P R O D U K T I N L A G A

Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 USA Tel: +1.203.328.9500 eller 888.329.0255 (i USA och Kanada), Fax: +1.203.328.9599 WWW.IMMUCOR.COM Produktdokumentation och översättningar finns tillgängliga på: www.immucor.com LIFECODES SSO HLA-nollalleltypningssats För in vitro-diagnostik INNEHÅLLSFÖRTECKNING Beskrivning av symbolerna... 1 Bruksanvisning... 4 Satser/reagenser enligt katalognummer... 2 A. Rening av genomiskt DNA... 4 Användningsområde... 2 B. DNA-förstärkning (PCR)... 4 Översikt och förklaring... 2 C. Hybridisering... 5 Procedurens principer... 2 D. Provanalys med Luminex Instrument... 5 Reagenser... 3 Resultat... 5 A. Identifiering... 3 Kvalitetskontroll... 6 B. Varningar och försiktighetsåtgärder... 3 Procedurens begränsningar... 6 C. Förvaringsanvisningar... 3 Felsökning... 7 D. Rening eller användningsbehandling... 3 Förväntade värden... 7 E. Instabilitetsindikatorer... 3 Specifika prestandaegenskaper... 7 Instrumentkrav... 3 Referenser... 7 Provtagning och förberedelse... 3 Begränsade licenser... 7 Procedur... 3 Använda varumärken... 8 A. Tillhandahållet material... 3 Bilaga A... 8 B. Material som behövs, men inte tillhandahålls... 3 C. Ytterligare material som användaren ska tillhandahålla... 3 P R O D U K T I N L A G A Gelelektrofores... 8 Geltolkning... 8 BESKRIVNING AV SYMBOLERNA (produktetiketter och bilagor) Lot nummer Katalog- nummer Temperaturbegräsningar Övre temperatur gräns Använd före Skyddas mot ljus Tillräckligt för N-tester Får inte frysas Observera Se bruksanvisningen Se handhavandebeskrivningen Tillverkare Auktoriserad representant i Europeiska Gemenskapen Fara Sida 1 av 8 LC1437CESV.3 (05/15)

REAGENSER MED KATALOGNUMMER LCT -N LIFECODES SSO HLA-nollalleltypningssats, Produktnr. 628939 LC-N LIFECODES HLA-nollalleltypningssats för användning tillsammans med Luminex Produktnr. 629100-50 Fyllnadsvolym Reagens Produktnummer Förvaring 50 MX-N1 MX-N2 LIFECODES nollallelklass 1 - huvudblandning 629001 870 µl 2 till 8 C LIFECODES nollallelklass 2 - huvudblandning 629002 870 µl 2 till 8 C BM-N LIFECODES nollallel Sondblandning 629003 810 µl x 2 2 till 8 C Förvaras mörkt DS Förtunning 628515 19,7 ml 18 till 30ºC Räcker till 50 tester TAQ LIFECODES Taq-polymeras 628075 25 µl x 2-10ºC till -30ºC Sondblandningarna är ljuskänsliga. Undvik ljus i görligaste mån. OBSERVERA: Använd inte produkterna efter utgångsdatum. OBSERVERA: Avvikelser från det rekommenderade protokollet och material som krävs inklusive LIFECODES Taq-polymeras har inte validerats. ANVÄNDNINGSOMRÅDE DNA-typning av klass I- och klass II-alleler. Används tillsammans med LIFECODES HLA SSO typningssatser. ÖVERSIKT OCH FÖRKLARING DNA-baserad HLA-typning med PCR-förstärkt DNA är en vanlig laboratorieprocedur. PCR-förstärkning av DNA används i syfte att anrika en viss DNA-region. Vid HLA-typning används en efterföljande analys som ska fastställa egenskaperna hos förstärkt DNA. Flera analystyper, som t ex. SSP (1), direkt SSOP (2), RFLP (3) och omvänd SSOP punktblottningsteknik (4) har använts vid HLA-typning. LIFECODES HLA-SSO typningssats använder, precis som SSOP och omvänd punktblottningsteknik, sekvensspecifika oligonukleotider (SSO) för att identifiera de HLA-alleler som förekommer i ett PCR-förstärkt prov. Det är SSOsatsen och inte metoderna som avgör förmågan att urskilja olika alleler i ett PCR-förstärkt prov. Medan omvänd punktblottningsteknik och SSOP används enzymetiketter och kolorimetriska substrat som kräver vidareutveckling, är LIFECODES-analysen är ett homogent multiplexsystem. Det innebär att SSOanalyserna sker samtidigt och hela analysen utförs i ett och samma reagensrör med tillsats av en enskild reagens. PROCEDURENS PRINCIPER Själva LIFECODES HLA-SSO-typningen är baserad på hybridisering av etiketterade enkelsträngade PCR-produkter till SSO-sonder. Vid PCRförstärkning av DNA används vanligtvis ekvimolara mängder av både framåt- och bakåtprimerer för att skapa en dubbelsträngad DNA-produkt. Men om mängden av en primer