Förbättrad trombocyträkning hos katt med tillsats av iloprost till EDTA-blod

Transkript

1 Sveriges lantbruksuniversitet Fakulteten för veterinärmedicin och husdjursvetenskap Institutionen för kliniska vetenskaper Förbättrad trombocyträkning hos katt med tillsats av iloprost till EDTA-blod Kerstin Bäcklund Uppsala 2013 Examensarbete inom veterinärprogrammet ISSN Examensarbete 2013:23

2

3 SLU Sveriges lantbruksuniversitet Förbättrad trombocyträkning hos katt med tillsats av iloprost till EDTA-blod Improved Analysis of Feline Platelets with Addition of Iloprost to Blood Taken with EDTA Collection Tubes Kerstin Bäcklund Huvudhandledare: Harold Tvedten, Institutionen för kliniska vetenskaper Biträdande handledare: Inger Lilliehöök, Klinisk kemiska laboratoriet, UDS Examinator: Anna Hillström, Institutionen för kliniska vetenskaper Examensarbete inom veterinärprogrammet, Uppsala 2013 Fakulteten för veterinärmedicin och husdjursvetenskap Institutionen för kliniska vetenskaper Kurskod: EX0736, Nivå A2E, 30hp Nyckelord: trombocyter, pseudotrombocytopeni, trombocyträkning, katt, plateletkrit, iloprost, prostaglandin E1, Advia 2120, QBC Vet Autoread, blodutstryk, räknekammare Key words: platelets, pseudothrombocytopenia, platelet counting, feline, plateletcrit, iloprost, prostaglandin E1, Advia 2120, QBC Vet Autoread, blood smear, bürker chamber Online publication of this work: ISSN Examensarbete 2013:23

4

5 INNEHÅLLSFÖRTECKNING SAMMANFATTNING..1 SUMMARY 3 INLEDNING..5 LITTERATURÖVERSIKT...6 Trombocyter.6 Hemostasen...6 Primära hemostasen... 6 Sekundära hemostasen 6 Hemostasdefekter och blödningssymtom 6 Trombocytopeni.7 Sann trombocytopeni... 7 Pseudotrombocytopeni 8 Makrotrombocytopeni hos Cavalier King Charles Spaniel Automatisk och manuell trombocyträkning..9 Impedans..9 Optisk flödescytometri..10 Quantitative Buffy Coat. 10 Manuell räkning. 11 Antikoagulans och trombocytaktiveringshämmande medel. 12 EDTA.12 Prostaglandin E Iloprost MATERIAL OCH METODER..13 Studiepopulation och blodprover..13 Antikoagulans och trombocytaktiveringshämmande medel.13 Analyser 14 Manuell räknekammare Blodutstryk RESULTAT.15 Antikoagulans inverkan på trombocytaggregering..16 Advia trombocyträkning och Advia plateletkrit..17 Manuell räknekammare och trombocyträkning.20 QBC VetAutoread och trombocyträkning.21 Metodjämförelse.23 Antal katter med sann trombocytopeni...28 DISKUSSION.30 ACKNOWLEDGEMENTS 35 REFERENSER...35

6

7 SAMMANFATTNING Bakgrund Kattens trombocyter har egenskaper som gör att dagens automatiska och manuella hematologianalyser ofta ger falskt låg trombocyträkning (pseudotrombocytopeni). Trombocyträkningen (PLT) riskerar att bli missvisande låg på grund av att trombocyterna hos katter kan vara mycket större än trombocyterna hos övriga arter, samt för att katters trombocyter in vitro ofta är så lättaktiverade att aggregat bildas. En del av de största trombocyterna räknas inte av de automatiska hematologiinstrumenten (framför allt impedanstyper) och trombocytaggregat medför att trombocyterna blir ojämnt fördelade i blodprovet. Vid sant låga trombocytvärden kan livshotande blödningar uppstå och det är därför viktigt att kunna skilja katter med sann trombocytopeni från katter med falsk trombocytopeni. Trombocytaggregering har effektivt förhindrats med prostaglandin E1. Prostaglandin E1 är dock mycket instabilt i rumstemperatur, vilket medför att effekten lätt kan utebli vid felhantering. Nyligen presenterade en studie analogen iloprost. Iloprost är temperaturstabilt och lättare att använda. Den relativa volymen trombocyter i blodet (plateletkrit, PCT) var fysiologiskt och kliniskt mer viktig när stora trombocyter (makrotrombocyter) hittades hos hundrasen Cavalier King Charles Spaniel. Katter kan också ha makrotrombocyter, och därför skulle PCT kunna utgöra ett bättre test av trombocytstatus. PCT mäts direkt av hematologiinstrumentet QBC VetAutoread (IDEXX) och indirekt av hematologiinstrumentet Advia 2120 (Siemens). Syfte Syftet med denna studie var att förbättra trombocyträkningen hos katter, både sett till val av antikoagulans i blodprovrör och val av analysmetod. Fyra olika trombocyträkningsmetoder jämfördes för att utvärdera vilken metod som är bäst i olika situationer. Antikoagulans (EDTA utan annan tillsats (EDTA), EDTA med tillsats av prostaglandin E1 (PGE), EDTA med tillsats av iloprost (ILP)) undersökes avseende vilket/vilken kombination som medför lägst förekomst av trombocytaggregat och högst trombocyträkning. Hypotesen var att tillsats av iloprost i EDTA-rör i kombination med PCT eller optisk PLT skulle förbättra möjligheten till bedömning av katters sanna trombocytstatus. Omfattningen av trombocytaggregat på blodutstryk och i manuell räknekammare bedömdes och jämfördes mot minskningar i PLT, med målsättning att avgöra hur många aggregat som kan accepteras för att laboratoriepersonal ska kunna svara ut ett instruments trombocyträkning. Metoder Blod från 35 katter togs i EDTA-rör. När tillräcklig blodvolym erhölls blandades blodet så fort som möjligt med de trombocytaktiveringshämmande substanserna prostaglandin E1 respektive iloprost. Trombocyterna räknades med manuell räknekammare, Advia 2120 och med QBC VetAutoread. Plateletkrit presenterades direkt med QBC VetAutoread (redovisat i PLT) och indirekt med Advia. Förekomst av trombocytaggregat, sett till mängd och storlek, kontrollerades med manuell räknekammare och på blodutstryk. 1

