Grundläggande mikrobiologi mars

Transkript

1 Bioresursdagar 2011 Kursdagar för gymnasielärare i Grundläggande mikrobiologi mars Kursdagarna i grundläggande mikrobiologi knyter an till olika aspekter på mikroorganismer med koppling till ämnesplanen för biologi, främst gäller det Biologi 2, men även delar av kurserna Biologi 1 och Bioteknik. Genom att arbeta med mikroorganismer berörs områden som cellbiologi, evolutionen av organismvärlden, infektionssjukdomar och antibiotika, samt tillämpad mikrobiologi inom exempelvis livsmedelsoch läkemedelsindustri och jordbruk. I Biologi 2 anges dessutom att följande praktiska moment ska ingå i kursen: Enklare molekylärbiologiska metoder. Sterilteknik och odling av bakterier. Fokus under kursdagarna är praktiskt arbete med mikroorganismer och säkerhetsfrågor. Kursdagarna behandlar grundläggande mikrobiologiska tekniker som sterilteknik, beredning av medier med gjutning av agarplattor, renodling av mikroorganismer, färgning, spädningsserier, odling av mikroorganismer och förvaring av mikroorganismer. Vi kommer att testa enkla försök med mikroorganismer som lämpar sig för elever att genomföra, se nedan. Mikroorganismer runt omkring oss Test av antibakteriella ämnen Ett klurigt försök med morötter och bakterier Bakterier som lampa. Bioluminiscenta bakterier från saltvattensfisk. Bakterier i livsmedel. Jäsningsprocessen vid yoghurtstillverkning. Färgning av yoghurtbakterier. Antibiotika från svampmycel i förna Mikrosvampar från naturmiljöer Försök med arkéer (odling av Halobacterium, antibiotikatest, DNA från Halobacterium) För vissa försök kan det vara svårt att se resultatet redan efter en dag och dessa försök kommer därför att demonstreras och resultaten diskuteras. Några försök kan eventuellt tas hem för att läsas av senare. Plats: Evolutionsbiologiskt centrum, Norbyvägen 14, Lärosal 2 Tid: Må 18 mars kl 8:30 16:30 Ti 19 mars Information: se info under länken Kurser och kalendarium. Vid avanmälan efter 8 mars debiteras 300 kr. Kursavgift: 1100 kronor exklusive moms (inkluderar två luncher, fika och dokumentation) Information om kursdagarna: Kerstin Westberg, info@bioresurs.uu.se 1

2 Preliminärt och översiktligt program Tiderna utom för start och avslutning är ungefärliga och avpassas efter aktiviterna. Må 18 mars :30 Morgonfika 9:00 Introduktion: Mikrobiologiska arbetsmetoder och säkerhetsfrågor. Presentation av de försök som kommer att genomföras under kursdagarna 10:30 Gjutning av agarplattor. Start med mikrobiologiförsöken 11:30 Lunch 12:30 Fortsättning med mikrobiologiförsöken Fika vid lämplig tidpunkt 16:30 Dagens aktiviteter avslutas Ti 19 mars :30 Återkoppling till gårdagens aktiviteter. Avläsning av försök + diskussion kring resultat. Fika 10:30 Föreläsning om bland annat probiotika av Hans Jonsson, universitetslektor vid Institutionen för molekylära vetenskaper, SLU 11:30 Lunch 12:30 Presentation av ytterligare några mikrobiologiförsök. med Planering i mindre grupper av undervisning kring mikroorganismer. Ta gärna egna tips och goda idéer: Hur integreras mikrobiologi i undervisningen? Hur kan man koppla labbarna vi har gjort till undervisning inom nedanstående områden? Redovisning gruppvis. evolution systematik ekologi cellbiologi genetik/genteknik medicin livsmedelsproduktion Återkoppling till säkerhetsfrågor och utrustning. Utvärdering av kursdagarna. Fika vid lämplig tidpunkt 16:00 Slut för dagen 2

3 Grundläggande steril- och odlingsteknik, introduktion Mikrobiologiskt arbete och säkerhet Materiel vid arbete med mikroorganismer Att arbeta sterilt Bakteriestammar Grundläggande tekniker Beredning av medier och gjutning av plattor Färgning av celler och ev. mätning av cellstorlek Fermentation och tillväxt Renodling Transformation Spädningsserie Laborationer Må fm (10:00 11:30) 1. Beredning av medier 2. Färgning av bakterier och ev. mätning av cellstorlek Må em ( :30) 3. Gjutning av plattor 4. Transformation av bakterier med kit från Bio-Rad (pglu Bacterial Transformation Kit). Spädning av bakterier. Demonstration av renodling av bakterier. 5. Renodling av bakterier och ev. utstryk av stammar att ta hem 6. Mikroorganismer runt omkring oss 7. Test av antibakteriella ämnen Må em ( :30) 8. Bakteriell illumination 9. Halobacterium (utseende, antibiotikatest, extraktion av DNA) 10. Antibiotika från svampmycel i förna Ti 8:30 16:00 Avläsning av resultat + diskussion, erfarenhetsutbyte och planering Demonstration: 11. Jordbakterier på morötter 12. Odling av svamp och mikrosvampar i barr 3