överskrider de övriga, kan reaktionen generera några enkelsträngade DNA-produkter utöver de dubbelsträngade. Under LIFECODES-förstärkningens initiala cykler genereras dubbelsträngat DNA. När den begränsande primeren är slut använder återstående primerer den dubbelsträngade produkten som mall för att skapa enkelsträngat DNA. Den här metoden ger alltså både dubbel- och enkelsträngade produkter, som båda vid denaturering deltar i hybridiseringsreaktionen. Var och en av de olika sonderna är ev. homolog till en sekvens inom förstärkt DNA som är unik för en allel eller en grupp av alleler. Dessa sonder är alltså utformade så att var och en av dem prioriterar hybridiseringen av en kompletterande region, som ev. förekommer i den förstärkta DNAprodukten. Förstärkt DNA hybridiseras även mot en eller flera konsensussonder som ska är homologa till sekvenserna i samtliga alleler i ett lokus. SSO-typningen kan påverkas av typen av biologiskt material, reningsmetod, den genomiska DNA-produktens mängd och integritet. Den signal som erhålls för konsensussonden/-sonderna kan således fungera som en indikator för en framgångsrik förstärknings- och hybridiseringsprocess. Den signal som konsensussonden ger kan även användas för att normalisera signalen från allelspecifika sonder, och korrigera för ev. varierande mängder av den kopierade produkten i hybridiseringsreaktionen. Analysen av resultaten från SSO-typningen kan användas för att fastställa närvaro eller frånvaro av särskilda DNA-sekvenser i förstärkt DNA, samt identifiera möjliga alleler i provet. Vid LIFECODES HLA-SSO-typningen fästs sonder vid Luminex Microspheres som är avsedda för Luminex Instrument. Upp till 100 olika populationer av Luminex Microspheres kan blandas och analyseras av Luminex Instrument, eftersom varje population av mikrosfärer kan urskiljas med hjälp av unika fluorescerande signaturer eller färger. Olika SSO-sonder kan kopplas till varje färgmikrosfär. På så sätt kan en kombination av olika sonder särskiljas från varandra genom att de kan associeras med en viss färgmikrosfär. Luminex Instrument kan även kvantifiera de relativa mängderna etiketterade PCR-produkter som hybridiseras i varje Luminex Microsphere. Den relativa signalen som erhålls med SSO-sonderna vid LIFECODESanalysen kan därför, precis som med andra SSOP-metoder, användas för att fastställa sondernas positiva eller negativa reaktivitet med det förstärkta DNA-provet (se avsnittet Resultat). Härmed erhålls den information som krävs för att fastställa provets HLA-fenotyp. Noll 1 används som kompletterande analys för att öka upplösningen i LIFECODES-analyserna HLA-A, HLA-B och HLA-C, för att lösa den alleliska osäkerheten mellan A*24:02/24:09N, B*51:01/51:11N och C*04:01/04:09N. Noll 2 används som kompletterande analys för att öka upplösningen i LIFECODES-analysen HLA-DRB3,4,5, vilket löser den alleliska osäkerheten mellan DRB4* 01:03/DRB4* 01:03:01:02N och DRB5*01:02/DRB5* 01:08N. Jämkning av informationen från noll 1- eller 2-analysen med motsvarande resultat från locusspecifika analysresultat från LIFECODES SSO typningssats, för att generera en föreslagen typning av ett prov kan utföras genom manuell analys eller programvaruanalys. För manuell analys identifierar resultatet av noll 1- eller 2-analyserna förekomsten eller frånvaron av specifika nollalleler. Resultatet av motsvarande locusspecifika LIFECODES SSO typningssatser kan innehålla osäkerheter gällande dessa nollalleler (t.ex. A*24:02/24:09N, B*51:01/ 51:11N, C*04:01/04:09N, DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N eller DRB5*01:02/DRB5*01:08N). Om nollallelen identifieras med nollprodukten kan samtliga allelkombinationer som inte innehåller nollallelen elimineras från resultatet som inhämtats från motsvarande locusspecifika LIFECODES SSO typningssats. Om nollallelen saknas baserat på nollproduktresultatet, kan samtliga allelkombinationer som innehåller nollallelen elimineras från resultatet som inhämtats från motsvarande locusspecifika LIFECODES SSO typningssats. I produktinformationen som medföljer och i programvaran kallas denna process för att kombinera resultatet av två produkter för att jämka resultatet. Sida 2 av 8 LC1437CESV.3 (05/15)

