Inst för ekologi, miljö och geovetenskap Svampkunskap III, 7,5 hp Något om molekylära metoder inom svampsystematiken Projektarbete av Elin Grahn Svampkunskap III Umeå, Skövde, ht-10 Handledare: Elisabeth Wiklund 1
Innehållsförteckning Sammanfattning sid 3 Inledning sid 3 Syfte sid 4 Material och Metod sid 4 Några taggsvampar sid 4 Molekylära metoder sid 6 Ribosomala gener sid 8 ITS sid 9 Proteingener sid 9 Diskussion sid 9 Käll- och litteraturförteckning sid 10 Försättsbladets bild är tänkt att symbolisera en möjligen vilsen svamp som inte vet riktigt om den hamnat helt rätt och var den hör hemma sådana verkar det finnas gott om inom svampsystematiken. Foto denna bild samt bilden i Figur 1: E. Grahn. 2
Sammanfattning Mycket av den svampforskning som bedrivs idag handlar om att korrekt föra in svamparter i den systematiska indelningen av levande organismer. Senare års utveckling av metoder inom molekylärbiologin har gett helt nya möjligheter att utreda släktskap mellan olika arter och i detta arbete beskrivs översiktligt vad dessa molekylära metoder baseras på och vad för molekyler det är som jämförs då man pratar om LSU, SSU, ITS och RPB2. Som ett exempel på hur stora skillnader de nya metoderna medfört för indelningen av svampar har några taggsvampar studerats. Dessa var i en tidig svampbok indelade i samma släkte, men tillhör nu inte bara olika släkten utan även olika ordningar. Inledning Med biologisk systematik avses indelandet av olika arter för att visa hur de är besläktade med varandra. Carl von Linné var en av de första som under 1700-talet på allvar började inordna levande organismer på ett systematiskt sätt samt att vetenskapligt namnge olika arter efter hur de passade in i systemet. Linné tittade dock främst på växter och djur och baserade indelning på yttre likheter mellan olika arter. Under 1800-talet föreslog Charles Darwin att alla levande arter utvecklats ur ett gemensamt ursprung genom evolution och gradvisa förändringar över långa tidsperioder. Den biologiska systematiken ska därför inte längre visa hur lika olika arter är varandra, utan snarare hur olika arter är besläktade med varandra och hur de utvecklats från gemensamma anfäder. Det finns för närvarande ca 100000 kända svamparter. Dessa tillhör alla domänen Eukarya vilket betyder att de har en cellkärna som innehåller cellens genetiska material och att cellkärnan avgränsas från resten av cellen med ett membran. De andra två domänerna som finns är Eubacteria och Archaea. Inom domänen Eukarya har svamparna placerats i ett eget rike Fungi och medlemmarna av detta rike är närmare släkt med djur än med växter. Riket Fungi delas i sin tur in i sju olika fyla (Hibbett m.fl. 2007). Chytridiomycotas medlemmar lever ofta i vatten som parasiter och kan förflytta sig med hjälp av flageller. Neocallimastigomycota innehåller anaeroba mikrosvampar som finns i matspjälkningssystemet hos vissa djur där de bidrar med enzymer som kan bryta ner bl.a. cellulosa. Fylum Blastocladiomycota innehåller svampar som har egenskapen att de växer bipolärt, d.v.s. från två ändar av cellen samtidigt. Microsporidia är ett fylum som innehåller encelliga parasiter av enkel uppbyggnad som på ett virusliknande sätt invaderar och övertar sin värdcell. Glomeromycota är ett ekologiskt viktigt fyla då dess medlemmar lever i symbios med de flesta växter. (Wiklund, 2009). Fylum Ascomycota och fylum Basidiomycota utgör dessutom tillsammans subriket Dikarya och skiljs åt genom att Ascomycota bildar sporer i sporsäckar medan Basidiomycota bildar sporer på basidier. Bland de egenskaper som utmärker samtliga medlemmar av riket Fungi kan nämnas att de har en cellvägg på samma sätt som växter, men cellväggen består av kitin i stället för cellulosa, att de är heterotrofa till skillnad från växter d.v.s. de får den energi de behöver från andra organismer i likhet med djur samt att de sprids med hjälp av sporer. Dagens svampforskning verkar till stor del handla om att indela svamparter på ett systematiskt korrekt sätt. Det som Linné gjorde för 250 år sedan för växter och djur görs nu alltså för svampar. Under de senaste årtiondena har molekylärbiologiska metoder och kunskaper utvecklats och genom att ta hjälp av dessa kan biologisk systematik ske inte bara 3