8 Resultat Tillsats av iloprost förbättrade blodprovskvalitéten bäst. Det påvisades fler blodprover med många och stora trombocytaggregat med EDTA utan annan tillsats, än i blodprover med tillsats av iloprost eller prostaglandin E1. ILP hade lägst förekomst av trombocytaggregat. Trombocyträkningen påverkades negativt först vid omfattande aggregatbildning (av oss klassificerad som grad 3 och 4). Resultat från optisk flödescytometri visade att 8 av 34 katters blodprov fick tydligt högre trombocyträkning med iloprosttillsats än med EDTA utan annan tillsats. I samtliga dessa 8 fall hade EDTA-blodet hög förekomst av trombocytaggregat (grad 4). Med iloprosttillsats var korrelationen (r 2 ) i PLT mellan Advia och manuell räknekammare väldigt hög, 0,92 (n = 33). Motsvarande korrelation (r 2 ) med EDTA-blod utan annan tillsats var 0,85. När det förelåg omfattande trombocytaggregering redovisade manuell räknekammare högre PLT än Advia. Korrelationen (r 2 ) mellan Advia PCT ILP och Advia PLT ILP var lägre än förväntat. QBC PLT visade på lägst precision och korrelerade dåligt till både Advia PLT och Advia PCT. Slutsatser Tillsats av iloprost till EDTA hade större aktiveringshämmande effekt på trombocyter än både EDTA med tillsats av prostaglandin E1 och EDTA utan annan tillsats. Kombinationen EDTA och iloprost bedöms utgöra det bästa sättet för att minska risken för felaktig diagnostisering av trombocytopeni. Tillsats av iloprost är mycket billigare än tillsats av prostaglandin E1, och det är betydligt mer lätthanterligt. Med vårt graderingssystem för trombocytaggregering kan laboratorierna avgöra när en trombocyträkning kan svaras ut, trots förekomst av trombocytaggregat (grad 1 och 2). Tydligt negativ påverkan på PLT sågs endast i samband med omfattande aggregering. Vid god blodprovskvalitét fungerade Advia PLT bra. Vid tydlig trombocytaggregering är rekommendationen att ta om blodprovet med tillsats av iloprost. Manuell trombocyträkning i räknekammare tycktes påverkas mindre av trombocytaggregat än räkning med automatiska hematologiinstrument. Låg korrelation mellan Advia PLT och Advia PCT orsakades sannolikt av att MPV kan variera mycket inom denna djurart. Advia PCT bör ge en bättre bild av kattens trombocytstatus och det fysiologiska tillståndet, men fler studier krävs innan man kan fastställa vilken metod som kliniskt är mest betydelsefull. I framtiden kan blodprovrörtillsats med iloprost i kombination med PLT och/eller PCT från optiska instrument (som Advia) komma att utgöra det bästa alternativet för bedömning av trombocytstatus hos katt. QBC VetAutoread fungerade, enligt resultaten i denna studie, och i motsats till nyttan hos Cavalier King Charles Spaniel, inte bra för bedömning av trombocyter hos katt. 2

9 SUMMARY Background The platelets of the cat have traits that cause both automatic and manual methods to report falsely low platelet countings (psudothrombocytopenia). The platelet count can be misleadingly low because feline platelets often are much larger than platelets among other species, and because the platelets of the cat are easily activated in vitro to form aggregates. The largest platelets are missed by automatical hematology instruments, especially impedance types, and platelet aggregates means the platelets are not evenly distributed in the sample. When true thrombocytopenia is present, lifethreatening bleedings can develop. Therefore it is important to differ cats with true thrombocytopenia from cats with false thrombocytopenia. Formation of platelet aggregates have been successfully prevented with prostaglandin E1. However prostaglandin E1 is very instabile in room temperature, and incorrect handling of prostaglandin E1 can neutralize its effect. Recently a study recommended use of the analogue iloprost. Iloprost is temperature stabile, easier to handle and less likely to lose its effect. The relative volume of platelets in blood (plateletcrit in %) was more physiological and clinically important when large platelets (macrothrombocytes) were found in Cavalier King Charles Spaniel dogs. Cats also have macrothrombocytes, therefore plateletcrit may be a better test of platelet status. Plateletcrit is measured directly by the QBC VetAutoread (IDEXX) and indirectly by the Advia 2120 (Siemens). Objectives The goal of this study was to improve platelet counting among cats by comparing types of anticoagulation in blood collection tubes and different analytic methods. Four different methods for platelet counting were compared to see which gave the highest and most consistent results. The anticoagulation types (EDTA without other additive (EDTA), EDTA with additive of prostaglandin E1 (PGE), EDTA with additive of iloprost (ILP)) were evaluated to give the least formation of platelet aggregates and the highest platelet counts. The hypothesis was that an addition with iloprost in EDTA collection tubes, in combination with plateletcrit or optical platelet counting, would contribute to a higher, and more likely true, platelet count. The severity of platelet aggregation on a blood smear or in the manual bürker chamber was classified and compared to reduction in PLT with a goal of determining how many aggregates could be acceptable and permit a laboratory to report the instrument s PLT. Methods Blood from 35 cats was first collected into tubes containing EDTA. When sufficient blood was available it was divided into three parts and as quickly as possible mixed with iloprost respective prostaglandin E1. The platelets were counted with a manual bürker chamber, Advia 2120 and QBC VetAutoread. The plateletcrit was reported indirectly by the Advia, and directly by the QBC VetAutoread (though reported as PLT). The presence of platelet aggregates, with attention to both number and size, was determined with the bürker chamber and on blood films. 3

10 Results Addition of iloprost improved the blood sample quality best. There were more blood samples with many and large platelet aggregates with EDTA without another additive, than in blood samples with an additive with iloprost or prostaglandin E1. ILP blood had the fewest samples with aggregates. The platelet counting was overtly negatively affected only when there was extensive aggregate formation (grades 3 and 4 of our classification system). The results from the optical flow cytometry showed that 8 of 34 cat blood samples had clearly higher platelet counts with additive with iloprost than with EDTA with no additive. In all 8 cases, the EDTA blood had extensive aggregate formation (grades 4 of our classification system). Comparing samples with addition of iloprost as the best samples, the correlation (r 2 ) of PLT between Advia and the manual method was very good at 0,92 (n = 33). The correlation (r 2 ) was 0,85 with EDTA without another additive. When there was extensive platelet aggregation, the manual bürker chamber reported higher PLT than Advia. The correlation (r 2 ) between Advia PCT and Advia PLT was lower than expected. QBC PLT showed the greatest imprecision and the correlation to both Advia PLT and Advia PCT was low. Conclusions EDTA with additive of iloprost had a superior effect in inhibiting platelet activation than both EDTA with additive of prostaglandin E1 and EDTA without other additive. An additive of iloprost is considered to be the best alternative to reduce the risk of false diagnoses of thrombocytopenia. Addition of iloprost is much cheaper than prostaglandin E1, and it is much easier to handle. Our aggregation grading system should be useful for deciding when a laboratory may report a PLT despited mild aggregation (grades 1 and 2). Prominent decreases in PLT was only seen in connection with extensive platelet aggregation. With blood samples of good quality, the Advia PLT worked well. When extensive platelet aggregation occurs our recommendation is to resample the patient using ILP. Manual PLT appeared less affected by severe platelet aggregation than instrument PLT. Advia PLT and PCT gave different indications of platelet amount in the same samples. This was indicated by low correlation between Advia PLT and Advia PCT. The difference is likely influenced by great varies in MPV within this species. The Advia PCT may better reflect the feline platelet mass and physiologic response, but further work is needed to determine which method may be clinically most important. The optimal feline counting system for the future may be addition of iloprost in blood collection tubes in combination with PLT and/or PCT with optical methods (laser based flow cytometers like Advia). The QBC VetAutoread did, according to the results in this study, and in contrast to the use for Cavalier King Charles Spaniel dogs, not work well for evaluation of platelets among cats. 4

