Provläsningsexemplar / Preview

Transkript

1 Vattenundersökningar Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma bakterier och Escherichia coli i vatten - Bestämning med rörmetod (MPN) Coliform Bacteria, Thermotolerant Coliform Bacteria and Escherichia coli in Water Determination with the Multiple Tube Method (MPN) lnnehåll 0 Orienteering 1 Omfattning 2 Referenser 3 Definitioner 4 Princip 5 Utrustning 6 Provtagning 7 Bestämning 8 Resultat 9 Rapport Litteratur Bilaga A Odlingssubstrat och reagens (Denna bilaga är en del av standarden) Bilaga B Utökad testning (Informativ) 0 Orienteering De sjukdomar som kan spridas med dricksvatten är framför allt olika mag- och tarmsjukdomar där smittämnena (bakterier, virus, parasiter) finns i avföringen från djur och människa. I vatten förekommer de sjukdomsalstrande (patogena) mikroorganismerna i regel i litet antal jämfört med de naturliga tarmbakterierna. Det finns metoder för att påvisa olika patogena mikroorganismer i vatten, men de är ofta omständliga och kostnadskrävande. Därför letar man vid mikrobiologisk rutinkontroll av vatten i stället efter olika s.k. indikatorbakterier, dvs. bakterier som normalt finns i avföring från djur och människa. De mikroorganismer som används som indication på sådan förorening är främst E. coli och dessutom hela gruppen koliforma bakterier. Den metodik som anges i denna standard för bestämning av koliforma bakterier baseras på nedbrytning av laktos till syra och gas. Det existerar dock naturligt förekommande koliforma bakterier som saknar eller har tappat förmågan att bryta ner laktos, och som därför faller utanför metoddefinitionen trots att de har samma indikatorvärde.

2 Vattenundersökningar Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma SVENSK STANDARD SS bakterier och Escherichia coli i vatten - Bestämning med rörmetod (MPN) Utgåva 2 Sida 2 E. coli anses vara av fekalt ursprung, medan övriga koliforma bakteriearter antingen kan vara av fekalt ursprung eller finnas naturligt i jord och vatten. Om osäkerhet råder om deras indikativa värde bör vidare artidentifiering ske (Bilaga B). Närvaro av ett stort antal koliforma bakterier av samma art kan indikera tillväxt i vattnet. Utgåva 2 skiljer sig från utgåva 1 genom ändrade förslag till analysvolymer. Vidare konfirmeras koliforma bakterier enbart i briljantgröntbuljong, och för bestämning av termotoleranta koliforma bakterier och E. coli kan antingen en enrörsmetod eller en tvårörsmetod användas. Följaktligen har vissa odlingssubstrat, såsom LES endoagar, tagits bort, medan andra substrat, såsom laktostryptonlaurylsulfatbuljong tillkommit. Recept på odlingssubstrat och reagens är placerade i en bilaga, och ytterligare en bilaga ger information om utökad testning. VARNING! Vid användning av denna standard hanteras kemikalier och mikroorganismer som, om de inte hanteras rätt, kan medföra hälsorisker. Regler för arbetsmiljön finns i Arbetarskyddsstyrelsens författningssamling, t. ex. i reglerna om farliga ämnen och om biologiska ämnen. 1 Omfattning I denna standard beskrivs bestämning av antalet koliforma bakterier i vatten vid 35 C, termotoleranta koliforma bakterier i vatten vid 44 C och E. coli i vatten vid 44 C enligt SS , utg 2, Mikrobiologisk undersökning Rörmetod MFN. Bestämning och konfirmering av dessa indikatororganismer skall ske i en följd. Analysens omfattning beror dels på typen av vattenprov och dels på den information som efterfrågas. MPN-metoden är tillämpbar på alla typer av vatten såsom dricksvatten, råvatten, badvatten, recipientvatten och avloppsvatten. Den kan också tillämpas på avloppsslam, sediment eller jord förutsatt att mikroorganismerna är jämnt fördelade. Detta kan uppnås genom t. ex. homogenisering. Det bör observeras att metodkvantifieringen är baserad på sannolikhetsberäkningar och har ett relativt stort metodfel. Ansvarig myndighet bestämmer provtagningsfrekvens och vilka mikrobiologiska krav som skall ställas på vattnet. 2 Referenser SS , utg 2, Vattenundersökningar Mikrobiologisk undersökning Provtagning SS , utg 2, Vattenundersökningar Mikrobiologisk undersökning Rörmetod MPN 3 Definitioner Koliforma bakterier i denna standard definierade som aeroba och fakultativt anaeroba, oxidasnegativa bakterier som förjäser laktos under bildning av syra och gas inom 48 h vid inkubering i (35 ± 0,5) C. Termotoleranta koliforma bakterier koliforma bakterier som dessutom förmår förjäsa laktos under bildning av syra och gas inom 24 h vid inkubering i (44 ± 0,5) C. E coli termotoleranta koliforma bakterier som dessutom kan bilda indol ur tryptofan inom 24 h vid inkubering i (44 ± 0,5) C. 4 Princip Se SS , utg 2, för en generell beskrivning över rörmetod MPN.