utefter yttre synliga egenskaper (makroskopiska eller mikroskopiska) utan även på molekylär nivå genom att jämföra de kemiska molekyler som bygger upp organismen (Høiland 2007, Hibbett m.fl. 2007). Syfte Huvudsyftet med detta arbete var att försöka ta reda på lite mer om de molekylära metoder som används inom svampsystematiken. Stora förändringar av svampars systematik har ägt rum under senare år som en följd av att de molekylära metoderna utvecklats. Trots det beskrivs ofta inte de metoder som använts, åtminstone inte i den litteratur jag haft tillgång till. Utan att fördjupa mig alltför mycket i de tekniska detaljerna har jag velat försöka förstå lite mer om vad det egentligen är för molekyler man analyserar och varför man studerar just dessa molekyler inom svampsystematiken. Material och Metod Detta arbete är en litteraturstudie som baserats på kurslitteratur till kursen Svampkunskap III samt annan litteratur som är tillgänglig via bibliotek eller internet. Några taggsvampar I D:r M. A. Lindblads svampbok från år 1901 (Romell och Sandberg) delas hattsvamparna (Hymenomyceter) in i fyra familjer: skivsvampar, rörsvampar, taggsvampar och hudsvampar. Gemensamt för dessa är att sporerna ( fröstoftet ) bildas på utsidan och det som skiljer familjerna åt är hur den yta där sporerna bildas ser ut. Jag har tittat lite mer på familjen taggsvampar (Hydnéer) där sex olika arter tas upp i den över hundra år gamla svampboken. Dessa sex arter ansågs alla tillhöra samma släkte, Hydnum och det som beskrivs som det gemensamma för taggsvamparna är att fröstoftet alstras på utsidan af syllika piggar eller taggar, som nedhänga från hattens undersida. De sex arterna är enligt Romell och Sandberg: fjällig taggsvamp, (Hydnum imbricatum) slät taggsvamp (H. lævigatum), blek taggsvamp (H. repandum), gyttrad taggsvamp (H. corrugatum), koralltaggsvamp (H. coralloides) samt gelétaggsvamp (H. gelatinosum) (Figur 1). Figur 1. Gelétaggsvamp. Då jag letade efter dessa sex svamparter i modernare svamplitteratur är det bara en som fortfarande har kvar samma vetenskapliga namn Hydnum repandum, blek taggsvamp. De övriga fem har fått nya namn, antingen bara släktnamnet eller både släktnamn och artepitet. De frågeställningar som då uppstod var dels var någonstans i det fylogenetiska släktträdet arterna hamnar idag och dels vilka metoder man använt för att komma fram till de resultaten. 4
För att få reda på vilka vetenskapliga namn de sex svamparterna har idag (Tabell 1) beslutade jag mig för att använda Index Fungorum (websida 2010) efter att ha upptäckt att olika namn används på olika ställen. Alla arter tillhör fylum Basidiomycota, subfylum Agaricomycotina och klass Agaricomycetes, men ordningen varierar. För P. gelatinosum verkar en viss osäkerhet råda angående familjetillhörighet eftersom familj anges som incertae sedis. Incertae sedis betyder osäker placering på latin och osäkerhet när det gäller att placera in arter i ett fylogenetiskt släktträd kan bero på flera olika faktorer som t.ex. att arten är dåligt beskriven, att molekylära data saknas (gäller speciellt för sällsynta arter som det kan vara svårt att få tag på), att data från olika studier visar på olika