11 INLEDNING Nuvarande metoder för trombocyträkning av kattblod som tas i EDTA-rör ger ofta missvisande lågt resultat (pseudotrombocytopeni). Pseudotrombocytopenin beror bland annat på att katt-trombocyter in vitro är lättaktiverade vilket ökar risken för aggregatbildning. Trombocytaggregat har påvisats i över 50% av tagna blodprover (Norman et al., 2001a; Zelmanovic & Hetherington, 1998). Aggregat riskerar att registreras som leukocyter (Norman et al., 2001b), alternativt att inte registreras alls (Powell & Torrance, 2012). Kattens mean platelet volume (MPV) kan dessutom variera mycket (Weiser & Kociba, 1984; Zelmanovic & Hetherington, 1998). Varierande cellstorlek gör att somliga automatiska hematologiinstrument registrerar stora trombocyter som erytrocyter (Weiser, 1983; Welles et al., 1994; Norman et al., 2001a). Ibland är trombocyterna så stora att instrumenten inte upptäcker dem. Tasker et al. (1999, 2001) angav manuell hemacytometer som gold standard. Med manuell och optisk räkning kan man upptäcka stora trombocyter (Lilliehöök & Tvedten, 2009), men i och med att det blir omöjligt att identifiera individuella trombocyter påverkas även optisk och manuell metod negativt av aggregat (Norman et al., 2001a; Tasker et al., 2001). Sann trombocytopeni med värden < 200 x 10 9 /L tycks vara ovanligt hos katter. Med manuell bedömning av EDTA-blod har prevalensen uppskattats från 1,2% (Jordan et al., 1993) till 3,1% (Norman et al., 2001a). I och med att kraftig trombocytopeni kan orsaka livsfarliga blödningar är det viktigt att upptäcka sant låga värden. Med dagens tillgängliga hematologianalyser riskerar trombocytsvaret att negligeras med antagande att mätantalet sannolikt är falskt lågt. Svar om låg trombocyträkning kan även resultera i att veterinären finner det indikerat med ytterligare undersökningar, något som kan vara kostsamt för både djurägare och försäkringsbolag. Få men stora trombocyter, makrotrombocytopeni, har påvisats hos hundraserna Norfolk terrier (Gelain et al., 2010) och Cavalier King Charles Spaniel (CKCS) (Pedersen et al., 2001; Cowan et al., 2004). Trots lågt trombocytantal har hundarna en normal plateletkrit (PCT) (Bertalozzo et al., 2007; Tvedten et al., 2008; Gelain et al., 2010). PCT visar den totala massan trombocyter i blodet. För en välfungerande hemostas är det viktigare att ha normal trombocytmassa än ett normalt trombocytantal (Powell & Torrance, 2012). PCT föreslås vara den bästa metoden för att bedöma kliniskt relevant trombocytopeni hos CKCS (Bertalozzo et al., 2007; Tvedten et al., 2008). Syftet med denna studie var att förbättra trombocyträkningen (PLT) hos katt. En viktig del var att undersöka om PCT hos katt, liksom hos CKCS, ger en bättre bild av trombocytstatus än PLT. PCT bedömdes både med Advia 2120 (Siemens) och med QBC VetAutoread (IDEXX). En annan målsättning var att jämföra olika trombocyträkningsmetoder för att fastställa vilken som är mest trovärdig beroende på situation. Tidigare studier har visat att automatiska hematologiinstrument som klassificerar celler med hänsyn till både storlek och komplexicitet (optisk flödescytometri), som Advia 2120, är mycket bättre på att detektera stora trombocyter än automatiska hematologiinstrument som klassificerar celler efter enbart cellstorlek (impedans) (Tvedten et al., 2008; Lilliehöök & Tvedten, 2009; Tvedten & Johansson, 2010). 5

12 Stora trombocyter, och även trombocytaggregat, kunde även upptäckas med manuell räknekammare och på blodutstryk. I och med att korrekt trombocyträkning bara kan göras på kattblod utan aggregat (Norman et al., 2001a), tillsatte vi trombocytaktiveringshämmande medel, prostaglandin E1 respektive iloprost, till EDTA-rör. Antikoagulans/antikoagulans med tillsats som jämfördes var därmed EDTA utan annan tillsats (EDTA), EDTA med tillsats av prostaglandin E1 (PGE), respektive EDTA med tillsats av iloprost (ILP). Effekten av ILP och PGE utvärderades med hypotesen att de prover som hade dessa tillsatser skulle resultera i högre PLT och/eller högre PCT än EDTA. De olika analysmetoderna jämfördes med hypotesen att den metod som gav högst PLT eller högst PCT är den metod som närmast återspeglar djurets verkliga trombocytstatus. I och med att automatiska hematologiinstrument som Advia 2120 kan ha svårt att räkna större trombocyter hos katt, antogs att QBC med PCT är en bättre metod. Vid analys med Advia 2120 beräknas PCT indirekt utifrån instrumentets direkta förmåga att upptäcka trombocyter (storleksgräns 60 fl). Vid QBC är förhållandet tvärtom, med PCT som anges direkt och trombocytantalet indirekt. LITTERATURÖVERSIKT Trombocyter Trombocyter har en viktig roll i hemostasen. Cellerna är anukleära och bildas i benmärgen genom avknoppning från megakaryocyter. Megakaryocyter härstammar från stamceller som regleras av peptidhormonet trombopoietin (TPO). TPO bildas i levern. Hemostasen Hemostasen delas traditionellt in i primär och sekundär hemostas samt fibrinolys. Trombocyterna har en mycket viktig roll i den primära hemostasen vid bildning av en sårtäckande, men labil, plugg. Primära hemostasen Vid kärlskada blottas subendotelialt kollagen, och glatta muskelceller i kärlväggen stimuleras till vasokonstriktion. Blottning av kollagen stimulerar adhesion av trombocyter. Vasokonstriktion minskar blodflödet till området, vilket främjar både trombocytaggregering och trombocytadhesion. Intakta endotelceller intill kärlskadan frisätter ett enzym som omvandlar arachidonsyra till prostaglandinmetaboliten prostacyklin (Sjaastad et al., 2003). Prostacyklin bidrar till att motverka aggregering och begränsar därigenom trombocytpluggens storlek så att den inte sträcker sig för långt i kärlet. Sekundära hemostasen Sekundära hemostasen innebär stabilisering av trombocytpluggen till ett olösligt koagel. Ett koagel bildas med hjälp av koagulationsfaktorerna och deras slutprodukt, ett nätverk av fibrin. 6