4 4

5 5

6 6

7 7

8 8

9 Transformation av bakterier pglu Bacterial Transformation Kit I försöket transformeras E.coli med plasmiden pglu. Bakterierna kan därmed uttrycka de specifika egenskaper som plasmiden ger. Plasmider kan konstrueras så att de innehåller gener från helt andra organismer, som människor, djur eller växter. Transformation med plasmider är en naturlig funktion hos bakterier för att sprida egenskaper som har ett överlevnadsvärde exempelvis antibiotikaresistens. Vi människor kan utnyttja denna naturliga process inom bioteknik, t.ex. för att föra in nya egenskaper i grödor. pglu innehåller en gen som kodar för Green Fluorescent Protein (GFP). Genen ger bakterierna förmåga att fluorescera i UV-ljus och kommer ursprungligen från den bioluminiscenta maneten Aequorea victoria. Plasmiden innehåller dessutom ett speciellt system för reglering av genen GFP som innebär att den slås på i transformerade celler när arabinos ingår i mediet. Plasmiden innehåller dessutom en gen för ampicillinresistens. Skälet är att endast en liten andel celler transformeras och för att selektera fram dessa celler används ett medium med tillsatt ampicillin. Det innebär att endast celler som har tagit upp plasmider överlever. I svensk skola krävs en anmälan till Arbetsmiljöverket för att få använda ampicillin eller andra typer av antibiotika som används i medicinskt syfte och kan medföra att problemen med att antibiotikaresistens ökar. I följande beskrivning revideras därför det ursprungliga kittet så att ampicillin inte behöver användas. Fördelaktigt är att i den förändrade versionen av laborationen ges möjlighet att träna på grundläggande mikrobiologiska tekniker som att göra spädningsserie och renutstryk. Se även handledningen från BioRad. Säkerhet Transformerade celler (plattor, lösningar) autoklaveras eller skickas som riskavfall. Material som kontaminerats med sådana celler steriliseras på lämpligt sätt. Ampicillin används inte i laborationen. Försiktighet iakttas vid användning av UV-lampa, använd skyddsglasögon. 9

10 Material E.coli HB101 K-12, lyophilized Transformationslösning, steril (50 mm CaCl2,pH 6,1) Plasmid (pglu), lyophilized 20 µg (250 µl transformationslösning eller vatten tillsätts röret.) Förvaras i kylskåp. Plattor med LB och L(+)arabinos (den andra stereoisomeren fungerar inte) LB nutrient broth, steril Eppendorfrör med steril 0,9% NaCl, 0,9 ml per rör till spädningsserie (3 rör behövs, eventuellt 5 rör om man vill göra en beräkning av andelen transformerade celler) Automatpipetter och sterila pipettspetsar (1 000 och 100 µl). Alternativt sterila plastpipetter från kittet. Platinöser, sterila, 10 µl eller ympnålar som steriliseras i gaslåga 4 (eventuellt 6) eppendorfrör Skumplasthållare för eppendorfrör UV-lampa Inkubator, 37OC Vattenbad, 42 OC Vortexapparat Isbad med isblandat vatten Märkpenna Skyddsglasögon och skyddskläder Metodbeskrivning I det följande används endast plattor med arabinos. Om man vill visa att arabinos krävs för att GFP-genen ska slås på och bakterierna fluorescera kan man använda plattor med enbart LB-medium. Beredning av LB-plattor med L(+)arabinos: 100 ml LB-medium räcker till 5 stora (90 mm) eller 8 små (60 mm) petriskålar. LB-medium finns att köpa färdigt som pulver, men kan också blandas från separata komponenter. Skala upp mängden medium beroende på hur många plattor som behövs. Till 100 ml LB-medium krävs 600 mg L(+)arabinos. Lös först upp L(+)arabinos i 3 ml transformationslösning från kittet eller i vatten. Blanda därefter med autoklaverat, flytande LB-medium men observera att mediet inte får vara varmare än 50 o C eftersom ampicillinet i så fall förstörs. Medier med agar stelnar vid 42 o C. Uppodling av E.coli Tillsätt 250 µl transformationslösning eller sterilt vatten till röret med E.coli HB101 K-12 (lyophilized). Låt stå i 5 minuter, skaka om röret och gör därefter ett renutstryk på LBplattor. Detta ger plattor med ganska få kolonier, se nedan för att få en tätare suspension. (Bakteriesuspensionen kan förvaras i kylskåp i max 3 dagar.) För tätare bakteriesuspension: OBS! Var mycket noga med att arbeta sterilt för att inte riskera att kontaminera. Tillsätt 250 µl LB nutrient broth (utan agar) till röret med E.coli HB101 K-12. Skaka om och låt stå i värmeskåp i 37 o C i 8-24 timmar. Detta görs timmar innan genomförandet av laborationen. Plattorna med E.coli ska användas inom timmar för bäst resultat. 10