resultat (Moncalvo m.fl. 2006) eller att det råder kontrovers bland forskare om hur arten ska placeras. (Websida 2010). Tabell 1. Indelning av taggsvamparna enligt modern svampsystematik. Efter uppgifter i Index Fungorum (websida 2010). Klass Ordning Familj Art Svenskt namn Agaricomycetes Auriculariales Incertae sedis Pseudohydnum gelatinosum Gelétaggsvamp Agaricomycetes Cantharellales Hydnaceae Hydnum repandum Blek taggsvamp Agaricomycetes Thelephorales Bankeraceae Sarcodon leucopus Slät taggsvamp Agaricomycetes Thelephorales Bankeraceae Sarcodon imbricatus Fjällig taggsvamp Agaricomycetes Russulales Hericiaceae Crelophus cirrhatus Gyttrad taggsvamp Agaricomycetes Russulales Hericiaceae Hericum coralloides Koralltaggsvamp Figur 2. Fylogenetiskt träd över Basidiomycota hämtad från Hibbett m.fl. (2007), de ordningar som innefattar taggsvamparna som beskrivs i detta arbete är markerade med en blå *. 5
De fyra olika ordningar de sex taggsvampsarterna tillhör är utspridda inom klassen Agaricomycetes (Figur 2). Gelétaggsvamp tillhör ordningen Auriculariales tillsammans med t.ex. judasöra (Auricularia auricula-judae). Blek taggsvamp placeras i ordningen Cantharellales dit även kantareller och fingersvampar hör. Slät taggsvamp och fjällig taggsvamp tillhör fordningen Thelephorales som är nära släkt med Polyporales dit många tickor hör. Slutligen tillhör både gyttrad taggsvamp och koralltaggsvamp ordningen Russulales tillsammans med t.ex. kremlor och riskor. Att de sex arterna av taggsvamp alla tillhör fylum Basidiomycota innebär att de har samma typ av livscykel. Ett sätt att beskriva en svamps livscykel är att börja med en spor som innehåller en cellkärna (monokaryot) med en enkel genuppsättning (haploid, n) hamnar i en gynnsam miljö där den kan börja gro. De långsmala utskott som bildas kallas hyfer och varje hyfcell kommer att ha en cellkärna identisk med den som fanns i den ursprungliga sporen. Om hyferna sammanträffar med hyfer från en annan organism av samma art och av kompatibel parningstyp kan de förenas i en process som kallas plasmogami. Mycelet som då fortsätter att växa kommer att innehålla två olika cellkärnor (dikaryot) per hyfcell och kallas parkärnsmycel (n+n). Då för svampen lämpliga miljömässiga betingelser äger rum kan en fruktkropp bildas vilken även den är uppbyggd av dikaryota celler. I de sporbildande organen (basidiet) kommer de två olika cellkärnorna att smälta samman (karyogami) till en cell med dubbel genuppsättning (diploid, 2n). Senare delas cellen genom reduktionsdelning (meios) och halva genuppsättningen hamnar i varje dottercell som åter är haploid och i sin tur utvecklas till nya sporer. (Deacon 2006). Störst möjlighet för genetisk variation att uppstå och kunna föras vidare till nästa generation är under meiosen. Den ovan beskrivna sexuella cellcykeln ger upphov till en ny kombination av gener efter meiosen, så de nya sporerna som bildas inte behöver vara genetiskt helt identiska med någon av de tidigare genrationerna. Även asexuell reproduktion kan förekomma hos Basidiomycota, antingen genom sporbildning eller genom fragmentering. Vid fragmentering kan en del av mycelet som lossnar ge upphov till en ny organism som har samma genuppsättning som den ursprungliga. Vid asexuell sporbildning kan bildas sporer utan någon genetisk variation jämfört med ursprungsorganismen. År 1901 var de sex taggsvampsarterna placerade i samma släkte, men nu drygt hundra år senare tillhör de inte bara olika släkten men dessutom fyra olika ordningar. Frågan jag ställde mig är hur man gått till väga för att komma fram till dessa resultat och det är naturligtvis en kombination av flera olika metoder som använts i de olika fallen, så ett enkelt svar på frågan