IMMUNOHISTOKEMISK DETEKTION AV BLASTEMALA ELEMENT I WILMS TUMÖR AMINA WALI. 15 hp Hälsa och Samhälle Biomedicinska analytikerprogrammet

Transkript

1 IMMUNOHISTOKEMISK DETEKTION AV BLASTEMALA ELEMENT I WILMS TUMÖR AMINA WALI Examensarbete Malmö Högskola 15 hp Hälsa och Samhälle Biomedicinska analytikerprogrammet Malmö

2 IMMUNOHISTOKEMISK DETEKTION AV BLASTEMALA ELEMENT I WILMS TUMÖR AMINA WALI Wali, A. Immunohistokemisk detektion av blastemala element i Wilms tumör. Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö högskola: Fakulteten för hälsa och samhälle, Institutionen för Biomedicinsk vetenskap, Wilms tumör (WT) är en malign snabbväxande tumör och den vanligaste solida buktumören hos barn under sex år. En kombination av operation, cytostatika och strålbehandling har lett till att 90 % av barnen idag blir helt botade. Enligt ett enhetligt europeiskt morfologiskt klassifikationssystem och behandlingsprotokoll behandlas alla barnpatienter med WT med cytostatika pre-operativt innan nefrektomi. Den histologiska tumörtypen, klassad efter operation, är helt avgörande för vidarebehandling av WT. Tumören består av tre celltyper, stromala epiteliala och blastemala, där de blastemala har en stor likhet med mesenkymala celler i njuren hos embryot. Tumörer med mer än 2/3 blastem klassificeras som högrisktumörer som följs upp med ytterligare, extra intensiv kemoterapi. I dagsläget görs en histologisk bedömning av tumörens riskgrupp endast på hematoxylin-eosin färgning. Proteinet SIX1 har nyligen rapporterats fungera som lämplig biomarkör för blastem. Med hjälp av immunohistokemi undersöktes i detta arbete om SIX1-färgning på blastem kan tillämpas kliniskt för säkrare riskbedömning av WT. Efter omfattande utvecklingsarbete med testning av olika varianter av förbehandling och detektionsmetod kunde ett fullgott protokoll för kliniskt bruk utformas. Detta kommer nu att implementeras inom klinisk patologi i Skåne. Nyckelord: histologi, immunohistokemi, SIX1, Wilms tumör 1

3 IMMUNOHISTOCHEMICAL DETECTION OF BLASTEMA ELEMENTS IN WILMS TUMOR AMINA WALI Wali, A. Immunohistochemical detection of blastemal constituents in Wilms tumor. Degree Project in Biomedical Science 15 Credit Points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical Science, Wilms tumor (WT) is a malign fast growing tumor and the most common solid abdominal tumor amongst children under the age of 6. A combination of surgery, chemotherapy and radiotherapy has led to a 90 % cured rate among children affected by WT. According to a uniform European morphological classification system and treatment protocol, all WTs receive pre-operative chemotherapy prior to nephrectomy. Histological tumor type, determined after surgery, is crucial for further treatment of WT. The tumor consists of three cell types: stromal elements, epithelial elements and blastema, of which the blastema has a great similarity to embryonic mesenchymal cells. Tumors that consist of more than 2/3 blastema are classified as high risk tumors, recieving additional intensive chemotherapy. Today, an assesment of WT histology is performed on hematoxylin-eosin stained specimens only. Recently, the SIX1 protein has been reported to function as a suitable biomarker for blastema. Using immunohistochemistry, it was investigated if SIX1 detection could be applied clinically for classification of WT. After several modifications of pre-treatment and primary antibody detection methodology, a clinically robust immunohistochemical staining protocol was finally developed. This will now be implemented in the clinic. Keywords: histology, immunohistochemistry, SIX1, Wilms tumor 2

4 INNEHÅLLSFÖRTECKNING BAKGRUND 4 Immunohistokemi 5 SIX1 & CK AE 1/3 7 SYFTE 8 FRÅGESTÄLLNING 8 MATERIAL OCH METOD 8 Optimering av förbehandling för SIX1 9 Spädningsserie, SIX1 singelfärgning och singel CK AE 1/3 9 Dubbelfärgning med Red-kit för SIX1 9 Dubbelfärgning med DAB-kit för SIX1 10 Finjustering av slutgiltigt protokoll för SIX1 och CK AE 1/3 10 ETISK BEDÖMNING 11 RESULTAT 11 Optimering av förbehandling för SIX1 11 Spädningsserie, SIX1 singelfärgning och singel CK AE 1/3 12 Dubbelfärgning med Red-kit för SIX1 14 Dubbelfärgning med DAB-kit för SIX1 15 Finjustering av slutgiltigt protokoll för SIX1 och CK AE 1/3 15 DISKUSSION 17 UNDERSÖKNINGENS FRAMTIDA VÄRDE 21 REFERENSER 22 3