11 Transformation 1. Märk ett eppendorfrör med +pglu och gruppens namn. Placera röret i skumplasthållaren. 2. Använd en steril pipettspets och överför 250 µl transformationslösning (CaCl 2 ) till röret. Placera röret (i hållaren) i ett isbad. Se till att röret når ner i det isblandade vattnet och kyls av ordentligt. 3. Använd en steril platinös och överför 2-4 bakteriekolonier från agarplattan till röret med transformation solution. (Välj enstaka kolonier som är cirka 1 mm i diameter och ta inte bakterier som växer som en tät matta. Isolerade kolonier har mer sannolikt aktivt delande celler, vilket ger bäst resultat vid transformationen.) Rotera platinösen mellan tummen och fingret så att bakterierna lossnar och blandas med vätskan. Det ska inte synas några bakterierklumpar i vätskan. Ställ tillbaka röret (i hållaren) i isbadet. 4. Använd en steril platinös och hämta upp en ögla pglu-lösning och överför till röret med bakterier och blanda om. (OBS! Se till öglan har en film av vätska. Alternativt tilsätt 10 µl pglu-lösning med automatpipett. Stäng röret med bakterier + pglu och ställ tillbaka i isbadet. Inkubera på is i 10 minuter. Se till att röret når ner i isvattnet. 5. Värmechocka bakterierna genom att flytta från isbad till värmebad och tillbaka till isbadet igen enligt nedan. Se till att röret når ner i isbadet respektive värmebadet. OBS! Det är mycket viktigt att dessa förflyttningar går snabbt! Låt röret vara kvar i hållaren och överför till vattenbad (42 o C) i exakt 50 sekunder. Efter 50 sekunder flyttas hållaren med röret tillbaka till isbadet och inkuberas i 2 minuter. 6. Lyft ur hållaren med röret från isbadet och placera på bänken. 7. Överför 250 µl flytande LB-medium till röret. Inkubera röret i 10 minuter i rumstemperatur (låt stå kvar på bänken i tio minuter). 8. Efter 10 min inkubation med LB-broth görs en spädningsserie med pglu-bakteriesuspensionen. Späd i 10-steg: 10x, 100x, 1000x enligt nedan. (Om du vill beräkna andelen celler som transformerats behövs ytterligare två spädningssteg,10 000x och x.) Använd 0,9% NaCl-lösning och späd bakteriesuspensionen stegvis med tio gångers utspädning i varje steg (0,9 ml NaCl-lösning + 0,1 ml bakteriesuspension). Byt pipett mellan varje spädningssteg och använd vortexapparat för att blanda om. 9. Tillsätt 100 µl från utspädningsstegen 100x, 1000x till var sin platta med LB+arabinos. Gör gärna dubbelprov. (Om man vill beräkna andelen transformerade celler tas på samma sätt 100 µl från utspädningsstegen x och x.) Stryk noggrant ut suspensionen över plattornas hela yta med platinös. OBS! Byt platinös mellan varje utspädningssteg. Inkubera 1 dygn i värmeskåp 37 o C. 10. Flytta plattorna till ett mörklagt rum och belys med den lilla UVA-lampan som medföljer kittet. Om du har lyckats med transformationen syns enstaka, mycket små lysande punkter på plattorna utspridda i en tät matta av bakterier som inte transformerats. 11. Välj ut en av de lysande kolonierna, plocka upp den med en steril tandpetare eller ympnål med liten ögla. Stryk ut på en platta med LB+arabinos. Inkubera ett dygn vid 37 o C. Resultat och utvärdering Belys plattan med uv-ljus. Om du fått ett bra renutsryk syns kraftigt lysande bakteriekolonier på plattan. Upprepa renutstryk tills du fått enbart fluorescerande celler. Kommentarer: Man kan räkna andelen transformerade celler om man späder bakteriesuspensionen tillräckligt mycket och stryker ut på plattor så att man kan räkna enskilda kolonier. Det krävs i så fall en utspädningsgrad på x, se ovan. 11

12 1 Renodling av bakterier 2 Vid undersökningar av mikroorganismer vill man oftast arbeta med renkulturer. En renkultur är en odling i vilken samtliga celler härstammar från endast en ursprunglig cell. En sådan kultur kan åstadkommas genom att mikroorganismer gradvis späds ut, t.ex. genom utstrykning på agarplatta. På så sätt får enskilda celler möjlighet att dela sig och utvecklas till en koloni. En väl åtskild koloni kan anses härstamma från en enda cell. Säkerhet Endast klass 1-organismer ska användas. Försiktighet iakttas om gasbrännare används. 3 Materiel Bakteriekultur från agarplatta eller från suspension Ympnål/platinös Ren agarplatta Gasolbrännare om ympnål används som kräver sterilisering Utförande 4 1. Bränn hastigt av metallskaftet på ympnålen och glödga platinaöglan i gaslågan. Håll öglan nästan lodrätt i lågan så att hela metalltråden glödgas samtidigt. Alternativt använd en steril engångsplatinös. 2. Hämta bakterier från en agarplatta: Lyft locket på agarplattan och håll det som skydd mot kontaminering från luften. Låt ympnålen svalna några sekunder genom att doppa ner den i plattan, på ett ställe där det inte finns några kolonier (eller använd steril platinös). Hämta celler från en koloni som är väl separerad från övriga kolonier. Alternativt doppa en steril ympnål/platinös i en bakteriesuspension. 3. Gör ett renutstryk (se bildserien ovan): Stryk ett sicksackmönster med ympnålens ögla (eller platinösen) över en fjärdedel av agarytan. Undvik att skära ned i agarytan. Sätt på locket på agarplattan. Bränn av ympnålen på samma sätt som tidigare eller byt engångsplatinös. Vrid plattan ett fjärdedels varv. Lyft locket. Låt ympnålen svalna genom att sticka ned den på ett sterilt ställe i agarytan. Stryk ett streck med ympnålens ögla över det föregående utstryket och stryk sedan ett sicksackmönster över ytterligare en fjärdedel av agarytan. Sätt på locket på agarplattan. Bränn av ympnålen eller byt till ny engångsplatinös. Vrid plattan ett fjärdedels varv. Lyft locket. Stryk ett streck med ympnålens ögla över det föregående utstryket och stryk sedan ett sicksackmönster över den sista fjärdedelen av agarytan. Sätt på locket på agarplattan. Bränn av ympnålen. 5. Inkubera agarplattan i värmeskåp vid optimal temperatur för bakteriearten. Resultat och utvärdering Ett bra resultat innebär att bakteriekolonierna är väl åtskilda i något av de fyra utstryken så att det går att jämföra koloniernas utseende. Det ger möjlighet att avgöra om alla kolonier innehåller samma art av bakterie. 12