3 Vattenundersökningar Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma SVENSK STANDARD SS bakterier och Escherichia coli i vatten - Bestämning med rörmetod (MPN) Utgåva 2 Sida 3 Provet ympas på en eller flera serier flaskor eller rör med icke-selektivt substrat innehållande laktos (presumtiv analys). Koliforma bakterier bestäms genom att positiva flaskor eller rör från den presumtiva analysen ympas vidare till selektivt substrat med briljantggrönt (konfirmativ analys). Termotoleranta koliforma bakterier bestäms genom att positiva flaskor eller rör från den presumtiva analysen ympas vidare till nytt substrat med laktos, som därefter inkuberas vid 44 C. E. co/i bestäms genom att termotoleranta koliforma bakterier analyseras med avseende på indolbildning från tryptofan. 5 Utrustning Utrustning enligt SS , utg 2, avsnitt 4, med följande preciseringar: 5.1 Inkubator Vattenbad, inkubatorskåp eller inkubationsrum med möjlighet att reglera temperaturen till (35 ± 0,5) C eller (44 ± 0,5) C. 5.2 Glas Flaskor, provrör och gasuppsamlingsrör av lämplig storlek så att påfyllt substrat når över gasuppsamlingsrörets kupol. 6 Provtagning Ta ut vattenprover och transportera dessa enligt SS , utg 2. 7 Bestämning Bestäm koliforma bakterier, termotoleranta koliforma bakterier och E. coli enligt SS , utg 2. Lämpliga analysvolymer för olika typer av prov framgår av tabell 1. Tabell 1 Förslag till analysvolymer 7.1 Koliforma bakterier Presurntiv analys Ympa provet på en eller flera serier flaskor eller rör med laktospeptonbuljong, LPB (A.1.1). Använd 50 ml koncentrerad LPB för provvolymer på 50 ml och 10 ml koncentrerad LPB för provvolymer på 10 ml. Använd 5 ml svag LPB för provvolymer mindre an 10 ml. Inkubera flaskor och rör i (35 ± 0,5) C.