5 BAKGRUND Wilms tumör (WT) eller nefroblastom är en malign snabbväxande tumör och den vanligaste solida buktumören i småbarnsåldern. I Sverige drabbas cirka barn per år av WT. En majoritet av de drabbade barnen är under 6 år med en debutålder mellan ca 2-4 år [1]. Tumören ger sällan uppenbara symptom utan upptäcks som en utbuktning eller svullnad på bukens ena sida vilket leder till kontakt med sjukvården. I vissa fall kan viktnedgång, buksmärtor samt feber förekomma. Tumören är därför vid tidpunkten för kontakt med sjukvård ganska stor. Diagnos ställs enklast med hjälp av ultraljud och med hjälp av påföljande datortomografi kan tumörens utbredning, eventuella metastaser samt kärlengagemang undersökas. Tumören är cytostatika och strålkänslig och behandling av tumören görs med en kombination av operation, cytostatikabehandling samt strålbehandling vilket har lett till att nio av tio barn idag blir helt botade. Metastasering av tumören kan förekomma, främst till lunga, men är ovanligt. WT kan i sällsynta fall drabba båda njurarna hos barn med vissa genetiskt betingade riskfaktorer [2]. Det har genomförts ett stort antal studier rörande histopatologisk riskbedömning och behandling av WT. I Europa har främst Société Internationale d Oncologie Pediatrique (SIOP) bedrivit flera studier kring WT samt utformat ett enhetligt morfologiskt klassifikationssystem och ett behandlingsprotokoll som följs i stora delar av världen [5]. Enligt SIOP-protokollet behandlas alla WT pre-operativt med cytostatika i syfte att krympa tumören så mycket som möjligt innan operation [3]. Operativt avlägsnas tumören intakt för att få bort primärtumören helt. Beroende på infiltration av tumör i omgivande vävnad och tumörens omfattning görs en partiell eller fullständig nefrektomi. Tumörens histologiska struktur efter första omgången cellgiftsbehandling och operation avgör vilken typ av cellgiftsbehandling som sedan följer. Histologisk tumörtyp är alltså helt avgörande för vidarebehandling av WT. Histologiskt består WT oftast av stromala, blastemala och epiteliala celltyper. Tumören har därför en trifasisk struktur. De blastemala cellelementen består av odifferentierade celler med mesenkymalt ursprung, tätt packade och med lite cytoplasma. De har en stor likhet med mesenkymala celler hos den outvecklade njuren i embryot [4]. De stromala och epiteliala cellerna kan ha olika grad av differentiering, och de epiteliala cellernas struktur kan ibland ses som en påbörjan till glomeruli men oftast bildar de tubuli i olika mognadsstadier. Stromacellerna bildar oftast en cellfattig tumörkomponent som liknar bindväv. Alla tre vävnadselement kan hittas i en WT, dock med varierande fördelning hos olika patienters tumörer. Klassificering av WT enligt SIOP delas in i tre typer utifrån histologi; lågrisktumörer som består av helt nekrotiska tumörer, intermediärrisktumörer som består av epiteliala, stromala och blastemala element, eventuellt med fokal anaplasi och högrisktumörer som antingen består av mer än 2/3 blastem eller uppvisar diffus multifokal anaplasi. Stadieindelningen enligt SIOP är följande; stadium I- tumör begränsad av njurkapsel och radikalt exstirperad mikroskopiskt, stadium II- tumör invaderar njurkapsel, njurhilus eller njurbäcken, mikroskopiskt radikal, stadium III- tumör ej radikalt exstirperad, inga fjärrmetastaser eller tumörruptur, stadium IV- fjärrmetastaser/lymfkörtelmetastaser utanför bukhålan, stadium V, bilaterala njurtumörer oavsett tidpunkt [2]. 4

6 Tumörens histologiska struktur samt stadium avgör typen och längden av cytostatikabehandling för patienten. SIOP-protokollet har som riktlinje att varje barn över sex månader med påvisad tumör i njure får pre-operativ cytostatikabehandling, oavsett tumörhistologi i syfte att minska risken för tumörruptur under operation vilket kan öka risken för metastasering [5]. Behandling ges med aktinomycin D och vinkristin [2] över en 4veckors period. Högrisktumörer, framförallt sådana med diffus anaplasi efter operation och efter preoperativ behandling följs upp med ytterligare kemoterapi, beroende på stadium. Nackdelen med att följa SIOP-protokollet och inte ta biopsi innan pre-operativ behandling är att man i sällsynta fall administrerar kemoterapi till benigna tumörer, det vill säga patienter som inte behöver det [5]. Kemoterapi är en tuff behandling med många biverkningar. Därför är det av stor vikt att kunna anpassa behandlingsdos och tid så mycket som möjligt till varje barn med WT för att uppnå bästa behandlingsresultat och samtidigt minska riskerna. Därför krävs det stor noggrannhet för att korrekt kunna känna igen och klassificera en WT och dess cellkomponenter, och detta blir särskilt svårt när tumören har blivit behandlad och därför ändrat sin struktur innan nefrektomi. Bedömningen kan lätt bli subjektiv. I dagsläget görs en histologisk bedömning av WT endast på hematoxylin-eosin färgning på rutinlaboratorium och det vore fördelaktigt med en selektiv färgning som kan göra det enklare att skilja de olika cellkomponenterna åt. Inte minst är det ibland svårt att skilja blastem från tätt liggande epiteliala strukturer. Nyligen har rapporterats att proteinet SIX1 kan fungera som en lämplig biomarkör för just blastem med god sensitivitet och bättre specificitet än andra föreslagna markörer [6]. Immunohistokemi Immunohistokemi (IHC) är en metod som används för att lokalisera specifika antigen i vävnader med hjälp av antikroppar. Metoden baseras på antigen-antikropp interaktion där antikroppar är konjugerade med ett kromogen som via ett substrat ger ett färgomslag vilket kan visualiseras och lokaliseras i ljusmikroskop. Immunohistokemiska undersökningar fungerar som ett värdefullt komplement till histokemiska tekniker och utökar möjligheten för att påvisa vissa vävnadskomponenter. Den grundläggande principen går ut på att stärka signalen av inbundna antikroppar till vävnaden samtidigt som man reducerar den ospecifika bakgrundsfärgningen för att få ett tillfredställande resultat. Valet av antikropp vid IHC baseras på två faktorer, sensitivitet och specificitet av antigen-antikropp interaktionen i vävnaden. Formalin som fixeringsmedel används på många laboratorier och har många fördelar, men har som effekt att maskera proteiners epitop. Det finns trots det bra tekniker för att göra epitoper tillgängliga som kan tillämpas på formalinfixerat paraffininbäddat material, så kallad antigen retrieval [7]. Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) är den vanligaste metoden. Då används en kombination av värme och buffertar med olika ph som förbehandling för att bryta upp metylenbryggor som bildas av formalinet. Förbehandling med protolytiska enzymer är en annan metod som ofta tillämpas. Med hjälp av detta kan ett stort antal antigen demaskeras med hjälp av olika enzymer där trypsin och pepsin och andra proteaser är de vanligaste. SIX1 & CK AE 1/3 SIX1, även kallat sine oculis homeobox homolog 1 tillhör en grupp proteiner som kallas transkriptionsfaktorer eftersom de kan binda till DNA och kontrollera aktiviteten hos gener. SIX1 kan reglera aktiviteten hos flera andra proteiner som är viktiga för normal cellutveckling genom att interagera med dessa. Proteininteraktionerna där SIX1 är inblandad i verkar spela 5