13 13

14 14

15 Antibakteriella ämnen För att testa giftverkan av olika ämnen används ett enkelt toxikologiskt test med bakterier som försöksorganismer. Många olika ämnen i både flytande och fast form kan undersökas med denna metod. Modellförsöket kan vara en utgångspunkt vid diskussioner om miljögifter och hälsofrågor. Vissa metalljoner och många andra ämnen kan hämma tillväxten av mikroorganismer, men även vara skadliga för andra organismer. Alltför höga halter av metalljoner i mat och dricksvatten är hälsofarligt. Detta gäller t.ex. höga kopparjonhalter i dricksvatten som gör att små barn kan få diarré. Ljust hår som tvättas i kopparhaltigt vatten kan få en grön färgton. I metoden, som beskrivs nedan, sprids en bakteriesuspension ut på en agarplatta. På plattan kan t.ex. små filtrerpapperslappar läggas, som doppats i de lösningar man vill undersöka. Alternativt läggs små bitar av ett fast ämne på plattan. En klar zon utan bakterieväxt bildas runt de prover som är giftiga för bakterierna ju större diameter på avdödningszonen desto giftigare. Syftet med laborationen är att lära sig använda en enkel toxikologisk testmetod. Säkerhet Hälsofarliga ämnen ska inte användas som testkemikalier. Endast klass 1-bakterier får användas. Material Kultuer av Micrococcus luteus och/eller Escherichia coli uppodlade i flytande näringslösning över natten. Alternativt kan man skrapa bakterier från en agarplatta med renutstryk och blanda med lite 0,9% NaCl-lösning. Sterila plattor med allsidigt medium (NA eller LB) Filtrerpapperslappar uttagna med hålslag Pincett Förslag på metalljonlösningar (0,01-0,2 M): t.ex. kopparklorid (CuCl 2 ), aluminiumklorid (AlCl 3 ), järnklorid (FeCl 3 ), zinkklorid (ZnCl 2 ), Förslag på övriga lösningar: t.ex. desinfektionsmedel, hygienprodukter Förslag på fasta ämnen: t.ex. kryddor färska eller i pulverform, vitlök, gul lök Sterila tops, helst med långt skaft Värmeskåp, (37 C) 70-procentig etanol. 15

16 Utförande 1. Använd ympnål och skrapa bakterier från en platta. Rör ut bakterierna i 0,9% NaCllösning eller i flytande medium ett provrör. Ta så mycket bakterier att suspensionen blir kraftigt grumlig. Alternativt använd en bakteriesuspension som odlats upp i näringslösning över natten. 2. Doppa en tops i bakteriesuspensionen och stryk ut bakterierna på den rena plattan med näringsagar. Låt varje streck med topsen täcka det föregående. Vänd därefter plattan och stryk ut bakterier på tvären över den första utstrykningen. Hela ytan ska täckas med täta streck det får inte bli ett glest rutmönster! Ställ de använda topsen i en bägare med lite 70-procentig etanol. 3. Följande tre metoder används beroende på vilket ämne som testas: Olika lösningar kan testas genom att små runda filterpapperslappar, som tagits ut med hålslag, doppas i testlösningar. Lapparna placeras sedan på agarytan med de utstrukna bakterierna. Använd steril preparernål eller pincett för att placera ut lapparna. Se till att inte ett överskott av vätska följer med lappen håll den mot kanten av kärlet så att överskottet rinner av. Om resultaten ska kunna jämföras måste alla lapparna behandlas likadant. Använd en avklippt droppipett av plast eller en korkborr som kan steriliseras och ta ut brunnar i agarskiktet. Brunnarna kan sedan fyllas med pulver eller lösningar. Bitar av fasta ämnen kan placeras direkt på ytan. Märk undersidan av petriskålen med vilka ämnen som testas. Lägg plattorna i plastpåse eller tätslutande plastlåda för att förhindra uttorkning. 4. Inkubera plattorna vid 37 o C i ett dygn. Resultat och utvärdering En klar zon utan bakterieväxt runt det testade ämnet visar att det är giftigt för bakterien ju större diameter på avdödningszonen desto giftigare (förutsatt att diffusionshastigheten i agar för de olika ämnena är jämförbar). Mät diametern på avdödningszonen. 16