finns inte, men jag har försökt att förstå lite om de metoder som vanligen används. Molekylära metoder I de studier jag läst om där man använder molekylära metoder för att kartlägga släktskap mellan olika arter är det främst DNA-molekyler (DNA är en förkortning för engelskans deoxyribonucleic acid, deoxiribonuklinsyra på svenska) som studeras. Sekvensen för DNAmolekylerna från de arter man är intresserad av bestäms och jämförs sedan med varandra. Det som skiljer olika metoder åt är vilka DNA-molekylers sekvenser man väljer att studera. I ett fåtal fall jämförs även proteinsekvenser efter att sekvenserna i de studerade DNAmolekylerna översatts till aminosyrasekvensen i motsvarande protein. DNA är de molekyler som lagrar den genetiska informationen inuti en cell. En DNA-molekyl är en polymer d.v.s. en molekyl som är uppbyggd av många repeterade enheter av samma slag; byggbitarna i DNA kallas nukleotider. Det finns fyra olika nukleotider och det som skiljer dem åt är vilken av fyra olika kvävebaser som ingår: adenin (A), cytosin (C), guanin (G) eller tymin (T). En DNA-molekyl är dessutom dubbelsträngad och består av två halvor 6
som är komplementära till varandra vilket betyder att för en viss sträng finns det bara ett sätt för den andra strängen att se ut på så att de två halvorna passar ihop. I eukaryota celler finns DNA:t lagrat i cellkärnan (nucleus på engelska, varför beteckningen ndna används för DNA från cellkärnan) samt i de organeller som kallas mitokondrier (och beteckningen mtdna används för DNA från mitokondrierna). I växtceller finns dessutom DNA i kloroplasterna, d.v.s. de organeller där fotosyntesen sker. En bit av en DNA-molekyl som kodar för ett protein (eller mer sällan en bit funktionell RNAmolekyl) kallas för en gen. Varje cell innehåller en uppsättning av organismens samtliga gener. För att få fram tillräckligt mycket av den bit DNA man bestämt sig för att studera används tekniken PCR (polymerase chain reaction eller polymeraskedjereaktion). Figur 3. Schematisk bild som visar hur en bit DNA kopieras med PCR, bilden är tagen från Wikipedia (websida 2010). I steg 1 upphettas den ursprungliga DNA-molekylen (blå) så att de två strängarna skiljs från varandra. I steg 2 sänks åter temperaturen och de två primrarna (röda) binder till varsin sträng. I steg 3 kan enzymet DNA-polymeras (grön markerad med P ) bygga upp nya strängar (gröna) med primrarna som start som blir komplementära med de ursprungliga (blå). De nya strängarna består av de tillsatta nukleotiderna. I steg 4 har den första cykeln avslutats och man har fått dubbelt så många DNA-molekyler jämfört med vad som fanns från början. Längst ned visas antalet molekyler då processen upprepats två respektive tre gånger. Vanligtvis upprepas processen 25-30 gånger. PCR är en metod som används för att masskopiera ett visst avsnitt av en DNA-molekyl så att man får tillräckligt stor mängd av just den bit av DNA-molekylen man är intresserad av för att kunna genomföra olika studier, t.ex. bestämma sekvensen av DNA-avsnittet. För att tekniken ska fungera behövs förutom DNA-molekylen som ska studeras även två korta speciellt 7
tillverkade DNA-molekyler som kallas primrar. Dessa binder till varsin sträng av DNAmolekylen i ändarna av det DNA-avsnitt man är intresserad av. Vidare behövs ett överskott av nukleotider, d.v.s. de byggstenar som bygger upp DNA samt även enzymet DNA-polymeras som bygger upp nya komplementära DNA-strängar med den gamla som mall. En schematisk bild över metoden visas i Figur 3. För att välja ut lämpliga molekyler att studera då man vill klargöra släktskap behövs molekyler som finns i samtliga arter som ska undersökas och som dessutom skiljer sig lagom mycket från varandra. Ribosomala