REAGENSER A. Identifiering I tabellerna i avsnittet Reagenser efter katalognummer hittar du kompletta listor över katalognummer. B. Varningar och försiktighetsåtgärder 1. För in vitro-diagnostik. 2. Använd separata pipetter till för- och efterhantering av PCR. 3. Bioriskvarning: Alla biologiska prover och blodprover ska behandlas som potentiellt smittsamma. Följ allmänna säkerhetsåtgärder vid hantering. 4. Förtunningslösning, sondblandningar, Taq-polymeras och R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin innehåller farliga föreningar. Låt inte dessa komma i kontakt med hud och ögon. Bortskaffa materialen efter användning i enlighet med lokala föreskrifter. Se materialsäkerhetsdatabladen för ytterligare info. C. Förvaringsanvisningar 1. Information om korrekta lagringstemperaturer hittar du på förpackningens etikett. 2. Sondblandningar och R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin är ljuskänsliga. FÖRVARAS MÖRKT, FÅR EJ FRYSAS. 3. Använd inte produkterna efter deras utgångsdatum. D. Rening eller användningsbehandling Se Provtagning och förberedelse. E. Instabilitetsindikatorer 1. Om salter har fällts ut ur lösningen under transport eller förvaring, måste dessa återlösas före användning. Vortexa i rumstemperatur (18 C till 30 C). 2. Använd inte R-fykoerytrin-konjugerat streptavidin som har frysts under transport eller förvaring. INSTRUMENTKRAV 1. Luminex Instrument och XY Platform (produktnummer 888300, 888310) 2. Följande termocykler har validerats: 96-Well Gene Amp PCR system 9700 inställd i MAX-läget (baskategori nr. N8050200, Gold Block kat. nr. 4314878), Veriti 96-Well termocykler inställd på 9700 MAX-läget (kategori nr. 4375786). Se Tabell 2 för maximal ramphastghet. Observera: andra termocykler och ramphastigheter har inte validerats. PROVTAGNING OCH FÖRBEREDELSE A. Mänskligt DNA kan renas från helblodprover, lättcellsskikt eller bukala svabbprover med hjälp av en validerad process som uppfyller kriterierna nedan. B. DNA från blod som konserverats i EDTA och ACD (sur citratdextros) har testats och befunnits fungera i denna analys. DNA extraherat från blod bevarat i heparin kan inte användas i denna analys. Andra konserveringsmedel har inte testats. C. Isolerat DNA ska ligga i 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0 eller i sterilt vatten. Vid förekomst av ett kelatbildande medel som t ex. EDTA, får inte den slutgiltiga koncentrationen av det kelatbildande medlet överskrida 0,5 mm. D. Förekomst av alkohol, rengöringsmedel eller salter kan påverka DNA-förstärkningen negativt. E. Slutgiltig DNA-koncentration bör vara 10 200 ng/µl. F. Mätning av absorberingen i DNA-proverna vid 260 och 280 nm bör ge en proportion på 1,65 till 2,0. G. DNA-produkten kan användas omedelbart efter isoleringen, eller lagras vid 20 C i upp till ett år. Upprepad infrysning/upptining bör undvikas eftersom det kan försämra kvaliteten. PROCEDUR Observera: Avvikelser från det rekommenderade protokollet och materialet som behövs har inte validerats. A. Tillhandahållet material (Se tabellerna i avsnittet Satser/Reagenser efter katalognummer finns mer information) Lämplig huvudblandning (MX) Lämplig sondblandning (BM) Förtunningslösning (DS) Tröskeltabell, träffmönstertabell(er) LIFECODES Taq-polymeras* (LIFECODES kategori nr. 628075) x 2 B. Material som behövs men inte tillhandahålls Följande material användes vid satsens validering: Luminex Sheath Fluid (1x Lifecodes kategori nr. 628005) Nukleasfritt vatten (Lifecodes kategori nr. 757003; 20 ml) PCR-rör och hattar - Corning Thermowell Tube Strips (Costar kategori nr. 6542, LIFECODES kategori nr. 888640) eller Corning Thermowell PCR 96 brunnar (kategori nr. CLS6551) eller Themoscientific AB Gene Superplate 96-brunn PCR-platta (kategori nr. AB-2100) Costar -platta (Costar kategori nr. 6509, LIFECODES kategori nr. 888630) Thermowell