17 Bakterier som lampa 17

18 18

19 19

20 Egenskaper hos Halobacterium Saltdammar vid San Francisco Bay med rosa Haloarchaea. Foto: Wickimedia Commons Organismvärlden delas in i tre grupper: bakterier, arkéer och eukaryoter. Arkérna är närmast släkt med eu karyoterna, dit bland andra djuren, växterna och svamparna hör. Halobacterium sp. NRC-1 hör till arkéerna och som många arkéer klarar den att leva i extrema miljöer. Det är en modellorganism för arkéer som är väl undersökt, men fortfarande finns det frågor som inte har besvarats. Säkerhet Halobacterium är inte patogen och det finns inte heller några kända patogener bland övriga arkéer. Risken för kontamination av kulturer är minimal eftersom cellerna endast växer i medium med hög salthalt. Halobacterium är av dessa anledningar lämplig för skolbruk. Novobiocin används inte för behandling inom sjukvården. Systemet är godkänt av Arbetsmiljöverket som anser att det är lämpligt att använda i skolan för resistensförsök. Material Plattor med utstryk av Halobacterium Flytande kulturer med Halobacterium, hög täthet krävs dvs. starkt rosa färg Novobiocin (3 mg/ml och/eller 0,3 mg/ml löst i vatten) Förstoringsglas eller stereolupp Etanol, 95%, iskall (förvaras i frys) Provrör av glas, 3 ml Pipett Studera odlingar med Halobacterium Studera en agarplatta med utstryk av Halobacterium. Jämför utseendet av kolonier som helst ligger väl åtskilda. Finns det några skillnader? Beskriv utseendet hos kolonierna. Studera vätskekulturen med Halobacterium. OBS! Skaka inte om kolvarna utan låt dem stå kvar på bänken. Avgör med hjälp av färgen på suspensionen var finns flest celler? Antibiotikatest Petriskålar med medium för Halobacterium används. På agarytan stryks ett tätt skikt av Halobacterium med hjälp av tops. Filtrerpapperslappar, som tas ut med hålslag, doppas i novobiocin (antingen 3 mg/ml eller 0,3 mg/ml löst i vatten) och de indränkta lapparna placeras på agarytan. DNA från Halobacterium Vad händer när Halobacterium utsätts för vatten utan salt? Hur kan man ta fram dna från Halobacterium? Utförande 1. Häll cirka 1 ml flytande kultur i ett glasprovrör som rymmer cirka 3 ml. 2. Tillsätt cirka 1 ml avjonat vatten. 3. Blanda om och låt stå ett par minuter. 4. Använd pipett och skikta långsamt och försiktigt 0,5-1 ml iskall 95% etanol över cellsuspensionen. 5. Håll provröret mot ljuset och studera etanolfasen under några minuter utan att skaka. 20

21 Kommentarer till försöken med Halobacterium Färgvariationer De flesta kolonier är rosa och ogenomskinliga, men några är röda och genomskinliga. Det kan också finnas vit-rosa, ogenomskinliga kolonier. Vita celler saknar förmåga att bilda rött pigment. Det kan dessutom vara olika färger på sektorer i kolonierna. Det beror på en ärftlig förändring i någon av dottercellerna till den ursprungliga cellen i kolonin och visar hur cellerna fortplantar sig, det vill säga genom delning. Cellernas röda färg bildas av ett komplex med rodopsin i kombination med en karotenoid, bakterioruberin. Celler som är vita har förändringar i genomet som påverkar bildningen av den röda färgen. Förändringar sker förhållandevis frekvent eftersom transposoner förflyttar sig inom genomet och påverkar uttrycket av generna. Arkéer brukar även ha flera uppsättningar av ringformade kromosomer. Hur många fungerande gener det finns i kromosomkopiorna kan påverka totala mängden av en viss genprodukt och eventuellt är det orsaken till att vissa kolonier har varierande rosa färg. Cellerna har liksom växterna möjlighet att omvandla solljus till kemisk energi. De använder sig av bakterierodopsin, som pumpar protoner in i cellen och bygger upp en spänning över membranet för att möjliggöra produktion av ATP. Cellerna har även en ljusdriven pump (halorodopsin) för att kunna transportera in kloridjoner in i cellen och göra det möjligt att hålla samma osmotiska potential i cellens inre som i omgivningen. Gasfyllda vesiklar I kolvarna med rosa eller vita Halobacterium ser man överst ett rosa eller vitt skikt. Halobacterium kan ha ett stort antal gasfyllda vesiklar i sina celler. Det gör att cellerna flyter upp till ytan i en vätskekultur. Detta sker först när kulturen uppnår stationärfas, efter uppodling under ca en vecka i skakvattenbad, o C. Vätskekulturer med gasfyllda celler blir ogenomskinliga med antingen rosa eller vit färg. Om cellerna saknar vesiklar blir en vätskekultur mer genomskinlig och cellerna lägger sig på bottnen. Kolvarna måste stå utan att man rör dem tills cellerna har antingen hunnit flyta upp till ytan eller sedimentera. När Halobacterium växer på agarplatta blir kolonier som innehåller celler med vesiklar ogenomskinliga. De flesta kolonier brukar vara rosa, men det kan också förekomma kolonier som är svagt rosa eller helt vita. På en platta med många kolonier brukar några av kolonierna vara röda och genomskinliga. Cellerna i dessa kolonier saknar vesiklar. I mikroskop är celler från rosa eller vita kolonier med vesiklar är kraftigt ljusbrytande. I några celler brukar man kunna se vesiklar som tillsammans bildar större ofärgade, rundade kroppar, men man behöver studera många celler för att hitta några där man tydligt ser dessa bildningar. Celler från kolonier som är röda och genomskinliga har inga genomskinliga kroppar. De ser enfärgat mörka ut i mikroskopet. Man tror att det är fördelaktigt för cellerna att söka sig mot vattenytan, en miljö med hög syrehalt och god ljustillgång, eftersom vatten med hög salthalt håller betydligt lägre syrehalt än rent vatten. Solens uv-strålning är DNA-skadande, men Halobacterium har effektiva DNA-reparationssystem, bl.a. enzymet fotolyas som är ljusberoende. Cellerna har även flageller som gör att de kan simma och söka sig till optimala miljöförhållanden beträffande näringsämnen, ljus och syrehalt (taxier). Sensory rhodopsin I, har betydelse för fototaxi och medför att cellerna rör sig mot orange ljus och från UV-ljus. Sensory rhodopsin II medför att cellerna rör sig från blått ljus. dna-extraktion Det är mycket lätt att extrahera dna ur Halobacterium eftersom cellerna kräver hög salthalt för att överleva och därför lyserar omedelbart när de kommer i kontakt med vatten. Man ser en tydlig ring av utfällt dna (inklusive protein) i etanolfasen strax ovanför gräns ytan till cellsuspensionen, se bild. Efter ett tag bildas trådar av dna och protein i etanolfasen. 21

