Kromatografi Kromatografi Ämne A Ämne B eparation Identifiering Tswett, kromatografi, början 900-t artin & ynge, fördeln.krom., 940-t James & artin, GC, 950-t nyde, ber mfl, PLC, 970-t mg Kvantifiering Användningsområde Från små molekyler eller joner till stora biomolekyler eller polymerer Från enstaka ämnen till komplexa blandningar av hndratals komponenter Från blkanalyser till spårämneshalter Kromatografi eparationsmetod, där komponenterna som ska separeras, fördelas mellan två faser, en stationär fas och en mobil fas. obilfas obilfas Den kromatografiska processen Typer av kromatografi Injektion obilfas Tnnskiktskromatografi (TLC), mobilfas - vätska Kolonnkromatografi: ätskekrom. (LC), mobilfas - vätska Gaskrom. (GC), mobilfas - gas perkritisk vätskekrom. (FC), mobilfas sperkritisk vätska 0 min
er Fasaterial (tex partiklar) ätska (adsorberad på fasaterial el kolonnväggen) Bndna faser (bndna till fasaterial) Jonbytare iktande material Respons (m) t 4 t 3 t t (t 0 ) T 0 - injektionstillfälle ) eparation ) Kvantifiering 3) Identifikation Kromatogram Retentionstid eparationsmekanism - fördelning Retentionstid obilfas Analyt C Analyt Analyt Analyt Analyt C t r C K = C m = m K = fördelningskonstant, för separation måste K > 0 m = m L v = t R = L t Retentionsfaktor Retentionsfaktor K = k t t t k = r m r = tr = tm ( + k ) tm tm t r k = m m = β k = retentionsfaktor, fördelningsfaktor, kapacitetsfaktor, fördelningsförhållande,kapacitetsförhållande β = fasvolymförhållande k bör ligga ca -0 k ändras genom temperatr (GC) typ av stationärfas (GC, LC) sammansättning av mobilfas(lc)
t Upplösning t R = ( w + w ) w w Upplösning N α k R s = 4 α + k t Rs = 0.5 r t ( w + w ) r Bra pplösning ämre pplösning R = pplösning α = selektivitet N = effektivitet, antal bottnar k = retentionsfaktor W = toppbredden vid basen elektivitet (α) elektiviteten ändras mha α = K k = K k tr t m α = t t r m (α över för separation) Bra selektivitet ammansättning och typ av mobilfas (LC) Kolonntemperatr (framför allt GC) Typ av stationärfas peciella kemiska interaktioner (tex kirala faser) ämre selektivitet Upplösning Toppform Idealt gassformad N α k R s = 4 α + k R = pplösning α = selektivitet N = effektivitet, antal bottnar k = retentionsfaktor W=4τ Arean nder tangenterna motsvarar ca 96% av totala topparean. t
Effektivitet = bandbreddning per tidsenhet eller längdenhet Effektivitet N = antalet bottnar = bottenhöjd = L/N 6 tr N = w tr N = 5,54 w Låg effektivitet Lågt N ög t R ög effektivitet ögt N Låg w an Deemter-krvan an Deemter-ekvationen GC-mm LC-0 - mm GC B = A + + C GC-cm/s LC-mm/s LC B = + C + C Faktorer som påverkar bandbreddning (effektivitet) an Deemter-krvan Eddy diffsion bandbreddning pga packningsojämnheter A-termen Påverkas av: C Partikelstorlek (diffsionskoefficienter) A (mobilfashastigheten) B/
Faktorer som påverkar bandbreddning (effektivitet) an Deemter-krvan Longitdinell diffsion (B/) B-termen C Påverkas av: Diffsionskoefficienter Typ av mobilfas obilfashastighet Packning A B/ Faktorer som påverkar bandbreddning (effektivitet) otstånd moasstransport i stationärfasen (C s ) an Deemter-krvan Påverkas av: Diffsionskoefficienter C-termen Filmtjocklek alt.adsortions- /desorptionshastigheter C obilfashastigheten otstånd moasstransport i mobilfasen (C m ) A Påverkas av: C-termen B/ Diffsionskoefficienter Kolonndiameter obilfashastigheten Upplösning Ökad pplösning t t R = ( w + w ) w w a b Bättre effektivitet (större n) c d Bättre selektivitet (högre α) Både bättre selektivitet och bättre effektivitet Bra pplösning Dålig pplösning