genomskinlig polyetylentejp (Costar Nr. 6524 (LIFECODES kategori nr. 888635 ) R-fykoerytrin konjugerad streptavidin (SA-PE), 1 mg/ml (LIFECODES kategori nr. 628511) Luminex kalibreringssatser (Luminex 100/200 kalibreringssats, Luminex 100/200 prestandakontroll, LIFECODES kategori nr. 628018 respektive 628019) C. Ytterligare material som användaren ska tillhandahålla Vortexmixer Kompressionsmatta av silikon Axygen Scientific nr. CM-FLAT eller motsvarande Badsonikator Mikrocentrifug med spärrfiltermunstycken Pipettorer, flerkanaliga pipettorer och munstycken (1-20 µl, 20-200 µl, 1 000 µl) Kalkylprogramvara för analys Värmeblock 70 % isopropanol eller 20 % blekmedel Hållarbricka Applied Biosystems nr. 403081 (att använda endast med 9700 termocykler) Sida 3 av 8 LC1437CESV.3 (05/15)

BRUKSANVISNING ANMÄRKNINGAR: Sondblandningar och SA-PE är ljuskänsliga: förvaras mörkt och får ej frysas. Värm kulorna till 55-60 C i minst 5-10 minuter så att komponenterna solubiliseras ordentligt i sondblandningen. Sonikera helt kort (~15 sek), mixa i vortexsond i minst 15 sekunder tills kulorna är helt solubiliserade. Var mycket försiktig vid alikvoteringen, använd kalibrerade pipetter. Annars får du ev. ingen reagens och provet misslyckas. Alla temperaturangivelser måste iakttas noggrant. Så små fluktuationer som +/- 0,5 C kan påverka resultatet. I hybridiseringsfasen får proverna inte förbli i utspätt tillstånd vid 56 C i mer än fem minuter (se avsnittet Resultat). Vi rekommenderar att de kopierade proverna analyseras så snart som möjligt. Om proverna inte kan köras i Luminex samma dag, kan den kopierade produkten lagras i upp till tre dagar vid 2-8 C innan den används. Vid en längre förvaring rekommenderas -20ºC under upp till en vecka fram till tidpunkten för analysen. Den kopierade produkten kan bara frysas och tinas en gång. Upprepad infrysning och upptining gör att de kopierade proverna bryts ned, vilket ger sämre resultat vid analysen. A. Rening av genomiskt DNA, med valfri metod. Slutgiltig koncentration ska ligga på 10 200 ng/µl. Justera vid behov med sterilt vatten. Se till att alla prover håller samma koncentration. B. DNA-förstärkning (PCR) 1. Värm huvudblandningen till rumstemperatur (18 till 30 C). 2. Vortexa försiktigt reagenserna I cirka 10 sekunder. På så sätt garanteras salthalterna i lösningen. Snurra försiktigt (5-10 sekunder) i mikrocentrifug så att innehållet hamnar på botten av röret. 3. Använd Tabell 1 nedan när du förbereder komponenterna för förstärkning av n+1 reaktioner. Använd mängdanvisningarna för respektive komponent per reaktion (utom för DNA). Den slutgiltiga volymen ska vara 20µL per reaktion med sterilt vatten. Vortexa försiktigt. 4. Pipettera lämplig mängd genomiskt DNA (40 till 120 ng) i PCR-rören. 5. Alikvotera huvudblandningen i PCR-rören med genomiskt DNA. (Den sammanlagda volymen av huvudblandningen och genomiskt DNA ska vara 20µL för respektive reaktion.) 6. Förslut rören väl för att undvika avdunstning vid PCR. 7. Placera proverna i termocyklern och kör programmet, se Tabell 2 och Tabell 3. Tabell 1. Reagenskomponenter vid förstärkning Komponent LIFECODES Huvudblandning 6µl Mängd per PCR provreaktion Genomiskt DNA10-200ng/µl Totalt av ~80ng LIFECODES Taq-polymeras 0,2 µl (1 U) Nukleasfritt vatten Till 20µl slutvolymen Tabell 2. Termocyklernas villkor för förstärkning Termocykler Gen Amp PCR System 9700 Veriti 96-Well termocykler Läge (ramphastighet) MAX läge (3,9 C/sec) 9700 MAX läge (3,9 C/sek.) Tabell 3. Termocyklernas villkor för förstärkning Steg Temperatur och inkubationstid Antal cykler 1 95º C i 3 min 1 2 95º C i 15 sek. 60º C i 30 sek. 72º C i 30 sek. 12 3 95º C i 10 sek. 63º C i 30 sek. 72º C i 30 sek. 28 4 72º C i 2 min. 1 5 Konstant 4º C 1 Observera: för att vara säker på provförstärkningen, se produktens gelelektrofores (Bilaga A). Sida 4 av 8 LC1437CESV.3 (05/15)