22 Odlingsanvisningar Medium för odling av Halobacterium: Natriumklorid 250 g Magnesiumsulfat, heptahydrat 20 g Trinatriumcitrat, dihydrat 3 g Kaliumklorid 2 g Hydrolyserat kasein 5 g Jästextrakt 5 g Avjoniserat vatten 1 liter Justera ph till 7,2 med antingen 3 M NaOH eller koncentrerad saltsyra. Till fast medium sätts 20g agar. Optimumtemperatur: o C. Tid för tillväxt på fast eller flytande medium: 1-2 veckor. Resurscentrum kommer att under en begränsad tid erbjuda skolor att inköpa plattor med Halobacterium. Kontakta info@bioresurs.uu.se för mer information. Levande celler från saltkristaller Pröva att regenerera växande Halobacterium från saltkristaller. Indunsta en flytande kultur med Halobacterium så att saltkristaller bildas. Studera saltkristallerna i stereolupp. Vilken form har de? Kan man se att det finns celler av Halobacterium på eller i kristallerna? Pröva sedan att återigen få en kultur med växande Halobacterium genom att tillsätta en saltkristall till ett flytande medium. Saltkristallerna kan förvaras under lång tid och fortfarande innehålla levande celler. Testa hur lång överlevnaden är! Referenser Inqury-driven Teaching & Learning the Archaeal Microorganism Halobacterium NRC-1. Priya Dassarma et al. The American Biology Teacher. 78(1): Se Bioresurs webbsida i anslutning till Bi-lagan nr för fler referenser. 22

23 Mord i mikrovärlden 23

24 24

25 25

26 26

27 Odling av svamp I stort sett alla vedlevande och förnanedbrytande svampar kan man lätt odla och de växer relativt snabbt. Ostronskivling, som man köper i livsmedelsaffärer, är särskilt lättodlad. De flesta mykorrhizasvampar, dvs. de flesta matsvampar, går däremot inte att odla. Isoleringen ska göras så snart man kommer hem med svampen från skogen (eller affären) och fruktkropparna ska vara unga, fasta och inte angripna av insekter. Säkerhet Var försiktig vid sterilisering av redskap så att inte etanol antänds. Se till att det finns utrustning för att kväva eld om etanolen skulle antändas. Uppodling av svampmycel Material Svampar hämtade från skogen eller inköpta i livsmedelsaffär Petriskålar med maltagar Skalpell Pincett Liten bägare med sprit (helst 95 %) och lock för att täcka över bägaren Sprit, 70 % Tape eller parafilm Plastpåsar Utförande Uppodling av svamp Allt arbete måste ske sterilt. Arbeta på en bänk som torkats med 70% sprit, i ett rum där luften inte virvlar runt pga drag eller där människor rör sig. Torka av händerna med 70% sprit och håll inte huvudet/håret över svampen/petriskålen annars finns det risk för mögelinfektioner. 1. Dela svampen mitt itu genom att bryta. Ingenting från utsidan eller dina fingrar får komma i kontakt med svampens inre. 2. Sterilisera en skalpell och en pincett genom att doppa redskapen i 96% sprit och föra dem genom en gaslåga så spriten brinner upp. Eller sterilisera redskapen i värmeskåp. 3. Skär med den sterila skalpellen ut ett litet stycke av fruktköttet och använd pincetten för att lägga biten på på en maltagarplatta. Lägg 2-4 små svampbitar på varje agarplatta. Var noga med att inte kontaminera svampbitarna. Sterilisera redskapen med jämna mellanrum. 4. Vira tape eller parafilm kring petriskålen och lägg plattorna i plastpåse. 5. Låt stå mörkt i rumstemperatur tills svampen vuxit ut. Viktigt är att kontrollera plattorna med ett par dagars mellanrum. Mögliga plattor slängs. 27

28 Test av hur svampmycel reagerar på giftiga ämnen Snabbväxande svampmycel kan användas för att se giftverkan av olika ämnen. Tillväxten av svampmycel hämmas av kopparsulfat. Material Maltagarplatta med uppodlat mycel av ostronskivling (aktivt växande mycel, ca en centimeters tillväxt) Lösningar av ämen som ska testas Filtrerpapper Hålslag Pincett Sprit (70% och 96%) Utförande 1. Odla upp mycel av ostronskivling enligt ovan (inköpt i livsmedelsaffär). 2. Låt mycelet växa till cirka 1 centimeter. 3. Gör lösningar i olika koncentrationer av det ämne du vill testa. I princip kan man testa allt som är vattenlösligt. Några förslag: kopparsulfat, benzoesyra, olika ph, kväveföreningar, vattenextrakt från förna, vitlök, skal från citrusfrukter eller banan. Ja, det är fritt fram för den egna fantasin. 4. Gör små papperslappar med hålslag. 5. Placera papperslapparna i de lösningar som ska testas. Ta upp papperlapparna med en flamberad pincett och låt dem rinna av lite mot kärlkanten. 6. Placera bitarna med ca 4 mm avstånd från mycelkanten. Säkrast är att endast ha en till två olika koncentrationer av det ämne man undersöker per platta och i stället ha flera plattor. (Om flera lappar placeras alltför tätt kring svampbiten, kan myceltillväxten hämmas så att det inte går att se skillnad mellan den normala tillväxten och hämningen beroende på svampgift.) 7. Låt plattorna stå ett par dagar til en vecka (beroende på hur snabbt svampen växer). Resultat och utvärdering Kan man se några skillnader i svampens tillväxt för de olika ämnena/koncentrationerna? Referens Laborationen bygger på ett häfte Svamp i skolan utarbetat vid Institutionen för skoglig mykologi och patologi av Anders Dahlberg, Eva Damm och Lena Jonsson. 28