13 Hemostasdefekter och blödningssymtom Blödningsrubbningar kan ha sitt ursprung i den primära eller i den sekundära hemostasen. Den vanligaste orsaken vid rubbning i den primära hemostasen är trombocytopeni (Nelson & Couto, 2009). Kärldefekter eller nedsatt trombocytfunktion orsakar sällan spontana blödningar hos katt. Blödningar som beror på avvikelser i den primära hemostasen yttrar sig annorlunda jämfört med blödningar som beror på avvikelser i den sekundära hemostasen (Nelson & Couto, 2009). Vid defekter i den primära hemostasen kan djuret uppvisa symtom som blödningar i och från hud och slemhinnor, exempelvis petechier, eccymoser, näsblod, hematuri, hematochezia och melena. Man kan även se förlängd blödningstid direkt efter blodprovstagning. Detta att jämföra med kliniska symtom vid defekter i den sekundära hemostasen varvid det är vanligare med hematom, blödningar in i leder, muskler och kroppshålor samt försenad blödning efter blodprovstagning. I en studie av Kohn et al. (2006) hade sju av 42 katter (17%) med trombocytopeni spontana blödningar. Dessa katter hade signifikant lägre trombocytantal (< 57 x 10 9 /L) än de katter med trombocytopeni som inte hade spontana blödningar. Jordan et al. (1993) fann spontana blödningar hos nio av 41 katter (22%) med trombocytopeni. Ofta hade dessa katter en trombocyträkning på < 30 x 10 9 /L. Trombocytopeni Det är vanligt att automatiska hematologiinstrument vid analys av kattblod varnar om trombocytopeni. I många fall är larmen dock falska (pseudotrombocytopeni) och beror på en kombination av aggregatbildning samt mätinstrumentets oförmåga att särskilja trombocyter från erytrocyter. I en studie om hundrasen CKCS fann Tvedten et al. (2008) att hematologisvar som larmar om trombocytopeni kan variera mellan 0-66% beroende på mätmetod. Sann trombocytopeni Gränsen för trombocytopeni hos katt definierades i två studier som < 200 x 10 9 trombocyter per liter blod (Jordan et al., 1993; Norman et al., 2001a). Resultaten baserades i båda studierna på manuell räkning i räknekammare eller på blodutstryk. Enligt den ena studien hade 1,2% av 3300 katter trombocytopeni (Jordan et al., 1993), medan prevalensen i den andra studien bedömdes till 3,1% bland 256 katter (Norman et al., 2001a). Trombocytopeni kan bero på minskad produktion i benmärgen, ökad förbrukning eller ökad nedbrytning (Nelson & Couto, 2009). Sjukdomar associerade med trombocytopeni hos katt är bland annat infektioner, neoplasier och immunmedierade tillstånd (Jordan et al., 1993). Individer med infektionsassocierad trombocytopeni tycks i regel vara yngre än de katter vars trombocytopeni kan relateras till tumörer. Infektionssjukdomarna orsakas bland annat av felint leukemivirus (FeLV), felint coronavirus (FCoV), felint immunbristvirus (FIV) och felint panleukopenivirus (FPLV). Identifierade neoplasier är bland annat leukemi och hemangiosarkom. Norman et al. (2001a) fann, utöver sambandet till neoplasier och infektionssjukdomar, även katter vars trombocytopeni kunde relateras till kemoterapi. 7

14 Disseminated intravascular coagulation, DIC, har konstaterats hos 12% av katter med låga trombocytvärden (Jordan et al., 1993). Tecken på sekundär immunmedierad trombocytopeni har återfunnits hos trombocytopeniska katter med antikroppar riktade mot sina trombocyter (Kohn et al., 2006). Hos somliga av dessa katter påvisades samtidig infektionssjukdom eller neoplasi. Infektionssjukdomar orsakades bland annat av virus som FIV, FeLV eller FCoV, nybildningar utgjordes av lymfom eller leukemi. Pseudotrombocytopeni Svårigheter med trombocyträkning har rapporterats förekomma med flera olika mätmetoder. I ett flertal studier har man jämfört metoderna sinsemellan i försök att utvärdera vilken som presenterar en trombocyträkning närmast det sanna antalet. Bland flertalet av våra husdjur är trombocyterna markant mindre än erytrocyter, med ett volymförhållande på 1:10 (Sjaastad et al., 2003). Enligt blodutstryk kan dock storleken på kattens trombocyter variera mycket (Weiser & Kociba, 1984). I en studie såg man på fyra av sex blodutstryk (66,7%) signifikant överlappande cellstorlek mellan trombocyter och erytrocyter (Zelmanovic & Hetherington, 1998). Här fann man även, med flödescytometri omfattandes 48 katter, att mean platelet volume (MPV) var signifikant högre för aggregerade trombocyter (18,3 ± 2,6 fl) jämfört med MPV för icke aggregerade trombocyter (14,2 ± 1,3 fl) (P < 0,0001). Även Norman et al. (2001b) har demonstrerat att oaggregerade trombocyter har lägre MPV. Prevalensen aggregat i kattblodprov har rapporterats vara > 50% (Norman et al., 2001a) och 67% (Zelmanovic & Hetherington, 1998). Varierande trombocytstorlek och förekomst av aggregat gör det svårt för automatiska hematologiinstrument att typbestämma och räkna cellerna. Impedansmätning, som delar in celler efter bara cellstorlek, tycks till exempel ge mindre tillförlitlig trombocyträkning än optisk mätning (Tvedten et al., 2008; Lilliehöök & Tvedten, 2009; Tvedten & Johansson, 2010). Ytterligare faktorer som har föreslagits påverka trombocyträkningen är provtagningssätt, typ av antikoagulans i provtagningsröret, tillsats av trombocytaktiveringshämmande medel, och förvaringstid innan analys. Förvaringstid tycks inte ha negativ påverkan på trombocyträkningen. Weiser & Kociba (1984) fann att trombocyträkningen i blod taget med EDTA-rör sjönk under fyra timmars förvaring, men sambandet var inte signifikant. När man i en annan studie jämförde resultaten på skickade blodprov tagna i EDTA-rör med prover som hade analyserats under provdagen, fann man ingen korrelation mellan förvaringstid och sjunkande trombocyträkning (Norman et al., 2001a). Beträffande provtagningssätt tyder nyare forskning på att det inte har någon påverkan på aggregering och trombocyträkning (Riond et al., 2012b). Makrotrombocytopeni hos Cavalier King Charles Spaniel En hög andel CKCS har få men stora trombocyter (Pedersen et al., 2002; Cowan et al., 2004), ett tillstånd kallat makrotrombocytopeni (Pedersen et al., 2002). Trombocytantalet har hos CKCS med makrotrombocyter påvisats vara signifikant lägre än hos CKCS med normalstora 8