gener Ribosomer är stora komplex i cellerna vars funktion är att översätta den kod som finns i en mrna-molekyl och är ett slags avskrift av DNA-genen inuti cellkärnan till ett protein som ska syntetiseras av rätt följd av aminosyror. I alla levande organismer har ribosomerna en central roll och i alla organismer är de uppbyggda på samma sätt: av en stor och en liten subenhet. Var och en av dessa subenheter är i sin tur uppbyggda av både ribosomalt RNA (rrna) och flera stycken olika proteiner. Generna som kodar för rrna delen i den lilla subenheten (SSU, small subunit) respektive den längsta biten av rrna i den stora subenheten (LSU, large subunit) är de som verkar vanligast att studera då man vill kartlägga släktskapet hos levande organismer (Figur 4). Även motsvarande gener från mitokondrierna ingår i vissa studier och kallas då mt-lsu och mt-ssu samt ibland även en mindre bit rrna från den stora subenheten (5.8S). I samtliga dessa fall är det dock DNA-molekylernas sekvenser man jämför med varandra, d.v.s. DNA-sekvensen i genen som kodar för en RNA-molekyl. (Weiss och Oberwinkler 2001). Figur 4. Schematisk bild av de delar som ingår i pre-rrna och hur de efter processning och klyvning inuti cellkärnan exporteras till cytosolen där de sätts samman till ribosomens lilla (SSU) och stora (LSU) enhet. Bilden omarbetad från Nelson & Cox (2008). 8
ITS Förkortningen ITS betyder internal transcribed spacer, på svenska kanske internt transkriberat (omskrivet?) mellanrum. I ett svampgenom är ITS de två områden som sitter emellan delarna som kodar för SSU och 5.8S respektive 5.8S och LSU (Figur 4). Vid transkriptionen (omskrivningen från DNA till RNA, som fungerar som en slags kopia) skrivs hela genen med SSU-ITS-5.8S-ITS-LSU om till en lång RNA molekyl (pre-rrna) som modifieras och klyvs (för att bli av med de två ITS bitarna) innan den färdiga ribosomen kan bildas. ITS-regionerna varierar mer än de delar som ska ingå i den slutgiltiga ribosomen. Mutationer här har under evolutionen inte varit lika känsliga eftersom de inte påverkar ribosomens viktiga funktion på ett lika direkt sätt. På grund av detta lämpar sig studier av ITS-regionerna bättre då man vill systematisera på artnivå (Abarenkov m.fl. 2010) där skillnaderna är mycket mindre än då man vill kartlägga släktskapet på en högre nivå (då LSU och SSU är lämpligare att använda). I databaser finns nu över 100.000 ITS-sekvenser från svamp och speciella PCR-primers har tagits fram som bara känner igen ITS-sekvenser från just svamp. Detta gör att ITS metoden är användbar inte bara för att bestämma släktskap mellan olika arter, utan även om man i t.ex. ett markprov vill ta reda på vilka svamparter som har sitt mycel i provet utan att behöva analysera DNA från andra organismer som också finns provet. (Bellemain m.fl. 2010, Kendall och Rygiewicz 2005). Proteingener De allra flesta gener i en organism kodar dock för ett protein, inte för rrna och det är proteinerna som i sin tur styr de flesta mekanismer i cellerna i form av enzymer. Studier av gener som kodar för proteiner används också inom svampsystematiken även om det inte verkar lika vanligt som att studera de ribosomala subenheterna eller ITS-regionerna. En av de proteingener som studerats i svampsystematiken är genen RPB2 som kodar för den nästa största proteinkomponenten som ingår i komplexet RNA polymeras II vars funktion är att översätta en bit DNA till motsvarande bit RNA (Malkus m.fl. 2006). Fördelen med att jämföra proteinsekvenser i stället för att jämföra DNA-sekvenser är att alla mutationer i DNA:t inte behöver påverka proteinet och det är proteinet som har den biologiska funktionen i cellen och därmed kan bidra till evolutionen. Diskussion Att bara