C. Hybridisering Kontrollera att hybridiseringens buffertkomponenter i LIFECODES sondblandning solubiliseras och att kulorna är helt suspenderade. Starta Luminex och XY-plattformen och låt värma upp i 30 minuter. 1. Värm sondblandningen i 55-60 C i minst 5-10 minuter, så att komponenterna solubiliseras ordentligt i sondblandningen. 2. Sonikera helt kort (~15 sek), mixa i vortexsond i minst 15 sekunder tills kulorna är helt uppslammade. 3. Kombinera 15 µl av den lämpliga sondblandningen med 5 µl av platsspecifik PCR-produkt i varje brunn av en termocykler 95 brunnplatta (Costar nr. 6509). När du alikvoterar sondblandningen till mer än 10 brunnar, ska du försiktigt vortexa sondblandningen efter varje uppsättning av tio. Täta plattan med polyetylentejp (Costar nr. 6524). 4. Placera kompressionsmattan av silikon ovanpå plattan före hybridiseringen. 5. Hybridisera proverna enligt följande inkubationsförhållanden: Tabell 4. Termocyklerns villkor för hybridisering 97ºC för 2 minuter 47ºC för 10 minuter 56ºC för 8 minuter 56ºC HOLD Slå på Luminex-instrumentets detektionslaser minst 30 minuter före hybridiseringens slut. 6. Medan proverna hybridiseras, förbered en 1:200 förtunningslösning/sa-pe-blandning. Kombinera 170 µl förtunningslösning (DS) och 0,85 µl 1 mg/ml SA-PE per prov. Här rekommenderas att förtunning för n+1 prover tillverkas, i händelse av pipetteringsförlust. (Se Tabell 5). 7. Förvara förtunningen/ SA-PE-blandningen i mörker, i rumstemperatur; SA-PE är ljuskänsligt! Förtunningslösningen kan värmas i 45 C i 5 minuter och vortexas vid ankomst, så att alla komponenter ligger kvar i lösningen. Förtunningen ska hålla rumstemperatur (18-30 C) innan du blandar. Förbered omedelbart före användning och avyttra ev. rester. Tabell 5. Förberedelse av förtunningslösning Antal prover Förtunningslösning SA-PE (DS) 1 170 µl 0.85 µl 5 850 µl 4,25 µl 10 1 700 µl 8,5 µl 20 3 400 µl 17 µl 50 8 500 µl 42,5 µl Anmärkning: STÄNG INTE AV HYBRIDISERINGSPROGRAMMET INNAN BRICKAN HAR AVLÄGSNATS FRÅN TERMOCYKLERN! 8. Vid väntan i 56 C, medan brickan befinner sig i termocyklern, späd proverna med 170 µl förtunning/ SA-PE-blandning. Det är viktigt att alla prov späds ut inom 5 minuter (efter 8 minuters väntan (HOLD) i 56 C). 9. Ta ut provbrickan från termocyklern och placera i Luminex Instrument. D. Provanalys med Luminex Instrument* Bäst resultat får du om du analyserar proverna i Luminex Instrument omedelbart. 1. Starta Luminex Instrument mellan 30 minuter och 4 timmar innan proverna ska analyseras. 2. Innan proverna analyseras i Luminex Instrument, ställ in den körning som ska användas vid analysen. a) Välj Create a New Batch (Skapa ny batch) i File-menyn (Arkivmenyn). Exempel: vid analys av nollklass I läggs i batch för nollklass I Batchmall finns på webbsajten och benämns i detta fall noll 1 xxxxxx (partinr.). Observera att mallversionerna är partinummerspecifika och motsvarar sondblandningens partinummer. Följ de stegvisa anvisningarna på skärmen när du skapar batchar. När du namnger en batch, lägg inte in kommatecken i namnet eftersom all information efter ett komma går förlorad vid exportering av data. b) Mer information om hur du skapar batchar och multibatchar finns i bruksanvisningen till Luminex. c) Klicka på utmatningsikonen för att mata ut platthållaren. Placera termocyklerns platta med proverna i platthållarens XYP-värmeblock. d) Klicka på ikonen för inmatning av plattan. Nu är proverna klara att analyseras. En inledande fas utförs innan själva körningen startas. e) När proverna har körts igenom instrumentet följer en saneringsfas med 70 % isopropanol eller 20 % vanligt blekmedel, följt av två tvättfaser. Om instrumentet inte ska användas mer under dagen, kan det stängas av nu. 3. När en batch är klar, exporteras dina data som en kommaseparerad fil (csv). Dessa filer döps till OUTPUT.CSV och sparas i en mapp med samma batchnamn som matades in i Luminex IS. Dessa data är nu tillgängliga för typning enligt nedanstående anvisningar. *I bruksanvisningen till Luminex hittar du information om instrumentets hanteringsprocedurer, inkl. initiering, kalibrering, underhåll och avstängning. RESULTAT Så här kan typningen gå till: De genererade CSV-filerna kan öppnas och dess data bearbetas i vanliga kalkylprogram som t ex. Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro eller motsvarande programvara. Analysen består av följande faser: 1) Se till att antalet event för respektive SSO i varje prov är minst 60. Du hittar den här informationen under DataType (Datatyp): Count (Räkna) i CSV-filen. Sida 5 av 8 LC1437CESV.3 (05/15)