15 trombocyter (Cowan et al., 2004). För att hemostasen ska fungera bra är det dock viktigare med en normal total trombocytmassa (PCT) än ett visst trombocytantal (Powell & Torrance, 2012), och tillståndet med makrotrombocytopeni ska inte vara relaterat till ökad blödningsbenägenhet (Pedersen et al., 2002; Cowan et al., 2004; Bertalozzo et al., 2007). Med manuell hemacytometer har prevalensen trombocytopeni (< 100 x 10 9 /L) hos CKCS påvisats vara mellan 51% (Cowan et al., 2004) och 56% (Pedersen et al., 2002). Strax över 30% har makrotrombocyter (Cowan et al., 2004; Bertalozzo et al., 2007). I en studie om CKCS och makrotrombocyter jämförde man trombocyträkningen vid mikroskopundersökning med de tre hematologiinstrumenten impedans, lasercellsmätning och QBC VetAutoread (Bertalozzo et al., 2007). QBC, som anger trombocytantal efter blodprovets PCT, gav signifikant högre PLT än övriga metoder. Skillnaden i de olika metodernas förmåga att räkna trombocyter framgick tydligast när man jämförde impedans med QBC (Tabell 1). Tabell 1. Jämförelse av trombocyträkningsresultat hos CKCS, sett till val av hematologiinstrument (efter Bertalozzo et al., 2007) Hematologimetod Trombocyträkning, median (x10 9 /L) Andel (%) CKCS med PLT < 100 x 10 9 /L Impedans ,1 QBC 292 5,8 Tvedten et al. (2008) bekräftade att QBC är bättre än impedans vid bedömning av trombocytstatus hos CKCS. Enligt ett impedansinstrument hade 44% av deltagande CKCS ett trombocytantal på < 10 x 10 9 /L, medan ingen av hundarna hade trombocytopeni enligt QBC. För att identifiera CKCS med sann trombocytopeni kan trombocyträkning som baseras på PCT vara den bästa analysmetoden (Bertalozzo et al., 2007; Tvedten et al., 2008), för trots låg PLT kan CKCS ha normal PCT (Bertalozzo et al., 2007). Nyligen visade man att även Advia 2120 kan göra en relativt säker PCT-bedömning hos CKCS (Tvedten et al., 2012). För CKCS med de allra största trombocyterna hände det dock att instrumentet redovisade en sannolikt falskt låg PCT. Automatisk och manuell trombocyträkning Enligt studier har även trombocyträkning på kattblod varierat beroende på mätmetod. Mätmetoder som har studerats är bland annat automatiska hematologinstrument som impedans, optisk flödescytometri och QBC, och manuella metoder som räknekammare och blodutstryk. Impedansmätning I en av studierna om olika trombocyträkningsmetoder hos CKCS analyserade man deltagande hundars blodprover med impedansmätning, optisk mätning, QBC och manuell räkning, varefter resultaten jämfördes (Tvedten et al., 2008). Av de sex metoder som användes gav de två impedansinstrumenten (Sysmex XT-2000iV och CELL-DYN 3500) de lägsta trombocyträkningarna. Även Gelain et al. (2010) dokumenterade att impedansanalys av makrotrombocyter kan ge falskt låg trombocyträkning, sannolikt på grund av att stora 9

16 trombocyter kan missbedömas som erytrocyter. Makrotrombocyterna identifierades i detta fall inom en grupp Norfolk terriers. Vid analys av kattblod har liknande resultat erhållits. I en retrospektiv studie med blod från 359 katter hade 71%, enligt impedansmätning, trombocytopeni med < 200 x 10 9 /L (Norman et al., 2001a). Vid jämförelse på blodutstryk fann man i stället en trombocytopeniprevalens på 3,1%. Pseudotrombocytopeni förelåg således hos 68,2%. Att impedansinstrument ofta ger falskt låg trombocyträkning antogs bero på en kombination av trombocytaggregat och cellindelning baserad på enbart cellstorlek. Tasker et al. (2001) fann att impedansräkning av trombocyter i EDTA-blod hade hög sensitivitet men låg specificitet för detektion av trombocytopeni. Många av studiens katter fick ett resultat förenligt med trombocytopeni, trots ett normalt trombocytantal. Optisk flödescytometri Optisk flödescytometri sorterar, till skillnad från impedansinstrument, inte bara celler efter storlek. Den ser även till cellens refraktära index (Figur 1). Genom detta ska trombocyter skiljas från erytrocyter i högre utsträckning. Att fler stora trombocyter inkluderas i räkningen vid optisk flödescytometri än vid impedansmätning har bekräftats i flera studier (Tvedten et al., 2008; Lilliehöök & Tvedten, 2009; Tvedten & Johansson, 2010). Med det optiska hematologiinstrumentet Advia 2120 kan man indirekt även få ut PCT, baserat på PLT och MPV. Trombocyter upp till storleken 60 fl ska registreras. Figur 1. Cytogram från det optiska flödescytometriinstrumentet Advia Varje blå prick motsvarar en trombocyt. Ökande cellstorlek redovisas på den vertikala axeln, medan ökande cellkomplexicitet redovisas på den horisontella axeln. Quantitative Buffy Coat Quantitative buffy coat (QBC) VetAutoread är ett hematologiinstrument vars trombocyträkning baseras på blodprovets relativa trombocytvolym, plateletkrit (PCT). PCT anges i %. QBC svarar dock ut i PLT x 10 9 /L, utifrån sambandet PCT = PLT x MPV, där MPV har standardiserats för varje djurslag. Mätning av trombocytmassan sker efter centrifugering av blod i hematokritrör. Centrifugeringen gör att celler av olika densitet hamnar i olika lager (Figur 2). Blodcellerna färgas in med acridinorange och fluorescerar sedan olika. 10