29 Mikrosvampar i barr Det är ett begränsat antal svampar som bildar fruktkroppar på nedfallna barr och löv. På nedfallna granbarr är det framför allt granskytte (Lophodermium picee) och Rhizosphaera kalkoffi. På nedfallna tallbarr är det endofyten/saprofyten barrsprickling (Lophodermium pinastri) och tallskytte-patogenen (Lophodermium seditiosum) som dominerar. Hos granskytte och barrsprickling kan det uppträda flera svampindivider per barr. Individerna avgränsas av svarta tvärband, vilka är reaktionszonen där två svampindivider möts. (Gör gärna en bild sökning på webben på ovanstående latinska namn där utmärkt bildmaterial går att finna.) Laborationen bygger på ett häfte Svamp i skolan utarbetat vid Institutionen för skoglig mykologi och patologi av Anders Dahlberg, Eva Damm och Lena Jonsson. Säkerhet Var försiktig vid sterilisering av redskap så att inte etanol antänds. Se till att det finns utrustning för att kväva eld om etanolen skulle antändas. Uppgift Studera barren i stereolupp. Kan du hitta svarta tvärband? Hur många individer finns det i barren? Odla mikrosvampar Levande barr har en rik flora av såväl endofytiskt som epifytiskt levande svampar. Dessa kan man ganska lätt odla ut och bland annat visa att det faktiskt växer endofytiska svampar inne i barren. Från friska granbarr växer nästan alltid granskytte (Lophodermium picee) ut. Denna svamp förekommer i % av en grans barr oavsett var i Sverige man befinner sig. Den bildar ett mjölaktigt vitt mycel. Som endofyt i tallbarr växer ofta barrsprickling (Lophodermium pinastri) ut. Barrspricklingen växer ut med ett grått mycel kringgärdat av en grå bård. Denna svamp förekommer i mellan % av alla friska tallbarr. Från både tall och granbarr växer också ofta Scleriphoma pithyophila ut. Dess mycel är karaktäristiskt svartglänsande. För att få endofytiskt levande svampar att växa ut krävs att barren steriliseras. Man kan också lägga osteriliserade barr på maltagarplattor och se vad som växer ut från ytan. Där finns andra arter (annorlunda färg och form), bland annat jästsvampar. Ytsvampar växer ut snabbt, inom ett par dagar. 29

30 Ytsterilisering av barr Ytsteriliseringen är viktig, annars kommer de epifytiskt växande svamparna helt att dominera, eftersom de är så snabbväxande. Material Barr från gran och/eller tall. Bägare med 70% etanol 3 bägare med sterilt vatten (eller rent kranvatten) Steril pincett Sterilt filtrerpapper (eller eventuellt hushållspapper) 1. Doppa barren i 70% etanol i en minut. 2. Skölj barren i 3 bad med sterilt vatten. (Vatten direkt från kranen kan eventuellt användas i stället för sterilt tvatten om man spolar igenom kranen ordentligt först.) 3. Flytta barren med en flamberad pincett. 4. Lägg barren på sterilt filtrerpapper eller eventuellt hushållspapper i en steril petriskål. (Sterilisera filtrerpapper i 2 tim 170 C eller dra ut ett par varv på hushållspappersrullen så att rent, okontaminerat papper kommer fram.) 5. Dela granbarren i två delar med en flamberad skalpell och lägg dem på maltagarplattor. 6. Inkubera i mörker i rumstemperatur i 1-2 veckor. Resultat och utvärdering Studera mycelet som växt ut från barren i stereolupp. Finns det skillnader i färg och struktur? Hur många svampindivider har växt ut från barren? Individerna avgränsas av tvärgående svarta linjer.) Finns det dubbla tvärband på barren? (Visar att två individer växer tätt intill varandra.) Se även följande sida hämtad ur Bi-lagan nr