Optimering N längd flödeshastighet, packning, kolonndiameter, filmtjocklek, viskositet k temperatr, mobilfassammansättning, typ av kolonn α temperatr, mobilfassammansättning, typ av kolonn, specifika kemiska interaktioner Kvantitativ analys (integration av topparea) A Ytan A är proportionell mot koncentrationen/mängden. OB! Alla ämnen har olika responsfaktorer, vilka bestäms genom att injicera kända mängder och ställa pp responskrvor. Kvantitativ analys kan tföras mha intern standard eller extern standard. Extern intern standard Extern standard - kalibreringskrva görs mha flera kända halter av analyten Intern standard kända halter av ett ämne (den interna standarden) sätts till prov och kalibreringslösningar Kompenserar för tex olika injektionsvolym, instrmentinstabilitet, provpparbetningsförlster öga krav på den interna standarden Gaskromatografi obilfas - gas, stationärfas fast eller vätska Gas-solid chromatography, GC Gas-liqid chromatography, GLC Gaskromatografins fördelar Gaskromatograf nabba separationer, fr.ca tim ner till sekndsnabba sep. ög pplösning, t.ex. isomerer m. liten skillnad i kokpnkt Retentionstider kan användas som identifikationshjälp etoden är kvantitativ (topparean är prop. moängden) ög känslighet (m. FID - pikogram, m. ECD - femtogram) Analysen är enkel att genomföra och kan atomatiseras Tryck-/flödeskontroll Injektor Ugn Detektor Förstärkare Begränsning bstanserna måste vara flyktiga och termostabila Bärgas (inert) tex, N, e Kolonn Datasystem
obilfas - bärgas an Deemter-krvan (för kapillärkolonner) Inert Ren och torr äljs beroende på: Detektor Effektivitet äkerhet Pris ETP N A-termen ingår ej. B ETP = + Cg + Cl Gaskromatograf Injektion Tryck-/flödeskontroll Injektor Ugn Detektor Förstärkare malt band Litet prov (split-inj.) Reprodcerbart (atomatiserat) prtinjektion eller loopinjektion Bärgas (inert) tex, N, e Kolonn Datasystem Gaskromatograf Packade kolonner GC-kolonnen Adsorbent (tex aktivt kol, silika,molekylsikt) Tryck-/flödeskontroll Injektor Detektor Förstärkare GC -5 mm -4 m Ugn GLC Bärgas (inert) tex, N, e Kolonn Datasystem Kapillärkolonner 0,-0,3 mm 0-50 m
Kapillärkolonner Ofta tillverkade i fsed silica (FOT) ca 0,5 0,3 mm inre diameter (id) WCOT- wall coated open tblar, filmtjocklek ca 0, 5 µm COT spport coated open tblar, spporttjocklek ca 30 µm Krav på vätskefaser i GLC ögkokande Termostabila Inerta Lämpliga α och k för den specifika separationen er - analyter er GLC, exempel Polära stat.faser, tex -CN, -CO, -O Polära analyter, tex syror, aminer, alkoholer Opolära stat.faser, tex dialkylsiloxaner Opolära analyter, tex mättade kolväten Polydimethyl siloxane 5% Poly(phenylmethyl)silox. 50% Poly(phenylmethyl)silox. Poly(trifloropropylmethyl)sil. Polyethyleneglycol 50% Polycyanopropylmethyl. arnamn tex E-30, DB-, O-,CPil-5CB DB-5, E-54, O-5, CPil-8CB O-7, DB-7, DB-0, O-0, Carbowax 0, CP-Wax5DB, DB-wax O-75, Temperatrprogrammering Gaskromatograf ög temperatr,,3,4,5 7 6 8 Tryck-/flödeskontroll Injektor Detektor Låg temperatr Ugn 3 4 Temperatrprogram fr låg till hög temperatr 3 4 5 6 7 8 Bärgas (inert) tex, N, e Kolonn Datasystem
Önskemål för GC-detektor Känslig Linjär ög stabilitet och reprodcerbarhet Robst och pålitlig Kort responstid Användbar inom brett temp.område Lika känslig för alla ämnen Icke-destrktiv Låga Lft Flamjonisationsdetektorn (FID) 00 olt Kolonnflöde Förstärkare Dator Förbränning av organiskaterial. I lågan bildas joner och en jonström ppstår. Jonströmmen förstärks av en förstärkare. Ingen respons för tex: O, NO, CO, O mm trömreglering armtrådsdetektor (katharometer) Amperemeter Referens Nollställning Glödtrådarna kyls av i förhållande t gasens värmeledningsförmåga. Provgasströmmen balanseras mot referensgasströmmen. Prov Kolonnflöde Elektroninfångningsdetektorn (ECD) Ar/C 4 eller N /C 4 3 eller 63 Ni Elektrod ca 00 (collector) D.C. pänningsdelare (förstärkare) 63 Ni elektroner joniserar bärgasen. En elektrod drar till sig elektronerna från den joniserade bärgasen, vilket ger en standing crrent. När ett elektroninfångande ämne passerar detektorn minskar standing crrent och detta registreras. ycket känslig och selektiv detektor! Ingen respons för kolväten. Bra respons för halogenerade ämnen, nitroföreningar och peroxider. GC- och GC-FTIR Gaskromatografi kopplad till masspektrometer () eller Forier transform infraröd spektroskopi (FTIR) trktrinformation Identifiering Nästa föreläsning ätskekromatografi iniproblem