17 Figur 2. Centrifugerade QBC hematokritrör från tre olika katter. Längst till vänster återfinns erytrocyter (mörkrött och rött område). Därefter följer buffy coat med leukocyter (orange område) och trombocyter (gult område innan ljusrosa plastflotör). Bredden av trombocytlagret används till att bedöma PCT och sedan PLT. Till höger om plastflotören syns plasman. Översättningen från plateletkrit till trombocytantal blir dock endast korrekt om trombocyterna hos den enskilda individen är av samma storlek som djurslagets standardiserade medelstorlek (Tvedten et al., 2008). CKCS med makrotrombocyter har med QBC fått en normal trombocyträkning (Bertalozzo et al., 2007; Tvedten et al., 2008), och Bertalozzo et al. (2007) menar att trombocyträkningen hos sådana hundar sannolikt är falskt hög. I studien om Norfolk terriers med makrotrombocyter blev QBC-instrumentets trombocyträkning signifikant högre än både mikroskopisk undersökning och impedans (Gelain et al., 2010). Hos katt har QBC VetAutoreads specificitet och sentitivitet för detektion av trombocytopeni bedömts vara 97,4% respektive 44,4% (Tasker et al., 2001). Detta tolkades innebära att katter med normalt trombocytantal ofta identifieras, medan katter med sann trombocytopeni i stället riskeras att missas. Manuell räkning Manuell bedömning av trombocyter kan ske med manuell räknekammare (Figur 3) och med blodutstryk. Med båda metoderna kan man uppskatta antalet trombocyter, bedöma dess morfologi som storlek och tecken på aktivitet, samt notera eventuell förekomst av trombocytaggregat. På blodutstryk återfinns trombocytaggregat huvudsakligen i fransen. Blodutstryk har föreslagits vara en snabb och enkel metod för trombocyträkning (Tasker et al., 1999), och hos katt har manuell metod även angetts som gold standard (Tasker et al., 1999; Tasker et al., 2001). För att identifiera katter med sann trombocytopeni rekommenderade Norman et al. (2001a) blodutstryk framför impedans. Vid jämförelse med optisk räkning på prover utan trombocytaggregat har dock räkning på blodutstryk sämre precision (Tvedten, H., pers. medd., 2012). En nackdel med manuell räknekammare är att trombocytaggregat kan missas om de är ojämnt spridda i blodprovet (Lilliehöök & Tvedten, 2009). 11

18 Figur 3. Fotografi av ett synfält från en manuell räknekammare. I förstoringen till vänster syns en stor cell med granulerad kärna (leukocyt). Runt leukocyten ser man celler med ljus ytterkant och mörkare centrum (erytrocyter). De tre ljusa cellerna med homogent cytoplasmainnehåll motsvarar tre trombocyter av varierande storlek (se pilar). Antikoagulans och trombocytaktiveringshämmande medel EDTA EDTA är det antikoagulans som är mest använt. Koagulering förhindras genom att Ca 2+ binds upp (Jones, B., 2010). Ca 2+ behövs för koagulationsfaktorerna i den sekundära hemostasen. Prostaglandin E1 Prostaglandin E1 är en värmekänslig metabolit av arachidonsyra. Vid tillsats av prostaglandin E1 i antikoagulans trisodiumcitrat 3,8%, blev katt-trombocyter omedelbart och persisterande motståndskraftiga för aktivering av agonisterna ADP och kollagen (Welles et al., 1994). Aggregering förhindrades och trombocyträkningen förbättrades. Även Tvedten & Johansson (2010) fann att antikoagulanstillsats med prostaglandin E1 förbättrar trombocyträkningen hos katter i kliniska situationer. I denna studie användes kombinationen prostaglandin E1 och EDTA. Trombocyträkning på blod taget i EDTA med tillsats av prostaglandin E1 blev högre både vid analys med optisk cytometri och med impedans, jämfört med när bara EDTA hade använts. Allra högst trombocytantal erhölls genom antikoagulans EDTA med tillsats av prostaglandin E1 och analys med optisk räkning, vilket därmed föreslogs vara gold standard för att vid misstanke bekräfta sann trombocytopeni hos katt. Iloprost Iloprosttrometamol verkar, liksom som den endogena substansen prostacyklin, hämmande på trombocytaggregering (Fass, 2012). På kongressen International Society for Animal Clinical Pathology i Ljubljana, Slovenien, juli 2012, presenterades en studie i vilken man hade provtagit katter med vanliga EDTA-rör samt med EDTA-rör med tillsats av iloprost (Riond et 12

19 al., 2012a). Blodet analyserades med både automatisk och manuell räkning. Man fann att iloprost tillsammans med EDTA är mycket effektivt mot aggregatbildning i kattblod. I blod som hade samlats i EDTA-rör utan iloprost var förekomsten pseudotrombocytopeni 50%. Allt blod som hade samlats i EDTA-rör med iloprost fick trombocytvärden inom normalt referensintervall. MATERIAL OCH METODER Studiepopulation och blodprover Ett venöst blodprov togs från 33 sjuka och 10 friska katter, huvudsakligen från vena cephalica, i enstaka fall från vena jugularis. Kanylstorlek och provtagningssätt var inte standardiserat. Blodflödet bedömdes vid samtliga tillfällen av en och samma person, och klassificerades som något mindre bra än önskvärt, bra, bättre än bra eller mycket bra. Prover där blodflödet in i provröret var mycket långsamt användes inte i studien, och antalet blodprover som analyserades för studien blev 35 stycken. På grund av tissue factors medverkan i koagulationen försökte man undvika att samla de första dropparna efter kanylstick. Målsättningen var att få minst 2,5 ml blod per individ. I enstaka fall erhölls endast runt 1,5 ml. De sjuka katterna provtogs endast i samband med sjukdomsutredning på Universitetsdjursjukhuset, SLU. Friska katter fick deltaga under förutsättning att de vid blodprovtagningstillfället inte hade någon känd sjukdom med allmänpåverkan och inte stod på NSAID- eller kortisonbehandling. En fullständig hematologi gjordes ur vilken man hade möjlighet att fånga upp eventuella tecken på pågående sjukdom. Projektet var godkänt av djurförsöksetiska nämnden och medverkan skedde efter frivillig anmälan av katternas ägare. Antikoagulans och trombocytaktiveringshämmande medel EDTA är den typ av antikoagulans som är vanligast för hematologisk profil. Med anledning av detta valdes, i stället för CTAD eller citrate, EDTA även för dessa analyser. I början av studien lät man blodet rinna ned i ett med iloprost 2-4µL (Ilomedin 20µg/ml) förpreparerat 0,5ml EDTA-rör (ILP) samt ett opreparerat 2ml EDTA-rör (EDTA). EDTA-röret med tillsats av iloprost fylldes med blod innan röret med EDTA utan annan tillsats. De två blodprovsrören vickades varsamt gånger så att blodet skulle blandas med EDTA utan annan tillsats respektive med EDTA med tillsats av iloprost. I fall när en blodvolym om minst 1,4ml uppskattades ha erhållits i röret med EDTA utan annan tillsats, pipetterade man efter vickning över minst 0,6ml blod till ett eppendorfrör förpreparerat med prostaglandin E1-etanollösning (100µg i 20µL etanol) och vaggade detta (PGE) gånger. På grund av att prostaglandin E1 inaktiveras av värme förvarades förpreparerade prostaglandin E1-rör i frys (-18 C) tills information om nära förestående blodprovstagning. Under perioden mellan uttagning från frys och blodprovstagning transporterades röret med prostaglandin E1 i en frigolitlåda med kylklampar. Röret med prostaglandin E1 togs fram för tining inom en minut efter blodprovstagning och inom samma tidsram fördes delar av blodet från EDTA utan annan tillsats över till röret med prostaglandin E1 (PGE). 13