7 en essentiell roll för den embryonala utvecklingen av många vävnader och organ så som ligament, senor, hörselorgan njurar och extremiteter [9]. Efter fosterstadiet är uttrycket av SIX1 minimalt i normala mänskliga vävnader. Dock har högt uttryck visats främja tumörutveckling och SIX1 uttryck har bland annat rapporterats i bröstcancer och ovarialcancer [10]. En IHC-färgning för SIX1 ger en kärninfärgning. Cytokeratiner (CK) är en familj intermediära filament som hittas i cellers cytoplasma. En immunohistokemisk färgning av CK ger således en cytoplasmainfärgning. CK AE1/3 är en vanlig markör som används inom immunohistokemi. CK AE1/3 är en cocktail av två typer av monoklonala antikroppar, AE1och AE3. AE1 detekterar cytokeratiner 10,15,16 med hög molekylvikt samt 19 med låg molekylvikt. AE3 detekterar cytokeratiner 1-6 med hög molekylvikt samt 7 och 8 med låg molekylvikt. CK AE1 och CK AE3 ger därför kombinerat en reagent med ett brett spektrum för de flesta cytokeratiner i en viss cellpopulation [11]. CK AE1/3 som markör används sedan länge i rutindiagnostik för att underlätta identifikationen av normala och abnorma epitelceller. SYFTE Att med hjälp av immunohistokemi (IHC) undersöka om dubbelfärgning med SIX1 och CK AE1/3 kan användas som en specifik markör för att visualisera och detektera blastem i paraffinsnitt från WT. FRÅGESTÄLLNING Kan en immunohistokemisk färgning med SIX1 i kombination med CK AE1/3 användas som specifik markör för blastem i Wilms tumör i klinisk praxis? MATERIAL OCH METOD Paraffininbäddade tumörprover från 4 patienter med konstaterad WT och en paraffininbäddad fosternjure erhölls som positiv kontroll för SIX1 från Biobanken vid Labmedicin Skåne i Lund (biobankstillstånd LUBB-77) Som negativa kontrollvävnader för SIX1 och positiva för CK AE 1/3 användes material från esofagus och lever. Tabell 1. Vävnadsprover från Biobanken i Lund som användes. Patient Tumörtyp Ålder (år) Kön (M/K) Stadium Uppföljn.2013 WT-1 Mix typ 2 K 1 Tumörfri WT-2 Mix typ 3 M 1 Tumörfri WT-3 Blastemal typ 3 K 5 Lever med tumör WT-4 Blastemal typ 1 k 1 Tumörfri 6

8 IHC-färgningen skedde maskinellt i Ventana BenchMark Ultra från Ventana Medical Systems Inc. (Tuscon, USA). Polyklonal SIX1-antikropp av IgG-typ inköptes från Atlas Antibodies AB (Stockholm, Sverige) och förvarades fryst innan manuell titrering. CK AE1/3 inköptes från Ventana Medical Systems Inc.(Tucson, USA). En kontrollkloss paraffininbäddades med kontrollmaterial från lever, esofagus och fosternjure. Det snittades glas för färgning för SIX1, dubbelfärgning med SIX1 och CK AE 1/3 och hematoxylin-eosinfärgning. WT-fall och kontrollvävnad snittades med tjockleken 3 µm på FLEX-glas från Dako (Glostrup, Danmark). Snitten sträcktes i värmebad och torkades i värmeskåp 60 C i 50 minuter innan varje IHCfärgning. Alla SIX1-protokoll utfördes med förinställd standardiserad antikropp inkubering, 32 min i 36 C, med motfärgning av hematoxylin samt Blueing regent i 4 min vardera. Innan titrering av antikropp späddes SIX1 i Antibody Diluent från Ventana (Tucson, USA) till önskad koncentration. Hematoxylin-eosin färgades i Dako Coverstainer (Glostrup, Danmark). Glas scannades med Aperio ScanScope AT från LRI Instrument AB (Lund, Sverige). De färgade proverna bedömdes av studenten i samråd med patolog och biomedicinsk analytiker. På Klinisk Patologi i Lund används BenchMark Ultra från Ventana Medical Systems Inc.(Tuscon, USA) som en helautomatiserad metod för IHC-färgning. Det finns färdiga protokoll som har lagts in i systemet samt vissa standardiserade reagenser som används vid IHC-färgning. Glasen avparaffineras i apparaten och förbehandlingen kan modifieras med avseende på temperatur och vilken typ av antigen retrieval metod som skall användas. I BenchMark Ultra finns möjlighet till antigen retrieval med HIER metoden och enzymatisk metod. Temperatur kan ställas in och kombineras med två olika buffertar, Ultra Cell Conditioning 1 (CC1) och Ultra Cell Conditioning 2 (CC2) för HIER. CC1 är en trisbaserad buffert med lätt basiskt ph 8.5. I kombination med förhöjda temperaturer kan CC1 hydrolysera de kovalenta bindningar som uppstår till följd av formalinfixering. På så sätt kan proteinmolekyler renatuera och bli immunoreaktiva igen och möjliggöra antikropp-antigen inbindning [12]. CC2 är en citratbuffert med lätt surt ph 6. CC1 och CC2 finns alltid i maskinen. Vilken buffert som bäst lämpar sig vid en IHC-färgning beror på vilken typ av antikropp det gäller och laboratoriet har optimerat och kommit fram till vilken buffert som passar varje specifik antikropp bäst. För proteolytisk förbehandling i BenchMark Ultra finns Protease 1 som är enzym av serin proteas-familjen och klyver protein i vävnaden vilket tillåter primärantikropp att känna igen och binda in till målepitoper. Protease 1 är den starkaste proteolytiska förbehandlingen med 0.5 enheter/ml enzym. Visualisering och lokalisering av primärantikroppar sker med hjälp av principen indirekt immunodetektion. Principen går ut på att man använder en sekundär antikropp som är riktat mot den primära antikroppen som bundit in till vävnaden. Den sekundära antikroppen är konjugerad med ett enzym samt motsvarande substrat-kromogen system vilket ger en färgad fällning som kan detekteras i ljusmikroskop. UltraView Universal DAB Detection-kit är biotinfri och finns i färdiga dispensrar som används för att detektera primärantikroppar av kaninursprung och IgG och IgM från mus. En cocktail av enzymmärkta sekundärantikroppar används för att detektera den specifika primärantikroppen. Primär-sekundär antikropp komplexet visualiseras med hjälp av väteperoxid som substrat och 3,3 diaminobenzidine tetrahydroklorid (DAB) används som kromogen och producerar en brun fällning som kan detekteras i mikroskop (se Figur 1). UltraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection-kit (Red) finns i färdiga dispensrar och används för att detektera primärantikroppar av mus och kanin ursprung. Det är en cocktail 7

