Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Separation av plasmaproteiner med elektrofores, HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 Årskull: Laborationsrapport i Klinisk laboratoriemetodik 1, termin 4 Laborationsdatum: Inlämnad: Godkänd: Handledare: Granskare:
Abstrakt I levern bildas plasmaproteiner med undantag för immunglobuliner som produceras av B- lymfocyter i benmärgen. Vid en infektion aktiveras leverceller att producera akutfasproteiner som interagerar vid akutfasreaktioner, men vid en hematologisk cancer ökar produktionen av en viss monoklonal immunglobulin (M-komponent). Dessa två proteinproduktioner kan analyseras med elektrofores genom att aminosyrorna görs negativt laddade. Syftet med denna laboration var att analysera tre patienters serumprover mot normala plasma- och serumprover med hjälp av elektrofores HYDRAGEL PROTEIN(E) K20. De tre patienternas prover samt de nytagna plasma- och serumproverna applicerades till agarosgelen och proteinerna in- och avfärgades enligt anvisningarna för elektroforesen. Resultaten för patient 1 och 2 visade varsitt starkt sista band med uppklarnade zoner runtom, detta påvisade att patienterna drabbats av en hematologisk cancer. Den tredje patientens band konstaterade att det pågick en akutfasreaktion till följd av en infektion. Nyckelord Infektion, akutfasproteiner, hematologisk cancer, immunglobulin och elektrofores. 2
Innehållsförteckning Abstrakt... 2 Nyckelord... 2 Innehållsförteckning... 3 Introduktion... 4 Material och metod... 5 Resultat... 6 Diskussion... 7 Referenser... 8 Figurer... 9 Riskbedömning av Blod... 10 Riskbedömning av Natriumazid... 11 Riskbedömning av Natriumbarbital... 12 3
Introduktion Blod består av komponenterna blodkroppar och plasma. Plasmans innehåll är till stor del vatten och proteiner. Plasmaproteinernas huvudsakliga uppgift är att upprätthålla det kolloidosmotiska trycket, transportera lågmolekylära föreningar och utgöra en integrerad del av försvarsmekanismer. I levern bildas de flesta plasmaproteinerna med undantag för immunglobulinerna som produceras av B- lymfocyterna i benmärgen. Vid en infektion eller ett inflammatoriskt tillstånd aktiveras levercellerna att producera plasmaproteiner som interagerar vid akutfasreaktioner, så kallade akutfasproteiner. C- reaktivt protein (CRP) och α1-antikymotrypsin har högst synteshastighet jämfört med α1-antitrypsin, orosomukid, haptoglobin, fibrinogen och komplementfaktorerna C3 samt C4 (1). Vid analys med proteinelektrofores, vilket är en metod för att diagnostisera proteinabnormaliteter i exempelvis serum, kan man se en pågående akutfasreaktion. Detta genom att α1- antitrypsin, haptoglobin och fibrinogen framträder starkare på agarosgelen jämfört med normalserum eller normalplasma (2). Skulle däremot B-lymfocyter öka sin produktion av en viss monoklonal immunglobulin till följd av en hematologisk cancer skulle detta sjukdomstillstånd synas som ett betydligt kraftigare band med uppklarnade zoner runtom (M- komponent) (2,3). För att kunna utnyttja denna metod måste proteinets byggstenar (aminosyror) vara negativt laddade. Genom att ändra aminosyrornas miljö kan de fungera som antingen syror eller baser. Alla proteiner har en isoelektriskpunkt vilket innebär att antalet positiva och negativa laddningar är lika vid ett visst ph-värde. Plasmaproteinernas isoelektriskapunkt infinner sig mellan ph 4,6-7,2 och genom att höja omgivningens ph till 8,5 blir aminosyrorna negativt laddade. De negativt laddade plasmaproteinerna kommer att vandra mot anoden och separeras med avseende på storlek, laddning och form (2). Syftet med denna laboration var att analysera tre patienters serumprover mot normala plasma- och serumprover med hjälp av elektrofores HYDRAGEL PROTEIN(E) K20. 4
Material och metod Venprovtagning: Provtagning enligt föreskrifter gjordes och det användes natriumcitratrör samt serumrör med gel. Elektrofores med HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 kit: Ramens nedre del på applikatorhållaren fuktades med 120 µl destillerat vatten. Ett tunt filterpapper sattes på en agarosgelplatta (agaros 0,8g/dl; Tris- barbitalbuffert ph 8,5 ± 0,1) för att absorbera överflödig fukt från gelen. Agarosgelplattan placerades mot applikatorhållarens nedre del med gelsidan uppåt. Till en applikator applicerades 2 plasma- och 2 serumprover som normala referenser samt serumprover från 3 patienter. Applikatorn sattes till hållarens femte skåra och fick komma i kontakt med gelen i 40 sekunder. Agarosgelplattan placerades med gelsidan nedåt i en elektroforeskammare fylld med buffert (stocklösning + destillerat vatten 1:10, Tris- barbital ph8,5 ± 0,3; natriumazid), enligt gelens polaritet. Elektroforeskammaren kopplades till en strömkälla (sebia) programmerad på 90V och proteinerna fick vandra i 22 minuter. Fixeringssteg: Agarosgelplattan torkades i en inkubator (sebia) vid 80 C i 10 minuter för att fixera proteinerna. In- och avfärgning: Gelen placerades i infärgningslösning (acidviolett+ destillerat vatten, 1:4) under 4 minuter för att sedan avfärgas i avfärgningslösning (stocklösning + destillerat vatten 1:1000, 0,05g citronsyra/dl) fyra gånger, fyra minuter vardera. Därefter torkades gelen likt ovan. 5