4 Vattenundersökningar Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma SVENSK STANDARD SS bakterier och Escherichia coli i vatten - Bestämning med rörmetod (MPN) Utgåva 2 Sida 4 Läs av efter (24 ± 4) h och (44 ± 4) h samt anteckna antalet positiva rör i varje serie. Som positiva rör räknas rör som visar både syrabildning (indikatorn har slagit om till gult) och gasbildning (Durhamrörets kupol är fylld med gas). Gasbildningen kan ibland framträda först efter en lätt knackning på röret och då i form av små uppstigande blåsor. Eftersom LPB är ett oselektivt substrat måste den presumtiva analysen följas av en konfirmativ analys Konfirmativ analys Konfirmering sker genom bestämning av gasbildning i briljantgröntbuljong, BGB (A.1.2) vid (35 ± 0,5) C. Konfirmera i samband med avläsningen efter 24 h alla positiva flaskor eller rör. Konfirmera sedan de positiva flaskor eller rör som tillkommit inom 48 h i samband med slutavläsning av den presumtiva analysen. Konfirmera da också samtliga övriga rör eller flaskor som visar växt (grumling av substratet) i varje serie där något rör blivit positivt Konfirmering i BGB Överför ca 10 µl med en steril ögla från ett LPB-rör ( ) till ett motsvarande rör med BGB (A.1.2). Inkubera rören i (35 ± 0,5) C och kontrollera eventuell gasbildning (positiv reaktion) efter (24 ± 4) h och (48 ± 4) h. Anteckna de rör som givit positiv reaktion i varje serie. 7.2 Termotoleranta koliforma bakterier Bestämning sker genom undersökning av syra- och gasbildning från laktos (tvårörsmetod) eller enbart gasbildning från laktos (enrörsmetod) vid (44 ± 0,5) C. Liksom vid konfirmering utgår man vid bestämning av termotoleranta koliforma bakterier från flaskor eller rör i den presumtiva analysen och dessa väljs ut enligt samma princip (7.1.2). Överför ca 10 µl med en steril ögla från ett LPB-rör till ett nytt rör med LPB (A.1.1). Inkubera röret i vattenbad med en temperatur av (44 ± 0,5) C tills denna temperatur uppnåtts i röret. Flytta därefter om så önskas röret till ett inkubatorskåp med samma temperatur och inkubera sammanlagt under (24 ± 4) h. Syra- och gasbildning från LPB bedöms som positiv reaktion. Anteckna antalet positiva rör. Om även antalet E. coli skall bestämmas kan enrörsmetoden användas (7.3.1). 7.3 E. coli Bestämningen sker genom undersökning dels av syra- och gasbildning från laktos (tvårörsmetod) eller enbart gasbildning från laktos (enrörsmetod), dels av indolbildning från tryptofan vid (44 ± 0,5) C. Beräkning av det mest sannolika antalet E. coli kan endast ske med utgångspunkt från de rör som givit positiv reaktion i båda dessa analyser. Bestämningen kan utföras antingen i ett rör med kombinerat substrat (enrörsmetod) eller i två separata rör (tvårörsmetod). Urvalskriterierna är desamma som under Enrörsmetod Överför ca 10 µl med en steril ögla från ett LPB-rör i den presumtiva analysen till ett rör med laktostryptonlaurylsulfatbuljong, LTLSB (A.1.3). Inkubera röret i vattenbad med en temperatur av (44 ± 0,5) C tills denna temperatur uppnåtts i röret. Flytta därefter om så önskas röret till inkubatorskåp med samma temperatur och inkubera sammanlagt (24 ± 4) h. Rör som visar gasbildning är positiva.

5 Vattenundersökningar - Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma SVENSK STANDARD SS bakterier och Escherichia coli i vatten - Bestämning med rörmetod (MPN) Utgåva 2 Sida 5 Undersök positiva rör på indolbildning genom att tillsätta 0,5 ml Kovács reagens (A.2.1) till rören. Framträder efter omskakning ett rött ytskikt har indol bildats. Är ytskiktets färg orange, gul eller grön är reaktionen negativ Tvårörsmetod Överför ca 10 µl med en steril ögla från ett LPB-rör i den presumtiva analysen till ett oympat rör med LPB (A.1.1). Överför samtidigt ca 10 µl med en steril ögla till ett rör med tryptofanbuljong (A.1.4). Inkubera rören i vattenbad med en temperatur av (44 ± 0,5) C tills denna temperatur uppnåtts i rören. Flytta därefter om så önskas rören till inkubator skåp med samma temperatur och inkubera sammanlagt (24 ± 4) h. Syra- och gasbildning i LPB-röret anses som positiv reaktion. Undersök indolbildning genom att tillsätta 0,5 ml Kovács reagens (A.2.1) till röret med tryptofanbuljong. Framträder efter omskakning ett rött ytskikt har indol bildats. Är ytskiktets färg orange, gul eller grön är reaktionen negativ. 8 Resultat Beräkna resultatet enligt SS , utg 2. 9 Rapport Rapporten skall innehålla följande uppgifter: a) noggrann identifiering av provet b) hänvisning till denna standard SS , utg 2 c) resultat d) övriga förhållanden som kan ha påverkat resultatet. Litteratur 1) ISO , Water Quality Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli Part 2: Multiple tube (most probable number) method 2) Kovács, N: Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature (1956) 178, p 703