9 av antikroppar märkta med enzymet alkalisk fosfatas som lokaliserar primärantikroppen i vävnaden. Naphthol fungerar som substrat och visualiseras genom att använda Fast Red kromogen vilket ger en klar röd signal (se Figur 2). För kontrastfärgning används Hematoxylin I som är en modifierad Gills s hematoxylin eller Hematoxylin II som är en modifierad Mayer s hematoxylin som ger en mer distinkt kärninfärgning. Hematoxylin kombineras med Bluing reagent för att ge kontrastfärgningen en blå ton, och utan Bluing reagent blir får hematoxylinet en lila färg. Amplification Kit är ett kit som kan användas för att förstärka färgintensiteten av inbundna antikroppar. Det utnyttjar tunga och lätta IgG-kedjor hos kanin anti-mus och tunga kedjor av mus anti-kanin för att binda in till primärantikroppen och på så sätt öka antalet sekundärantikroppar som kan binda in till primärantikroppen. Därmed förstärks signalen och intensiteten hos färgningen. Figur 1. Principen för ultraview Universal DAB detection-kit. Bild lånad från Ventana. Figur 2. Principen för ultraview Universal Alkaline Phosptatase Red Detection-kit. Bild lånad från Ventana. Optimering av förbehandling för SIX1 I första testomgången användes 3 olika singel SIX1-protokoll med olika förbehandlingar, tider och temperaturer inställda och detekterade med DAB. I protokoll 1 och 2 användes HIER som antigen retrieval metod med CC1 respektive CC2. I protokoll 3 användes en proteolytisk metod med Protease-1 istället. Protokoll 4 utformades för testomgång 2 och då användes samma parametrar för förbehandling som i protokoll 1 men med en temperatur på 100 C. Tabell 2. Fyra singel SIX1- protokoll med olika förbehandlingar inställt och detekterade med DAB. Protokoll Förbehandling SIX1-konc Detektionskit 1 HIER, CC1, 95 C, 64 min 1/500 DAB 2 HIER, CC2, 91 C, 44 min 1/500 DAB 3 ENZYM, Protease-1, RT, 8 1/500 DAB min 4 HIER, CC1, 100 C, 64 min 1/500 DAB HIER: Heat Induced Epitope Retrieval. DAB: 3,3 -diaminobensidin-tertahydroklorid. RT: Rumstemperatur. SIX1-konc: SIX1-koncentration 8

10 Spädningsserie, SIX1 singelfärgning och singel CK AE 1/3 I testomgång 3 kördes singel SIX1 färgningar med samma förbehandling som protokoll 4 men med en ökande koncentration (se tabell 2). Parallellt färgades också en uppsättning glas för CK AE1/3 med DAB och CK AE1/3 med Red-kit samt ett singel SIX1-protokoll med Red. Tabell 3. Singel SIX1 färgningar med Red-kit där den varierade parametern är antikroppskoncentrationen för SIX1 och singel CK AE 1/3 med Red och DAB-kit i testomgång 3. Protokoll HIER, CC1, SIX1- Detektionskit Temperatur/Tid konc C, 64 min 1/400 DAB C, 64 min 1/300 DAB C, 64 min 1/200 DAB C, 64 min 1/100 DAB CK 1 - DAB CK 2 - RED RED C, 64 min 1/500 RED Dubbelfärgning med Red-kit för SIX1 Inför testomgång 4 gjordes tre protokoll för dubbelfärgning med DAB-kit och Red-kit för CK AE 1/3 respektive SIX1 med olika tider i förbehandlingen (se tabell 3). Tabell 4. I testomgång 4 gjordes dubbelfärgningar betecknat Double Stain (DS) med CK AE 1/3 och SIX1 med nedan angivna parametrar. Protokoll Förbehandling HIER, CC1, Temperatur/Tid CK Tid/Temp SIX1-konc. Ak-detektion SIX1 CK DS C, 64 min 8/RT 1/500 RED DAB DS C, 52 min 8/RT 1/500 RED DAB DS C, 36 min 8/RT 1/500 RED DAB RED: ultraview Alkaline Red Phosphatase Detection-kit. CK: Cytokeratin Dubbelfärgning med DAB-kit för SIX1 I testomgång 5 användes två olika tider för förbehandling och två koncentrationer där SIX1 detekterades med DAB-kit och CK AE 1/3 med Red-kit (se tabell 5). Tabell 5. I testomgång 5 utformades 4 protokoll med olika tider för förbehandling och SIX1 koncentrationer Protokoll Förbehandling HIER, CC1, Temperatur/Tid CK Tid/Temp AK-späd Ak-detektion SIX1 CK DS C, 52 min 8 1/500 DAB RED DS C, 64 min 8 1/500 DAB RED DS C, 52 min 8 1/300 DAB RED DS C, 64 min 8 1/300 DAB RED 9

11 Finjustering av slutgiltigt protokoll för SIX1 och CK AE 1/3 Vid testomgång den sista testomgången användes koncentrationen av SIX1 och förbehandling som vid protokoll DS 3 (se tabell 4) som utgångsprotokoll för två nya protokoll. DS 7 med endast amplifiering och DS 8 med amplifiering och en minskning av inkuberingstiden för CK AE 1/3 till 4 minuter. I protokoll DS 11 användes Hematoxylin II istället för Hematoxylin I. Tabell6. Fem olika protokoll med olika parametrar med avseende på tid för slutgiltig justering av ett dubbelfärgningsprotokoll Protokoll Förbehandling HIER, CC1, Temperatur/Tid + justering Tid CK AK-späd Akdetektion SIX1 CK DS 8 HIER, CC1, 100 C, 52 min + 8 1/500 DAB RED AMP DS 9 HIER, CC1, 100 C, 52 min + 4 1/500 DAB RED AMP DS 10 HIER, CC1, 100 C, 52 min 8 1/400 DAB RED DS 11 HIER, CC1, 95 C, 52 min 8 1/400 DAB RED DS 12 HIER, CC1, 100 C, 52 min+htx II 8 1/400 DAB RED AMP: Amplification Kit. HTX II: Hematoxylin II. ETISK BEDÖMNING Proverna kommer från patienter under 18 år vars föräldrar har gett ett skriftligt medgivande till att vävnadsprover får sparas i biobanken och användas för framtida forskning. Det används inga remisser med personuppgifter. Det finns PAD-nummer på klossarna, som inte är av intresse i studien och klossarna har därför avidentifieras. Studien ingår i en större studie som godkänts i en regional etikprövningsnämnd (Etikgodkännande L och L289-11). RESULTAT Resultaten av olika testomgångar för optimering av dubbelfärgning med SIX1 och CK AE 1/3 bedömdes och utvärderades av patolog och en mall med parametrarna andel målceller, intensitet och ospecifik bakgrund bedömdes. Fallen graderades enligt M= andel målceller i %, I= Intensitet av de infärgade målcellerna mellan 0-3 där 0 är negativt och 3 starkast och B= bakgrundsinfärgning där 0 är ingen bakgrund och 3 är mycket bakgrund. Optimering av förbehandling för SIX1 Utifrån resultaten av de olika protokollen och mikroskoperingsutvärderingen så var det enligt patologens bedömning protokoll 1 med CC1-buffert, 95 ºC, 64 minuter, 1/500-spädning mest lämplig med avseende på andel målceller, bakgrund och intensitet av infärgningen. Protokoll 1 gav högre andel målceller och starkare intensitet i WT3 och högre andel målceller i WT 4 10