2) Kontrollera att värdena för respektive provs konsensussonder ligger över det lägsta medianvärdet för fluorescensintensitet eller MFI. Lägsta tröskelvärdet är partispecifikt. Du hittar det i tröskelvärdestabellen. Varning: För att resultaten ska bli tillförlitliga måste tillräcklig mängd data hämtas in av Luminex Instrument. 3) Samla in minst 60 händelser för varje SSO genom att dra ifrån sondens bakgrundskontrollvärde från provets värde, erhålls en korrigerad uppsättning bakgrundsdata. Bakgrundskontrollens värden återfinns i tröskelvärdestabellen och är partispecifika. Bakgrundsvärdena är genomsnittliga MFI-värden för respektive kula och ska kompensera för bakgrundsbrus orsakat av avvikelser. 4) Genom att, för respektive prov, dela varje sonds korrigerade bakgrundsdata med motsvarande konsensussonds korrigerade bakgrundsvärde, erhålls en normaliserad uppsättning data. MFI (sond) MFI (kontrollämne för sonden) MFI (konsensus) MFI (kontrollämne för konsensus) 5) Vid respektive sond anges det normaliserade värdet i tröskelvärdestabellen. 6) När alla värden har tilldelats kan sondsatsmönstret (dvs. kombinationen av alla positiva och negativa tilldelningar för ett visst prov) jämföras med sondträfftabellen (LC1024) på webbsajten. Varning: Varje lokus har en separat tröskelvärdestabell. Dessa tröskelvärdestabeller är partispecifika. Kontrollera att partinumret i tabellen matchar partinumret på typningspaketet. Om ett normaliserat värde för en viss sond hamnar över maxgränsen för en negativ uppgift, och under minimigränsen för en positiv uppgift, ska sondens prov anses resultatlöst. Provet ska typas, först genom att värdet antas vara negativt och sedan genom att värdet antas vara positivt. I avsnittet FÖRVÄNTADE VÄRDEN finns mer information om tröskelvärden. KVALITETSKONTROLL Det rekommenderas att en negativ och en positiv kontroll körs med varje prov, till exempel ett blindprov med vatten och ett tidigare typbestämt prov. Consensus sekvensspecifika oligonukleotid (SSO) sonder, som listas i tröskeltabellen, hybridiseras till respektive lokusspecifika alleler. Värden som inhämtas med Consensus SSO från positiva kontroller ska överskrida tröskelvärdet för SSO enligt vad som anges i arbetsbladet med tröskeltabellen. Värden som inhämtas med Consensus SSO från blindprov med ska ligga under tröskelvärdet för SSO enligt vad som anges I arbetsbladet med tröskeltabellen. LIFECODES sondblandningar innehåller en eller flera SSO-konsensussonder identifierade i arbetsbladen för typningspaketet. Dessa konsensussonder hybridiserar till alla alleler och fungerar som interna kontroller för att verifiera förstärkning och för att bekräfta att hybridisering skett. Om minimivärdet inte inhämtas för dessa SSO, kan det inträffa att provet inte ger rätt typ. Provet får då upprepas. Analysen bör köras enligt rekommendationen i förpackningen, samt enligt övriga kvalitetskontrollmetoder i enlighet med gällande lokala, delstatliga, federala och/eller andra kontrollorgan. PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR De beskrivna förutsättningarna för PCR och utvärdering kräver noggranna kontroller. Avvikelser från dessa parametrar kan leda till felaktigheter. Alla instrument ska kalibreras enligt tillverkarens anvisningar och användas inom ramen för tillverkarens parametrar. 1) Kulorna värms upp i förväg och ska vara väl uppslammade före användning. På så sätt garanteras att hybridiseringsbuffertens komponenter finns med i lösningen. 