamin och kön var de viktigaste faktorerna för urin MMA halterna hos friska män och kvinnor. Denna bio markör av vitamin B12 status kan underskatta vitamin B12 brist hos patienter med nedsatt njurfunktion. (Studien är helt nytt från 2012.Determinants of urinary methylmalonic acid concentration in an elderly population in the United Kingdom.) 8

9 Vitamin B12 Den består av kärnan som kallas för corrin. Den är en stor heterocyklisk molekyl med en ko-bolt jon i mitten som är bunden till en cyanomolekyl. Till så kallade kärnstrukturren ckobolt binds mången metyl och amidogrupper. I den sjunde amidogruppen som är N-kalkylerade binds en lång svans av ribos, fosfat, isopropanol och dimetylbenzimidasol grupper. En kväve atom i imidasol gruppen utgör den femte kväveliganden till cobolt jonen. Just korrin med kobolt jon utgör den biologiska effekten hos vitamin B12. Den involveras i röda blodkroppars bilding, höljet av nerver och olika proteiner samt fettsyror. Två kända re-aktioners vägar i av vitamin B12 i kroppen. Den metionin syntas reaktionen med metylkoba-lamin och metylmalonyl coa-glyceratmutas reaktion med adenosylkobalamin. Metylkobalamin är den direkta kofaktorn av B12 i kroppen som behövs för att få metionin från homosystein. B12 behövs för bilding av folatpolyglutamater. Den aktiva coenzymet för bildning av nervän-dar och för folsyra närvaro vid bildning av röda blodkroppar. Perniciös anemi är en autoimmun sjukdom som kännetecknas av vitamin B12 brist och orsaken är oförmågan hos patienter att absorbera B12 i magsäcken. Patienter kan behandlas med tillskott av B12 intramuskulärt. 9

10 Referenslista: Metoder kommer från intervju med företaget, FOOD DIAGNOSTICS AB Artiklar från pubmed för studier och klinskeffekt Treatment of Alzheimer-type dementia with intravenous mecobalamin) Determinants of urinary methylmalonic acid concentration in an elderly population in the United Kingdom,2012. Management of common symptoms of pregnancy Även andra hemsidor användes