12 samt i kontrollen. Intensiteten för WT 1 i protokoll 2 blev en aning starkare än i protokoll 1. Och enligt läkarens bedömning kan det ses i tabell 6 att protokoll 4 gav bättre infärgningsresultat jämfört med protokoll 1 i WT 1 och kontroll med avseende på andel målceller och intensitet och bakgrund. I WT 4 ses en ökning i andel målceller samt starkare intensitet jämfört med protokoll 1. Förbehandling med CC1, 100 C i 64 minuter är alltså bäst lämpad för SIX1 singelinfärgning med DAB. Protokoll 3 med enzymatisk förbehandling för antigen retrieval fungerade inte alls för SIX1 i något av fallen och enzymatisk behandling uteslöts därför som förbehandling för SIX1 (se figur 3). CC1 fungerade som lämpligare buffert än CC2 med avseende på andel målceller och intensitet i samtliga prover samt i kontrollen (Undantag WT 2 som inte innehöll några blastemala celler alls). Bakgrundsinfärgningen visade större skillnad mellan CC1 och CC2 då de olika fallen jämfördes. Tabell 7. Resultat av mikroskoperingsutvärdering av testomgång 1 och 2. Protokoll 4 med förbehandling 100 C med CC1 i 64 minuter gav bäst infärgningsresultat. WT 1 WT 2 WT 3 WT 4 Kontroll Protokoll M I B M I B M I B M I B M I B / /1 11

13 A B C D Figur 3. Färgningsresultaten för omgång 1 & 2 för WT 3. Bild A visar resultatet av färgningsprotokoll 1 med förbehandling med CC1. Bild B visar resultat med CC2 och bild C visar förbehandling med proteolytisk förbehandling där man kan se att inga målceller är infärgade. Bild D visar den justerade temperaturen med CC1 för protokoll 4 fungerar som bästa förbehandling för singel SIX1-färgning. Spädningsserie, SIX1 singelfärgning med Red och CK AE 1/3. Tabell 7 för mikroskoperingsutvärdering av testomgång 3 visar att med stigande koncentration av SIX1 ligger andelen målceller på 100 % utom i fall 4 samt en ökad intensitet av dessa men också en kraftig ökning av bakgrundinfärgningen i WT 1, WT 3 samt i kontrollen (se figur 4). I WT 4 ligger bakgrundsinfärgningen på samma nivå genom alla koncentrationer. Mellan protokoll 4 och 5 med koncentrationen 1/500 respektive 1/400 ses ingen större förändring. Tabell 8. Resultat av mikroskoperingsutvärdering för testomgång 3 med spädningsserie. Efter DS 5 ökar bakgrundskoncentrationen kraftigt. SIX1 kan användas tillsammans med Red-kit i en singelfärgning. WT 1 WT 2 WT 3 WT 4 Kontroll Protokoll M I B M I B M I B M I B M I B RED

14 A B C Figur 4. Bilderna visar resultatet av spädningsserien. Bild A visar SIX1 koncentrationen 1/400. Bild B visar 1/300, C 1/200 och bild D 1/100. I bild B-D ses en kraftig ökning av intensitet och bakgrundinfärgning. Pilarna illustrerar den ospecifika bakgrundsinfärgningen D I testomgång 3 färgades även en singel CK AE 1/3 med Red-kit och DAB-kit för att se vilket som hade passat CK AE 1/3 vid en dubbelfärgning med SIX1. En jämförelse mellan de två färgningarna visade att infärgning med CK AE 1/3 med Red ger en kraftigare infärgning med avseende på intensitet av målcellerna. Det har också en tendens att läcka ut och ge en rödaktig/rosa bakgrundsinfärgning (se figur 5). Ur tabell 8 kan utläsas att singelfärgning med Red för SIX1 ger en tillfredställande infärgning med rätt andel målceller och rätt intensitet med låg bakgrund. 13

15 Figur 5. En jämförelse mellan infärgning av CK AE 1/3 med Red - kit (till höger) och CK AE 1/3 med DAB-kit (till vänster). Vid pilen kan ses att Red-kit ger en kraftigare infärgning av målceller i rött samt att bakgrunden får en rosa ton. Med DAB-kit fås en mycket renare bakgrund. Dubbelfärgning med Red-kit för SIX1 I testomgång 4 användes resultat ur föregående testomgång för att göra protokoll för dubbelfärgningar med SIX och CK AE 1/3. För CK AE 1/3 gällde 100 % målceller, 3 i intensitet och 1 i bakgrund. SIX1 var inte detekterbart och den röda färgen var försvunnen (se figur 6). Dubbelfärgningen kunde därför inte bedömas vidare i denna form och vi gick därför vidare med att detektera SIX1 med DAB. A B Figur 6. Bild A visar resultatet för WT 3 och bild B visar resultatet för fosternjure i protokoll DS 3 där SIX1 användes i en dubbelfärgning tillsammans med Red-kit och CK AE 1/3 med DAB. CK AE 1/3 är tydligt framträdande (bruna celler) medan SIX1 har tappat sin färg (svart pil) i bild A. 14