20 Efter blodinsamling från sju katter övergick man vid provtagning till att låta hela blodprovsvolymen rinna ned i ett opreparerat 2-3 ml EDTA-rör (EDTA). EDTA vaggades gånger. Därefter fördelades blodet, inom tre minuter från provtagning, mellan EDTA samt ett kryo- eller eppendorfrör förpreparerat med 2µL iloprost, respektive ett eppendorfrör förpreparerat med prostaglandin E1. Rören med iloprost och prostaglandin E1 vaggades varsamt gånger vardera så att blodet blandades med tillsatserna. EDTA-rör med tillsats av iloprost respektive kryorör och eppendorf med iloprost förvarades under hela studieperioden i rumstemperatur. Nypreparering av rör med iloprosttillsats 2µL skedde kontinuerligt. Analyser Samtliga blodprover avsågs att analyseras med Advia 2120 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA), QBC VetAutoread (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA) och manuell räknekammare (Hecht, Sondheim, Tyskland) inom tre timmar. Blodutstryk gjordes inom två timmar. Provhanteringen var inte blindad. Manuell räknekammare och Advia 2120 utfördes av biomedicinska analytiker (BMA). Statistik beräknades med Microsoft Excel Manuell räknekammare Blodet späddes med leucoplate (Sobioda, Montbonnet, France), spädning 1:20, blod:spädningsvätska. Provspädningen fick stå i 20 minuter för erytrocytlysering. Därefter fördes en droppe av provspädningen över till räknekammaren, som i sin tur fick stå i en fuktig kammare i 20 minuter för sedimentering av trombocyterna. Efter sedimentering bedömdes trombocyterna i ett ljusmikroskop med 40x förstoring. Totalantalet trombocyter räknades i 16 CD-rutor, och antalet trombocytaggregat räknades i hela klacken. Blodutstryk Blodutstryken färgades med Giemsa. Bedömning av blodprovskvalitéten gjordes genom kontroll och räkning av eventuella trombocytaggregat i fransen och i fem stycken monolayerområden. Fransarna bedömdes med förstoring 4x och 10x. Aggregat som bestod av 5-20 trombocyter definierades som små till mellanstora. Aggregat som bestod av > 50 trombocyter definierades som stora. Blodprovskvalitén i fransen klassificerades sedan enligt tabellen nedan (Tabell 2). 14

21 Tabell 2. Klassificering av blodprovskvalitét sett till antal trombocytaggregat i blodutstrykets frans Trombocytaggregat Klassificering Avsaknad av synliga aggregat 0 < 5 små till mellanstora aggregat 1 > 5 små till mellanstora eller 1-2 stora aggregat stora aggregat 3 > 10 stora aggregat 4 Fem stycken monolayerfält per blodutstryk bedömdes med förstoring 100x med immersionsolja. Aggregat som bestod av 3-5 trombocyter definierades som små. Aggregat som bestod av > 5 trombocyter definierades som stora. Blodprovskvalitén klassificerades sedan enligt tabell 3. Slutlig bedömning av monolayer erhölls genom att beräkna genomsnittet trombcytaggregat i dessa fem monolayerfält. Tabell 3. Klassificering av blodprovskvalitét sett till genomsnittet trombocytaggregat från fem monolayerfält Trombocytaggregat Klassificering Avsaknad av aggregat 0 < 2 små aggregat små eller < 2 stora aggregat stora aggregat 3 > 5 stora aggregat 4 När resultat från Advia och manuell räknekammare indikerade eventuell trombocytopeni kontrollräknades antalet trombocyter i tio stycken fält från monolayer, förstoring 100x med immersionsolja. Genomsnittet trombocyter multiplicerades med faktor 15 för att få ungefärligt antal (x10 9 ) trombocyter per liter blod (Webb et al., 2004). RESULTAT Sammanlagt provtogs 43 katter, varav 35 blodprov analyserades för studien. Exkluderade prover valdes bort på grund av mycket långsamt blodflöde eller alldeles för liten blodvolym i provröret. I de fall man bara fick ut omkring 1,5 ml blod fördelades blodet mellan två av tre antikoagulantia. Advia och blodutstryk gjordes på samtliga prover. På grund av begränsad tillgång till BMA fick man på en katts blod bortprioritera manuell räknekammare. Vid analys med QBC gick ett hematokritrör med ILP sönder och i ett annat fall erhölls, på grund av tekniska fel, inget värde alls på PGE. QBC-resultaten kunde ofta flagga för att trombocyträkningen inte var korrekt, i dessa fall kördes proven om tills dess att instrumentet visade att slutlig trombocyträkning var fastställd ( = ). QBC-resultat utan fastställd PLT användes inte vid de statistiska beräkningarna. För översikt av antal erhållna blodprovsresultat, se tabell 4. 15

22 Tabell 4. Sammanställning av analyserade prover (antal) Metod Antikoagulans Advia Blodutstryk Räknekammare QBC QBC = EDTA EDTA + PGE EDTA + ILP Antikoagulans inverkan på trombocytaggregering Enligt blodutstryken hade EDTA-blod utan annan tillsats (EDTA) högre förekomst av många och stora trombocytaggregat än både EDTA-blod med tillsats av prostaglandin E1 (PGE) och EDTA-blod med tillsats av iloprost (ILP) (Figur 4a). EDTA hade även flest blodprover med aggregatklassificering 2 i monolayerområdet och var här den enda med ett blodprov som hade aggregatklassificering 3 (Figur 4b). Lägst förekomst av aggregatklassificering 4 i fransen och högst frekvens av aggregatklassificering 0 i monolayer hade ILP. Inget antikoagulans lyckades förhindra trombocytaggregering helt och hållet. Figur 4a. Förekomst av trombocytaggregat på blodutstrykens frans hos katter där samtliga tre antikoagulans användes. N =

23 Figur 4b. Förekomst av trombocytaggregat i blodutstrykens monolayerområde hos katter där samtliga tre antikoagulans användes. N = 31. Advia trombocyträkning och Advia plateletkrit Trombocyträkning med Advia visade att åtta katters blodprov redovisade tydligt lägre trombocyträkning (PLT) när EDTA användes jämfört med ILP (Figur 5a). Differensen mellan PLT ILP och PLT EDTA var i dessa fall mellan x 10 9 /L. Skillnad mellan PLT ILP och PLT EDTA användes som ett sätt att mäta storleken av trombocyträkningsfel orsakat av aggregat. I två fall hade PGE markant lägre PLT än ILP, 71 x 10 9 /L respektive 267 x 10 9 /L. I det senare fallet var orsaken sannolikt att prostaglandinröret hade värmeinaktiverats under felhantering. I figur 5b presenteras blodprovens PCT i samma ordning som figur 5a och man kan se att PCT inte alltid följer PLT. Hos sex katter var PCT EDTA tydligt lägre än PCT ILP. I ett fall var PCT PGE tydligt lägre än PCT ILP. 17