2) Inkubation vid 47 C respektive 56 C kräver precision på hög nivå (+/- 0,5 C). Använd termocykler. Temperaturen ska kontrolleras på plattan i en termocykler med 96 brunnar, med hjälp av en termoomkopplare (t ex. Bio-Rad, VPT-0300 eller motsvarande). Temperaturen i och mellan brunnarna får inte avvika mer än +/- 0,5 C. 3) Tiden vid 56 C är kritisk och får inte överskrida sammanlagt 13 minuter. Här ingår 8 minuters inkubation plus max 5 minuter för spädning av samtliga prov med förtunning/ SA-PE-blandningen. 4) Efter förtunning måste provanalysen utföras inom 1 timme (skyddas mot ljus). 5) Blanda inte komponenter från olika paket och partier. På grund av HLA-typningens komplexa natur bör endast kvalificerad personal hantera datatolkningen och typningsuppgifterna. Sida 6 av 8 LC1437CESV.3 (05/15)

FELSÖKNING PROBLEM MÖJLIG ORSAK LÖSNING Låg kulräkning Sondblandningen är inte ordentligt suspenderad Förvärm, sonikera och vortexa sondlösningen och upprepa analysen. CON tröskelfel Instrumentet fungerar inte som det ska Provet gick inte att förstärka/resultatet blev dåligt* Kalibrering ej utförd Provets flödesväg blockeras Lågt DNA Salter i huvudblandning saknas i lösningen Kalibrera instrumentet. (Se bruksanvisningen till Luminex IS.) Nålen avlägsnas och sonikeras. Gör en backspolning. Om problemet kvarstår, kontakta Immucor Transplant Diagnostics, Inc. +1-888-329-0255 Kontrollera DNA-produktens koncentration och renhet. Värm Huvudblandning vid 37 C i 5 minuter, vortexa försiktigt och centrifugera helt kort. Flerfaldiga SSO-fel alternativt provet producerar ej HLAtypningsresultat Dålig Taq-polymeras Förstärkningsförhållandena följer inte de angivna parametrarna Lågt medianvärde för fluorescensintensitet (MFI) Allelspecifik förstärkning Förorenat DNA-prov Delvis nedbruten DNA-produkt Avdunstning i samband med hybridisering Förstärkningsförhållandena följer inte angivna parametrar * PCR-förstärkning kan bekräftas med gelelektrofores (se bilaga A). Använd validerad LIFECODES Taq-polymeras katalognr. 628075. Kör en termoprofil på termocyklern och kontrollera att angivna parametrar efterföljs. Värm förtunningslösningen i 45 C i 5 minuter före användning och vortexbehandling. Förvara i rumstemperatur. Byt ut R-fykoerytrin konjugerat streptavidin. Kör en termoprofil på termocyklern och kontrollera att angivna parametrar efterföljs. Återisolera DNA från blodprovet. Om du inte använder hela plattan, låt en rad på respektive sida om analysproverna vara tom, så att plattan kan förseglas ordentligt. FÖRVÄNTADE VÄRDEN Varje locus har en CON-sond och två SSO-sonder. Om ett prov innehåller ett av locusen som analyseras ska konsensussonden och minst en av SSO-sonderna för den locusen vara positiv. Sondvärden kan normalt uppfattas som positiva och negativa. I sällsynta fall hamnar värdet mellan positiva och negativa gränsvärden, där då resultatet anses vara obestämbart. Om ett prov innehåller obestämbara värden för en viss SSO-sond ska provet typas med sonden som negativ och en gång till med sonden som positiv. Om två SSO-sonder för en locus är obestämbara kan provet inte typas. Analysen måste då göras om. Som angavs i avsnittet Procedurens begränsningar, är det mycket viktigt att protokollet följs exakt. Eventuella avvikelser kan leda till en misslyckad typning. SPECIFIKA FUNKTIONSEGENSKAPER När LIFECODES HLA SSO nollallel typningssats används enligt proceduren som beskrivs i produktinformationen kan klass I- och klass-ii-hla-typ i DNA-prov bestämmas. HLA nollallel klass 1 (noll 1) analysen visar 100 % överensstämmelse (97,4 % nedre gräns med 95 % konfidensintervall) för A-locus, 100 % överensstämmelse (97,4 % nedre gräns med 95 % konfidensintervall) för B-locus och 100 % överensstämmelse (97,4 % nedre gräns med 95 % konfidensintervall) för C-locus i 139 utvärderade prov i jämförelse med resultat som inhämtats med tvåriktningssekvensering. Analysen för HLA nollallel klass 2 (noll 2) visar 97,1 % överensstämmelse (92,7 % nedre gräns med 95 % konfidensintervall) för DRB 4 locus och 98,5 % överensstämmelse (94,8 % nedre gräns med 95 % konfidensintervall) för DRB 5 locus i 137 utvärderade prov i jämförelse med resultat som inhämtats genom tvåriktningssekvensering. REFERENSER 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225 2. Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163 3. Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290 4. Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 BEGRÄNSADE LICENSER Taq-polymeras tillverkas för Immucor Transplant Diagnostics av Promega Corp. Den är licensierad till Promega enligt amerikanska patent nr. 5,338,671 och 5,587,287 och deras utländska motsvarigheter. Vid köp av den här produkten erhålls en begränsad icke överförbar licens enligt amerikanska patent nr. 5,981,180 eller utländsk motsvarighet, som innehas av Luminex Corporation för utförandet av flertaliga HLA-typningsanalyser av kliniska prover. Tillverkare: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, CT 06902. Tel.: 00-1-203-328-9500, 888-329-0255, Fax: 00-1-203-328-9599 Auktoriserad representant: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark 63322, Germany Phone: (+49) 6074-84 20-0, Fax: (+49) 6074-84 20-99 Europeisk teknisk service: Tel.: 00 32/3 385 4791 Dokumentets senaste revidering och utgivning: Rev. 03; 2015-05-15 Sida 7 av 8 LC1437CESV.3 (05/15)

ANVÄNDA VARUMÄRKEN AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Gene Amp Veriti LIFECODES Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. BILAGA A Gelelektrofores PCR-reaktionerna som utförs med LIFECODES HLA-SSO typningssatser är avsedda att generera både dubbel- och enkelsträngade produkter, dvs. de produkter som i huvudsak hybridiseras till SSO. Vid kvalitetskontroll eller felsökning av ett experiment kan ev. en gelelektrofores krävas för att kontrollera förekomsten av förstärkt DNA i PCR-reaktionen Erforderligt material (listat eller motsvarande material) Elektrofores agaros (Lonza Group, Ltd. IDNA agaros nr. 50170) Elektroforesinstrument/nätanslutning 1 x gelbuffert (40xTAE, Promega nr. V4281) GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. nr. 50535) UV Transilluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. modell TM36) Bildhanteringssystem Den relativa migrationen av den enkelsträngade produkten beror på gelkoncentrationen och vilket buffertsystem som används. Ungefärliga migrationer vid varje förstärkning listas nedan för prover som körs i 2 %-ig agarosgel i 1x TAE-buffert. Elektroforesens förutsättningar 1. Ta ut GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Group nr. 50535) ur frysen och låt tina. Förvara mörkt. 2. Den gel som används här måste vara 2 %-ig, dvs. till en 200 ml gelbädd används 4 gram agaros till 200 ml 1X TAE (späd från 40X TAE). Tillsätt 10 µl GelStar Nucleic Acid Stain till den smälta agarosen. När gelen öses, lämna rikligt med utrymme för DNA-produktens stigning (3-5 cm). VAR FÖRSIKTIG: GelStar är en potentiell carcinogen. ANMÄRKNING: Det går att köra geler med 20 µl av 10 mg/ml etidiumbromid i stället för GelStar Nucleic Acid Stain. Produktbandets intensitet är lägre med gel som innehåller etidiumbromid än geler med GelStar. VAR FÖRSIKTIG: Etidiumbromid är en känd carcinogen. 3. Förvara gelen mörkt och låt stelna. 4. Lägg i en blandning av 2,5 µl av varje PCR-produkt och 2,5 µl 2 X laddningsbuffert med synlig färg per prov, per förstärkning. Kör gelen i mörker vid cirka 160 V i ungefär 45 minuter, eller tills provet har körts så länge att det går att iaktta separata band för enkel- och dubbelsträngad produkt (bromofenolblå band eller annan synlig markör migrerar 3-5 cm från brunnarna). 5. Fotografera med UV-transilluminator och ett GelStar gult fotofilter (Lonza Group Ltd. nr. 50536). OBSERVERA: Vid hantering av GelStar Nucleic Acid Stain eller etidiumbromid, samt vid fotografering av gel med UV-transilluminator, ska skyddsutrustning bäras. 6. Gelanalys Nollklass 1 Nollklass 2 Dubbelsträngad(e) (bp) ~210, ~180, ~280 ~280 Enkelsträngad(e) (bp) ~150,~180 ~140,~180 Geltolkning Brunn Dubbelsträngat DNA Enkelsträngat DNA Primerband Förstärkning -------- (ljust) -------- (mindre ljust) Icke-förstärkning Sida 8 av 8 LC1437CESV.3 (05/15)