16 Dubbelfärgning med DAB-kit för SIX1 Tabell 9. Resultat av mikroskoperingsutvärdering för testomgång 5. Ur tabellen kan ses att SIX1 ger hög andel infärgade målceller, hög ingensitet och relativt låg bakgrundsinfärgning. Förbehandling med 52 C i DS 4 och DS 6 minuter gav bäst resultat WT 1 WT 2 WT 3 WT 4 Kontroll Protokoll M I B M I B M I B M I B M I B DS , DS DS , DS Ur mikroskoperingsprotokollet tabell 8 kan ses att DAB fungerade bra för SIX1. För CK AE 1/3 med Red-kit förändrades inte resultaten nämnvärt och vid en dubbelfärgning bedömdes SIX1 därför fungera bäst med DAB och CK AE 1/3 med Red-kit. Utifrån de olika parametrarna för testprotokollen kan det ses att protokoll DS 4 och DS 6 ger fler andel målceller i samtliga fall jämfört med DS 5 och DS 7. Förbehandling med CC1, 100 C, 52 fungerar bättre än förbehandling med 64 minuter för dubbelfärgning med SIX1 DAB och CK AE 1/3 Red. I dubbelfärgningar med CK AE 1/3 bör alltså SIX1 användas tillsammans med DAB. Andel bakgrund är en aning högre för kontrollen i DS 6 jämfört med DS 4 (se figur 7) samt i WT 1. A Figur 7. Bild A visar resultatet av protokoll DS 6 med 1/300 SIX1 koncentration. Jämfört med bild B som visar DS 4 med 1/500 koncentration. Vid den svarta pilen på bild A kan ses att DS 6 har en aning mer bakgrundsinfärgning än DS 4. Målceller för CKAE 1/3 kan ses som röd infärgning av celler. B Finjustering av slutgiltigt protokoll för dubbelfärgning med SIX1 och CK AE 1/3 Mellan protokoll 8 och 9 var det inte så stor skillnad i intensitet för SIX1mellan de olika fallen. DS 9 gav högre andel målceller i WT 1 och WT 4 än DS 8. WT 3 och WT däremot gav mindre andel målceller i DS 9 jämfört med DS 8. I kontrollen sågs ingen skillnad i andel målceller, däremot en ökning i intensitet och bakgrundsinfärgning. För CK AE 1/3 gäller genomgående 100 % i andel målceller, 3 i intensitet och 1 i bakgrund. 15

17 Amplifiering som användes i protokoll DS 8 och DS 9 gav immiga och utsmetade målceller för SIX1. Cellmorfologin var odefinierad (se figur 8). I DS 10 användes spädningskoncentrationen 1/400 och förbehandling100 C, CC1 i 52 minuter vilket gav ett resultat med hög andel målceller, stark intensitet och låg bakgrundsinfärgning för samtliga fall samt kontrollen. Protokoll DS 10 kommer därför vara vårt slutgiltiga protokoll för dubbelfärgning med SIX1 och CK AE 1/3 (se figur 9). Tabell 10. Testomgångar med amplifiering och DS 10 som blev det slutgiltiga protokollet för dubbelfärgning med SIX1 och CK AE 1/3. WT 1 WT 3 WT 4 Kontroll Protokoll M I B M I B M I B M I B DS DS DS A B C D Figur 8. Resultatet av finjustering av slutgiltiga SIX1 och CKAE 1/3 protokoll. Bild A visar Amplification Kit för SIX1 1/500 med ultraview Universal DAB-kit för protokoll DS 8. Bild B visar protokoll DS 9 med Amplification Kit och tiden för CK till 4 minuter. Det kan ses att bild B ger lite starkare brun färg jämfört med bild A, men sämre celldefinering. Bild C visar resultatet av temperaturen för pre- treatment till 95 C och bild D visar resultatet av Hematoxylin II, vilke t gav gråaktig infärgning av celler och för stark blå motfärgning. 16

18 A B C D Figur 8. En jämförelse mellan hematoxylin - eosin färgning som används vid rutinfärgning och det slutgiltiga protokollet för immunohistokemisk färgning med SIX1 och CKAE 1/3 på Wilms tumör. Bild A visar hematoxylin-eosin färgning för WT 3 där svarta pilen markerar möjliga blastemala celler. Bild B visar dubbelfärgning med SIX1 och CKAE 1/3 för WT 3. De två nedre bilderna visar resultatet för hematoxylin-eosin respektive SIX1 och CKAE 1/3 för WT 1. De blastemala cellerna i brunt kan tydligt urskiljas från övriga celltyper i den immunohistokemiska färgningen. DISKUSSION SIX1 användes inte på laboratoriet sedan innan. Detta innebär att den nya antikroppen måste valideras och optimeras innan den kan användas kliniskt. Det första steget är då att hitta lämplig förbehandling och antigen retrieval för varje specifik antikropp. I vårt fall använde vi oss av CC1 och CC2 för HIER och Protease 1 för proteolytisk förbehandling. Bäst resultat erhölls med CC1 som har en ph på 8,5. I det medföljande databladet för SIX1 från Atlas Antibodies AB kan läsas att rekommenderad förbehandling för SIX1 är HIER med buffert med ph 6. I vårt försök fick vi bäst resultat med CC1 som har ett ph på 8,5, och inte med CC2 som har ett ph på 6. Detta visar vikten av hur viktigt det är att varje enskilt laboratorium själv optimerar varje ny antikropp och för att bestämma vilken förbehandling som passar bäst, oavsett rekommendationer som anges i databladet. Protokoll 2 med CC2 hade dock ändå 17