24 Figur 5a. Trombocyträkningsresultat från Advia. Samtliga prover redovisas. N EDTA = 34, n PGE = 32, n ILP = 35. Katterna är arrangerade från lägsta till högsta PLT ILP. Figur 5b. Plateletkritresultat från Advia. Samma prover som i Figur 5a redovisas, i stigande ordning från lägsta till högsta Advia PLT ILP. Korrelationskoefficienten (r) mellan PCT ILP och PLT ILP var 0,75, korrelationen (r 2 ) 0,57 (Figur 6). 18

25 Figur 6. Graden av linjärt samband mellan Advia PCT och Advia PLT. N = 35. När skillnaden i trombocyträkning med ILP jämfört med EDTA var tydlig (> 60 x 10 9 /L), hade EDTA-blodet enligt blodutstrykens frans många och stora aggregat (Figur 7). I de fall PLT EDTA var högre än PLT ILP (negativt värde på y-axeln), var skillnaden i trombocyträkning inte lika stor och det fanns heller inget fall som kunde relateras till att ILPblodet hade högsta aggregatklassificering (samband ej redovisat i diagramform). Figur 7. Sambandet mellan stor skillnad i PLT ILP och PLT EDTA och hög aggregatklassificering enligt blodutstrykets frans på EDTA-blod. N =

26 Figur 8a och 8b visar två peroxidas leukocytcytogram från Advia Analyserna är gjorda på en och samma katts blod, provtaget vid ett tillfälle men med olika antikoagulans. Prickarna med olika färger motsvarar instrumentets registreringar av olika celltyper, varav de svarta prickarna utgåendes från det nedre vänstra hörnet representerar trombocyter och trombocytaggregat. De svarta prickarna högre upp på y-axeln är aggregat. Figur 8a (vänster) och figur 8b (höger). Peroxidascytogram från Advia 2120 som återger skillnad i mängden trombocytaggregat. Blodet som har analyserats är taget från en och samma katt vid ett tillfälle men med olika antikoagulans. Cellstorlek är på y-axeln och peroxidasfärg på x-axeln. Figur 8a (vänster) visar resultatet från blod taget med EDTA utan annan tillsats. I detta prov finns det stora mängder trombocytaggregat (svarta prickar innanför en gul oval markering). Figur 8b (höger) visar resultatet från blod med tillsats av iloprost. Mängden aggregat var betydligt färre. Manuell räknekammare och trombocyträkning PLT med manuell räknekammare redovisade mindre variation i trombocyträkningsresultat mellan olika antikoagulans än trombocyträkningen med Advia eller QBC (Figur 9). Fyra prover visade på tydligt lägre PLT med EDTA än ILP (differens x 10 9 /L). 20

27 Figur 9. PLT med manuell räknekammare. N EDTA = 33, n PGE = 31, n ILP = 34. På en av de 35 katternas blodprov gjordes ingen manuell räkning på någon av substanserna. Katterna arrangerade efter lägsta till högsta Advia PLT ILP. QBC VetAutoread och trombocyträkning QBC VetAutoread flaggade ofta. Ibland var det även tekniska problem med instrumentet. Dessa faktorer medförde att ett och samma blodprov ofta fick köras flera gånger, med målsättning att instrumentet skulle visa att det hade fastställt blodprovets trombocytvärde ( = ). Antalet katter som man erhöll slutgiltig QBC PLT hos varierade per antikoagulans (Figur 10, Tabell 4). 21

28 Figur 10. PLT med QBC VetAutoread. Endast katter med slutgiltig PLT ( = ) redovisas. Katterna är arrangerade från lägsta till högsta Advia PLT ILP. Slutgiltig trombocyträkning ( = ) på samtliga tre antikoagulans när instrumentet inte flaggade ( ---, # eller > ) eller hade tekniska fel, erhölls i 22 av 35 fall. För övriga 13 katter saknades antingen en slutgiltig trombocyträkning, eller så räckte inte blodet till både EDTA, PGE och ILP. PLT-räkningen varierade mer mellan de olika substanserna vid analys av QBC än med Advia och manuell räknekammare (Figur 11a). Skillnad i trombocyträkning mellan ILP och EDTA kunde inte förklaras med att EDTA-blodet hade ökat antal trombocytaggregat (Figur 11b). 22

29 Figur 11a presenterar trombocyträkningen hos 22 av 35 katter där slutgiltig trombocyträkning med alla tre antikoagulans erhölls. Katterna är ordnade från lägsta till högsta PLT ILP. Figur 11b visar förhållandet mellan skillnad i trombocyträkning mellan ILP och EDTA och blodprovskvalitén hos EDTA enligt blodutstrykets frans. Endast katter med slutgiltig trombocyträkning med ILP och EDTA redovisas. N = 28. Metodjämförelse Jämförelse av trombocyträkning (PLT) på EDTA-blod med tillsats av iloprost med QBC, Advia och manuell räknekammare visade på högst korrelationkoefficient mellan Advia och manuell räknekammare (0,97) (Figur 12). Graden av linjärt samband mellan QBC och Advia 23

30 var 0,82, och mellan QBC och manuell räknekammare 0,80. QBC PLT var ofta högre än PLT med Advia och manuell räknekammare. Figur 12. ILP-blod analyserat med QBC, Advia och manuell räknekammare. Endast de QBC-resultat när instrumentet har gett en slutgiltig ( = ) trombocyträkning redovisas. I ett fall genomfördes inte manuell räknekammare. N = 31. Korrelationskoefficienten (r) mellan manuell räknekammare och Advia vid trombocyträkning med EDTA-blod var 0,92 (Figur 13a). Antalet katter som redovisas är 33 av 35. Vid ett tillfälle genomfördes inte manuell räknekammare. För en annan katt kunde EDTA, på grund av otillräcklig blodvolym i provröret, inte analyseras över huvud taget. I 20 av 33 fall presenterade Advia PLT (A) högre än PLT med manuell räknekammare (M) (negativ M-A) (Figur 13b). I resterande fall presenterade manuell räknekammare högre PLT än Advia (positiv M-A). I samtliga fall då manuell räknekammare redovisade > 50 x 10 9 /L högre än Advia hade blodet aggregatklassificering 4. Variansvidden högsta negativa M-A till högsta positiva M-A var