titta på yttre karaktärer för att systematisera olika arter är uppenbarligen inte en tillräcklig metod. I svampboken från år 1901 (Romell och Sandberg) baserades indelning på det makroskopiska utseendet hos de sporbildande organen (hymeniet). I fallet med taggsvamparna har denna gamla indelning vid moderna analyser av släktskapsförhållandena visat sig vara alldeles otillräcklig. I en nyare svampbok (t.ex. Ryman och Holmåsen 2006) återfinns taggsvamparna på flera olika ställen. Jag har dock en känsla av att de flesta läsare av svampböcker är hobbysvampplockare som vill kunna känna igen olika arter och skilja dem från möjliga förväxlingsarter (samt få svar på frågan om svampen går att äta och hur den ska tillagas). För dessa användare av svampböcker känns den gamla indelningen med taggsvampar för sig som en mer logisk indelning och om taggsvamparna i själva verket inte är nära släkt med varandra spelar kanske en mindre roll? 9
Att en yttre, väldigt tydlig karaktär som att ha taggar i stället för sporer eller skivor ändå inte visar på ett släktskapsförhållande mellan arter som har denna egenskap tyder på att taggarna har utvecklats flera gånger oberoende av varandra under evolutionens gång vilket är ett exempel på konvergent evolution. Kanske ger det taggsvamparna en fördel i och med att hymeniets yta ökar vilket skulle kunna medföra att det blir lättare att sprida sina sporer och kanske är det inte en så stor genetisk förändring som behövs för att bilda taggar i stället för t.ex. skivor? Trots att molekylärbiologiska metoder används för att systematisera svampsläktet finns fortfarande mycket som ännu är oklart vilket tyder på att metoderna inte är helt och hållet tillräckliga. Problemet kan kanske ligga att man oftast bara analyserar en gen i taget (vilket blir lite som att bara analysera en egenskap) skulle hela genomen vara kända och finnas tillgängliga skulle säkert betydligt bättre resultat erhållas, men det återstår mycket arbete (alternativt metodutveckling) innan forskningen nått så långt. Käll- och litteraturförteckning Böcker Deacon J. (2006) Fungal Biology. Blackwell publishing. Nelson D.L. och Cox M.M. (2008) Lehninger Principles of Biochemsitry. Freeman. Romell L. Och Sandberg H. (1901) D:r M. A. Lindblads svampbok. Rymann S. och Holmåsen I. (2006) Svampar. En fälthandbok. Interpublishing. Wiklund E. (2009) Svampar. Det du behöver veta om svamp och lite till.. Artiklar Abarenkov K. m.fl. (2010) The UNITE database for molecular identification of fungi recent updates and future perspectives. New Phytologist. 186:281-285. Bellemain E. m.fl. (2010) ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals poteintial PCR biases. BMC Microbiology. 10:189. Hibbett D.S. m.fl. (2007) A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycol. Res. 111, 509-547. Høiland K. (2007) Stilksporesoppenes nye system. Agarica. 27, 18-44. Kendall J.M. och Rygiewicz P.T. (2005) Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of envirinmental DNA extracts. BMC Microbiology. 5:28. Malkus A. m.fl. (2006) RNA-ploymerase II gene (RPB2) encoding the second largest protein subunit in Phaeospharia nodorum and P. Avenaria. Mycol. Res. 110, 1152-1164. Mancalvo J.M. m.fl. (2006). The cantharelloid clade: dealing with incongurent gene trees and phylogenetic reconstruction methods. Mycologica 98, 937-948. Weiss M. och Oberwinkler F. (2001) Phylogenetic relationships in Auriculariales and related groups hypotheses derived from nuclear ribosomal DNA sequenceing. Mycol Res. 105, 403-415. Internet Index fungorum (http://www.indexfungorum.org) 101117 Wikipedia (http://en.wikipedia.org/wiki/incertae_sedis) 101116 Wikipedia (http://sv.wikipedia.org/wiki/polymeraskedjereaktion) 101123 10