19 kunnat fungera som ett godtagbart protokoll för singelfärgning med SIX1 med DAB-kit eftersom det var detekterbart för de blastemala cellerna, om än i mindre andel målceller än med CC1. Den proteolytiska förbehandlingen med Protease 1 fungerade inte som antigen retrieval metod för SIX1 vilket kan bero på två faktorer; den är inte tillräckligt stark för att demaskera målepitop eller att den är för stark och klyver sönder målepitopen vilket gör att den förstörs [13]. Vi använde oss av Protease 1 och man hade möjligen kunnat prova Protease 2 eller 3 som är en aning svagare för att se hur resultatet blev, men eftersom vi inte fick några detekterbara celler med den proteolytiska behandlingen och tillfredställande resultat utan Protease så uteslöts den som lämplig förbehandling. I protokoll 4 höjdes temperaturen till 100 C för att se om andelen målceller och intensiteten kunde ökas jämfört med protokoll 1 där temperaturen var 95 C. Högre temperaturer vid förbehandlingen gör att fler kovalenta bindningar bryts upp och fler epitop blir tillgängliga [14] vilket vi kan se i våra resultat. Efter att ha hittat lämplig förbehandlingsmetod undersöktes ifall en annan koncentration än utgångskoncentrationen 1/500 skulle ge bättre infärgningsresultat och därför gjordes en spädningsserie. Mellan 1/500 och 1/400 syntes ingen större skillnad i infärgningsresultatet medan koncentrationer över 1/400 gav kraftigare bakgrundsinfärgning vilket undersökande läkare tyckte var olämpligt. Högre koncentrationer innebär alltså i de flesta fall också ökad bakgrundsinfärgning. Därmed är SIX1 koncentrationer högre än 1/400 inte att föredra vid en singel SIX1- färgning eftersom bakgrunden blir för kraftig vilket kan leda till missbedömningar. CK AE 1/3 färgades både med DAB-kit och med Red-kit för att undersöka vilken färgning som hade varit lämplig att använda vid en dubbelfärgning med SIX1. Eftersom ultraview Universal Red-kit gärna läcker ut och ger en rosa infärgning av bakgrunden och en väldigt intensiv infärgning av målceller så hade det varit fördelaktigt att vid en dubbelfärgning använda DAB tillsammans med CK AE 1/3, vilket ger en mycket renare bakgrund. Därför utformades ett protokoll för singel SIX1 färgning med Red-kit för att undersöka om SIX1 kan användas tillsammans med Red-kit vid en eventuell dubbelfärgning. Resultatet var helt godtagbart även om man tappade andel målceller i vissa fall men var enligt bedömande läkare inget större problem. Därför utformades de första dubbelfärgningsprotokollen så att SIX1 kördes med Red och CK AE 1/3 med DAB. Trots att SIX1 fungerade utmärkt med Red-kit i en singelfärgning var det knappt detekterbart i dubbelfärgning med CK AE 1/3. Ett bra resultat i en singelfärgning betyder nödvändigtvis inte att det erhålls samma goda resultat i en dubbelfärgning. Vid en dubbelfärgning behövs ta hänsyn till fler faktorer som kan påverka IHC-färgningen. SIX1 optimerades så att det var detekterbart både med DAB-kit och med Red-kit, men tillsammans med CK AE 1/3 blev det inget optimalt färgningsresultat. CK AE 1/3 används redan på laboratoriet och var optimerat. När man kör en dubbelfärgning med två olika antikroppar är det viktigt att ta hänsyn till de olika antikropparnas IHC-parametrar, det vill säga förbehandling, tid, temperatur samt inkuberingstid för att få ett så bra resultat av båda antikropparna som möjligt. SIX1 optimerades till viss del i de första testomgångarna men behövde i detta arbete fungera parallellt med CK AE 1/3. En dubbelfärgning blir därför mycket svårare att optimera. SIX1 har längre tid för förbehandling än CK AE 1/3. Högre temperaturer och tider vid förbehandling i en dubbelfärgning kan leda till att CK AE 1/3 blir för kraftigt infärgat. I dubbelfärgningen med SIX1-Red och CK AE 1/3 användes tre olika tider vid förbehandling, 64, 52 och 36 minuter. Trots detta erhölls inga detekterbara celler för SIX1 med Red i en dubbelfärgning men en väldigt intensiv CK AE 1/3 färgning med 18

20 maximala målceller och intensitet. I nästa dubbelfärgning kördes SIX1 därför tillsammans med DAB och CK AE 1/3 tillsammans med Red-kit. Även om Red-kitet gav viss bakgrundsinfärgning av CK AE 1/3 så kunde det bortses av undersökande läkare. Dubbelfärgningen där SIX1 detekterades med DAB och CK AE 1/3 med Red gav goda resultat både för SIX1 och för CK AE 1/3. Dubbelfärgningen kördes på två olika tider för förbehandling. Bättre resultat erhölls vid 52 minuter än vid 64 minuter. Koncentrationen 1/300 kördes också eftersom vi ville intensifiera målcellerna för SIX1 ytterligare i dubbelfärgningen, eftersom dubbelfärgning med SIX1-DAB var en aning svagare än SIX1 singelfärgning med DAB. 1/300 gav intensivare målceller men också mer bakgrundsinfärgning, medan 1/500 gav svagare målceller för SIX1 men mindre bakgrundsinfärgning. Förbehandling och tid för dubbelfärgning med SIX1 och CK AE 1/3 bestämdes alltså till CC1, 100 C i 52 minuter. Det som återstod var sedan en finjustering för att få ett så optimalt slutgiltigt protokoll för dubbelfärgningen som möjligt. För att intensifiera målcellerna för SIX1 ändrades olika parametrar som möjligen skulle kunna påverka infärgningen av SIX1. Amplification Kit användes för att ytterligare intensifiera målcellerna för SIX1 så att dessa skulle bli mer framträdande. Cellerna blev intensifierade med avseende på färg, det bruna blev starkare men cellmorfologin blev odefinierad och det var svårt för bedömande läkare att kunna skilja varje cell åt. Detta kan bero på att Amplification Kit medför att fler antikroppar kan bindas in och detekteras och att det möjligen kan ha bundit in för många antikroppar som per cell som ledde utsmetad cellmorfologi. Inkuberingstiden för CK AE 1/3 sattes ner till 4 minuter istället för 8 minuter. Detta eftersom vi ville dämpa den starka röda infärgningen av CK AE 1/3 så att SIX1 som blir brunt skall bli mer framträdande. Detta gav ingen skillnad med avseende på CK AE 1/3 men gav än mer utsmetade celler för SIX1. Även koncentrationen av SIX1 sattes ner till 1/500 för att kompensera vid en eventuell intensifiering av målceller för SIX1. Ytterligare en justering gjordes av dubbelfärgningen, och samma protokoll som DS4-DS5 (se tabell 4) kördes fast med en SIX1 koncentration på 1/400 för att se om det kunde dra upp intensiteten och andel målceller mer än vad 1/500 gjorde men inte överstiga mer bakgrundsinfärgning än 1/300. Protokoll DS 11 och DS 12 justerades med samma mål, att försöka intensifiera målceller för SIX1 men hålla nere på bakgrundsinfärgningen. Hematoxylin II användes för att se om en annan kontrastfärgning kan få SIX1 cellerna mer framträdande mot bakgrunden. Resultatet blev snarare tvärtom-six1 cellerna som skulle ha blivit bruna fick istället en grådaskig färg i och en sämre kontrast mot bakgrunden. Detta kan bero på att Hematoxylin II sätter sig på cellkärnan, vilket SIX1 också gör, vilket kan ha lett till att hematoxylinet täcker över dem infärgade målcellerna där SIX1 bundit in och på så sätt gjort att den bruna färgen får en annan ton. Hematoxylin II bör alltså inte användas tillsammans med SIX1. Vid IHC färgning strävar man hela tiden efter att få minimal ospecifik bakgrund och maximalt andel målceller samt intensitet. Ett idealt resultat hade därför varit 100 % i andel målceller, 3 i intensitet och 0 i bakgrund och i läkarens bedömning av de olika fallen gjordes hela tiden en avvägning mellan andel målceller och intensitet kontra bakgrundsinfärgning. I vårt slutgiltiga protokoll kan ses att i WT 1 och WT 3 ändå ses en viss bakgrund. Detta kan enligt den bedömande läkaren bero på att vissa omogna celler ändå till viss del uttrycker SIX1. Det 19