Resultat Vandringsträckorna för proteinerna i de normala referens-proverna gav starka tydliga band. För proteinerna i plasmaproverna framträdde ett ytterligare band jämfört med de normala serumproverna och patientproverna. För patient 1 framträdde ett grovt sista band med uppklarnade zoner runtom. Serumprovet för patient 2 gav också ett tydligt sista band med uppklarnade zoner, dock inte lika markant som för patient 1. För patient 3 uppträdde två av banden skarpare utan uppklarningszoner jämfört med patient 1 och 2. De fyra normala referens- proverna visade överlag mörkare band än de tre patient- provernas band (figur 1). 6
Diskussion Det som har stärkt att patienternas prover är serum, är att det inte existerar något fibrinogenband. Hos patient 1 och 2 ses två starka sista band vilket tyder på att de båda patienterna har en M- komponent och de uppklarnade zonerna tydliggör ökad produktion av en viss monoklonal immunglobulin. Sista bandet för patient 1 som är starkare jämfört med patient 2 kan bero på att serumprovet har varit färskare eller att sjukdomsförloppet varit längre framskridet. De två banden som framträder starkare hos patient 3 är belägen där akutfasproteinerna α1 antitrypsin och haptoglobin har sin kända plats. Detta tyder på att patient 3 har en pågående akutfasreaktion i kroppen. Alla normala referens- prover visar mörkare band än patienternas, detta kan bero på att patientproverna har varit frysta och upptinade ett flertal gånger. Proteinerna i patienternas prover har då tagit skada och mängden blivit mindre. 7
Referenser 1 Plasmaproteiner och elektrofores. Biomedicinska analytikerprogrammet, Klinisk laboratoriemetodik 1, Umeå universitet. 2 Elektrofores med HYDRAGEL PROTEIN(E) K20. Laborationsanvisningar, Biomedicinska analytikerprogrammet, Klinisk laboratoriemetodik 1, Umeå Universitet. 3 Wikipedia. Myelom. [Elektronisk]. Tillgänglig<http://sv.wikipedia.org/wiki/Myelom> [2010-02-25] 4 Kemi. Databaser. Ämnesregister. Fenol/kloroform. [Elektronisk] Tillgänglig < http://apps.kemi.se/amnesregistret/default.cfm> [2010-01-19] 8
Figurer Figur 1: Agarosgel med negativa referenser i brunn 1-4 (1-2 plasmaprover och 3-4 serumprover), i brunn 5: patient 1, i brunn 6: patient 2 och i brunn 7: patient 3. 9
Riskbedömning av Blod På vilket sätt är kemikalien farlig? Tänk på att blod alltid ska betraktas som smittat. Det kan innehålla livshotande smittor som kan ge kroniska sjukdomar så som HIV/Aids och Hepatit. Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning Använd alltid handskar och skyddsrock vid exponering. Låt inte skärande och stickande föremål ligga framme oskyddat. Undvik stress vid provtagningar som kan leda till olyckor. Kvarvarande prover, använda kanyler och dylikt skall hanteras som riskavfall. Tänk på att rengöra, sterilisera arbetsytor. Skyddsåtgärder Vid olycka kontakta omedelbart arbetsgivare och uppsök läkare för vidare utredning. Avfallshantering Hanteras och slängs som riskavfall. 10
Riskbedömning av Natriumazid CAS- nr 26628-22-8 På vilket sätt är kemikalien farlig? Miljöfarlig Mycket giftig Den är mycket giftig vid förtäring, utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. Mycket giftig för vattenlevande organismer och kan orsaka skadliga långtidseffekter i vattenmiljön. Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning Använd skyddsutrustning så som skyddsrock, handskar, munskydd, dragskåp och glasögon (aldrig använda linser). Förvaras inlåst, oåtkomligt för barn. Skyddsåtgärder Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan skölj rikligt med vatten, kontakta sedan läkare och visa etiketten. Undvik exponering och vid användning begär special instruktioner. Avfallshantering Hanteras och slängs som riskavfall. 11
Riskbedömning av Natriumbarbital På vilket sätt är kemikalien farlig? Natriumbarbital har en lugnande och sömngivande effekt, är narkotikaklassat. Förtäring kan det leda till döden. Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning Använd skyddsutrustning så som skyddsrock, handskar, munskydd, dragskåp och glasögon (aldrig använda linser). Skall förvaras inlåst och oåtkomligt för barn. Skyddsåtgärder Vid illamående eller annan påverkan kontakta läkare och visa etiketten. Avfallshantering Hanteras och slängs som riskavfall. 12