6 Vattenundersökningar Koliforma bakterier, termotoleranta koliforma BILAGA A TILL SS bakterier och Escherichia coli i vatten - Bestämning med rörmetod (MPN) Utgåva 2 Sida 6 Bilaga A - Odlingssubstrat och reagens (Denna bilaga är en del av standarden) Använd destillerat eller avjoniserat vatten vid alla beredningar. Vattnet får inte innehålla substanser som kan påverka mikroorganismernas tillväxt under analysbetingelserna. Samtliga kemikalier skall vara av hög renhet (pro analysi). Justera ph vid behov genom tillsats av antingen 1,0 mol/l natriumhydroxidlösning (40 g NaOH per liter vatten) eller 1,0 mol/l saltsyra (82,5 ml koncentrerad HCl. spadd till 1 liter). A.1 Odlingssubstrat Kan ett substrat köpas i dehydrerad form bör det användas i första hand. Följ i så fall tillverkarens anvisningar vid beredningen. A.1.1 Laktospeptonbuljong, LPB Svag Koncentrerad 1) 2) 3) 4) 5) 6) Köttextrakt 3,0 g 6,0 g Pepton 10,0 g 20,0 g Natriumklorid 3,0 g 6,0 g Laktos 5,0 g 10,0 g Bromkresolpurpurlösning 1 ml 2 ml 1 g/100 ml 96 % etanol Destillerat vatten ml ml Lös ingredienserna 1), 2) och 3) i vattnet och kontrollera att lösningens ph är 7,4. Tillsätt laktos 4) under uppvärmning och tillsätt därefter bromkresolpurpurlösningen 5). Fyll substratet på flaskor eller rör med gasuppsamlingsrör. Sätt 50 ml koncentrerad buljong till flaskor och 10 ml till rör. Sätt 5 ml svag buljong till rör. Tillslut flaskor med skruvlock och rör med bomullsproppar, plast- eller metallhylser. Autoklavera dem i 15 min vid en uppnådd temperatur av 110 C. Vid svårighet att få sterila substrat kan man göra en extra autoklavering före laktostillsatsen i 15 min vid 121 C. Det färdiga substratets ph skall vara 7,4 ± 0,1. A.1.2 Briljantgröntbuljong, BGB 1) Pepton 10 g 2) Laktos 10 g 3) Oxgalla 20 g 4) Briljantgröntlösning 10 ml 0,133 g/100 ml vatten 5) Destillerat vatten ml Lös ingredienserna 1) och 2) i 500 ml vatten. Lös oxgallan 3) i 200 ml vatten och justera ph till 7,4 ± 0,1. Blanda de båda lösningarna, tillsätt ca 75 ml vatten och justera ph till 7,4 ± 0,1. Tills att briljantgröntlösningen 4) och fyll på vatten till en volym av ml. Sätt 5 ml buljong till provrör med gasuppsamlingsrör. Tillslut rören med bomullsproppar, plast- eller metallhylsor. Autoklavera rören i 15 min vid en uppnådd temperatur av 110 C. OBSERVERA att olika satser av BGB kan ha olika selektiva egenskaper.