21 kunde även ses i nästan alla fall att stromaceller oftast blir fokalt infärgade, om än svagt för SIX1. Detta fenomen kom vi aldrig ifrån. Den bedömande läkaren ansåg inte detta orsaka några större problem vid en klinisk bedömning eftersom stromaceller är karakteristiskt arrangerade samt att cellmorfologin skiljer sig tydligt från blastem. De olika patientfaller skiljer sig åt med avseende på andel målceller som blir infärgade vid varje protokoll. Detta visar på att de olika individernas tumörer skiljer sig från varandra och varierar i både celltyper men också i differentieringsgrad av de olika celltyperna, i synnerhet blastem. Fall WT 2 blev vid hematoxylin-eosin färgning bedömt som mixed type blastemal av undersökande läkare men gav trots detta inget utslag alls vid infärgning med SIX1, varken vid en singelfärgning eller vid dubbelfärgning. Detta kan bero på att den blastemala cellkomponenten helt försvunnit under cellgiftsbehandlingen som föregick operation och den histopatologiska undersökningen.tidigare studier har visat att en liten andel Wilms tumörer kan uppvisa blastemliknande områden som är både SIX1 och cytokeratin positiva [6]. Detta kunde ses i vårt försök i fall WT 4 där områden som av läkaren var bedömna som blastem vid en hematoxylin-eosin färgning uppvisade vid den immunohistokemiska färgningen dubbel positivitet för både SIX1 och CK AE 1/3. Hur stor eller vilken betydelse denna typ av celler med dubbel differentiering har för prognosen av Wilms tumör återstår att undersöka vidare. Trots att vi erhöll ett resultat som läkaren bedömde hade kunnat fungera utmärkt kliniskt hade dubbelfärgningen kunnat optimeras ytterligare. Det finns flera olika faktorer som kan påverka en immunohistokemisk färgning, och för att få den helt optimal kan många parametrar justeras, allt från att byta leverantör av antikropp till att fortsätta experimentera med förbehandlingar, tider och temperaturer och prova andra detektionskit med andra kromogen för att få starkare intensitet av målceller och minimal bakgrundsinfärgning. Trots det kan resultatet ändå skilja sig vilket kan ses i våra försök, eftersom varje tumör varierar med olika celltyper med olika grad av differentiering och uttryck av den specifika antikroppen vilket likväl kan påverka resultatet av färgningen. Specificiteten för SIX1 är relativt hög, cirka % [Sehic et al., Am J Clin Pathol, in press 2014] och SIX1 är alltså inte 100 % tillförlitlig som blastemmarkör. Vid en mikroskopisk bedömning finns risken att undersökande läkare över-eller underskattar andelen blastemala celler om bedömningen endast sker på en immunohistokemisk parameter. Därför bör den immunohistokemiska undersökningen fungera som ett viktigt komplement till den histokemiska undersökningen med hematoxylin-eosin och inte som en ersättningsmetod. Resultaten av båda undersökningarna skall granskas och sammanvägas av undersökande läkare och förhoppningsvis vara ett verktyg för att enklare kunna bedöma Wilms tumörers histologiska struktur och cellsammansättning. UNDERSÖKNINGENS FRAMTIDA VÄRDE Verktyg för korrekt och standardiserad klassificering av WT för vidare behandling av barn är av stor vikt. IHC-färgningar är väldigt specifika och möjligheten till IHC-färgningar kan öka sannolikheten med rätt kemoterapibehandling för patienter om en markör specifik för just 20

22 blastem finns att tillgå och kan användas kliniskt. Då kan en behandling skräddarsys efter varje enskild patients tumör. 21

23 REFERENSER 1. Barncancerfonden (2013) Fakta om Wilms Tumör ( ) 2. Wåhlin N, Christoffersson R, Pal N, Kullendorf C M (2006) Wilms tumör hos barnavsevärt förbättrad överlevnad. Läkartidningen nr 18, Vujanic G M, Sandstedt B (2010) The Pathology of Wilms tumour (nephroblastoma)-the International Society of paediatric oncology approach. J clin. Pathology, 63, Rivera M N, Haber D A (2005) Connecting tumorigenesis & organ development in the kidney, Nature Reviews Cancer, 5, Bhatnagar S, (2009) Management of Wilms tumor: NWTS vs SIOP. J. Indian Ass. Pediatric Surgery, 14, Sehic D, Karlsson J, Sandstedt B, Gisselsson D (2012) Six1 protein Expression Selectively Identifies Blastemal Elements in Wilms Tumor. Pediatric Blood & Cancer 2012, 59, Taylor R T, Shi S-R, Barr N J, Wu N (2006) Techniques of Immunohistochemistry: Principles, Pitfalls and Standardization. I: Dabbs, D J (Eds) Diagnostic Immunohistochemistry (2nd edition). Philadelphia, PA: Churchill Livingston, s Vyberg M, (2005) Anvent Immunhistokemi (utgåva 6), Bioanalytikeruddannelsen i København 9. Genetics Home Reference (2008) SIX1 > ( ) 10. Imam JS, Buddavarapu K, Lee-Chang JS, Ganapathy S, Camosy C, Chen Y, Rao MK (2010) MicroRNA-185 suppresses tumor growth and progression by targeting the Six1 oncogene in human cancers. Oncogene, 29, ProPath, Miller, Rodney. T (2003) The Focus Immunohistochemistry Cytokeratin AE1/AE3 > ( ) 12. Kumar G L, Rudbeck L, DAKO (2009) Demasking of antigenes. > ( ) 22

24 13. R&D Systems (2013) Antigen Retrieval Methods > < ( ) 14. IHC World, Myers J. (2013) Overview of Heat-Induced Epitope Retrieval (HIER) Techniques and Devices > ( ) 23