31 31 Underlaget till undersökningarna på detta uppslag kommer från laborationer utarbetade vid SLU av Anders Dahlberg, Eva Damm och Lena Jonsson. Vi har även fått värdefull hjälp av Eva Damm, Inst. för biologisk grundutbildning, Uppsala universitet. Svampar kan skilja på själv och icke själv. Tittar man noggrant på ett dött barr kan man se tunna tvärgående linjer. Linjerna avgränsar en svampindivid. Odlar man upp svampar från barr på maltagar växer de till sig och det syns tydligt om det finns flera individer i ett barr, se bild höger. Växer mycelet ihop är det samma individ, men bildas det en tydlig zon mellan svamparna är det olika individer. Det här kan även testas med ostronskivling från affären. Se bild nedan till höger. Vem är jag? Ostronskivling inköptes från två affärskedjor och små bitar från svamparna placerades på en maltagarplatta (se pilar). Mycelet växer ihop och någon mörk linje bildas inte, fruktkropparna kommer alltså från samma svampindivid. Bi-lagan nr 2 augusti 2011 Får fritt kopieras i icke-kommersiellt syfte om källan anges Ett sätt att upptäcka svampars sporer är att lägga en svamphatt med undersidan nedåt på ett papper. Har svampen ljusa sporer används ett mörkt papper och har den mörka sporer används ett vitt papper. Är du osäker på sporfärgen, lägg ett svart och ett vitt papper intill varandra och lägg hatten mitt på skarven. Sporavtrycket kan fixeras med hjälp av fixativ och ramas in. På bilden t.v. syns mönstret av portabellohattens skivor som bildas av sporerna. Ostronskivling Gran- och tallbarr har en rik flora av olika svampar. Det är svårt att artbestämma dessa svampar, men odlar man upp dem på agarplattor är vissa mörka och andra ljusa. Mörka svampar lever utanpå barret, epifytiskt. De ljusa svamparna lever inne i barren, endofytiskt. Inne i barret behöver svampen inte något pigmentskydd mot UV-strålning och är därför ofärgad. Svamparna inne i barren infekterar granbarren första året men börjar inte växa till förrän barret dör efter kanske 6-8 år. När sådana svampar odlas upp på maltagar har de en långsam tillväxt. De epifytiskt växande svamparna är däremot snabbväxande och tar över helt om man inte steriliserar barren. Svamp i och på barr I trädens blad finns det svamp, bland annat jästsvampar. En rolig undersökning är att med vaselin fästa blad i locket av en petriskål med maltagar. Sporer och mycelfragment kommer att ramla ner och börja växa och bilda en kopia av bladet. Bäst resultat får man med färska blad på hösten. Bild av blad I skogen finns det inte bara stora hattsvampar. De flesta svampar är små och oansenliga, men vissa går att odla och studera närmare på labb. För svampodling behöver man petriskålar med maltagar. Se fullständig beskrivning av försöken på i anslutning till Bi-lagan nr Odla svamp Petriskål med tre granbarr (pilar) men bara två svampindivider. Gränsen går där det har bildats en svart linje. Förstoring av granbarr med flera svampindivider. Pilen visar två linjer tät intill varandra där två individer möts. Endofytiskt (ljusa) och epifytiskt (mörka) svampar odlade från granbarr. Den förstorade bilden nedan visar flera svampindivider som växt ut från granbarret. Varje individ avgränsas av en mörk linje. T.v. ekblad, fäst med vaselin i petriskålens lock,t.h. rosa kolonier av jästsvampar på maltagar. Jästsvamparna kommer från bladytan och har fallit ner och bildat kolonier på maltagarplattan.

32 Jordbakterier på morötter Försöket med morötter är enkelt att utföra, men kräver eftertanke och kunskaper om bakterier och växtceller för att kunna förklara. Bakterier som i första hand är aktuella i försöket hör till släktet Bacillus. Dessa är vanligt förekommande i naturen. Säkerhet Försöket innebär inte några specifika risker, men försiktighet vid uppvärmning krävs. Material 1 morot (ej alltför rentvättad) 5 tomma petriskålar (eller plastmuggar och gladpack) kniv kastrull (eller bägare) pincett Utförande OBS! Tvätta inte moroten! 1. Skär moroten i 3-4 mm tjocka skivor utan att ta på den i onödan. 5 alternativt 10 skivor behövs. 2. Lägg en till två morotsskivor (beroende på hur många som får plats)i en petriskål (eller plastmugg som sedan täcks med gladpack). 3. Lägg 8 morotsskivor i kokande vatten. Ta upp 2 morotsbitar åt gången efter 1, 2 5 respektive 10 minuter och lägg bitarna i petriskålar (eller plastmuggar som täcks med gladpack). 4. Märk petriskålarna med koktid och gruppens namn. 5. Trä en plastpåse över petriskålarna så att morotsbitarna inte torkar ut. 6. Låt stå i rumstemperatur i cirka en vecka. Resultat och utvärdering Studera morotsbitarna. Beskriv utseendet och förklara skillnaderna. Referens Eva Damm, Institutionen för biologisk grundutbildning, Uppsala universitet. 32

33 Material till mikrobiologilaborationerna Tryckplattor Fisher Scientific GTF ABArendalsvägen Göteborg Artikelnummer: X300 PETRISKÅL,55MM,RUND,KONTAKT,AS, Pris (februari 2019): kr Medier Fiskmedium 250 g fiskkött kokas i 1 dm 3 kranvatten. Buljongen silas och tas tillvara. 30 g NaCl (3 % i det färdiga mediet) 10 g pepton 10 cm 3 glycerol 1 g jästextrakt tillsätts eventuellt 15 g agar tillsätts om fast medium önskas ph-värdet justeras till 7 Autoklavera Kasein- (mjölkpulverprotein-)medium 10 g torrmjölkspulver 5 g pepton 15 g agar 1 dm 3 avjonat vatten Autoklavera Stärkelsemedium NA (nutrient agar) blandas med 2 % stärkelse. Autoklavera Maltagar (kan inköpas som färdig blandning) 30 g maltextrakt 1 dm 3 avjonat vatten 15 g agar Nutrient agar (NA, kan inköpas som färdig blandning) agar, 15 g/l 1 g köttextrakt 5 g peptone 5 g NaCl 2 g jästextrakt ph-värdet justeras till 7.1±0.2 (25 C) 33