Dnr 110024 Cellbaserad behandling av det skadade innerörat Slutrapport 2015 Prof. Mats Ulfendahl Institutionen för neurovetenskap Karolinska Institutet Inledning Hörselnedsättning orsakad av skador i innerörat kan endast i begränsad omfattning kompenseras av hörapparater, som i princip endast förstärker och filtrerar det inkommande ljudet. Fungerande hörselsinnesceller, s.k. hårceller, och nervceller i innerörat är en förutsättning för normal hörsel. Skadade hörselceller kan idag, med förvånansvärt gott resultat, ersättas av en inopererad protes, ett s.k. cochleaimplantat. I cochleaimplantat tas ljudet från en högtalare till en elektrod som direkt stimulerar innerörats nervceller. Funktionen hos cochleaimplantat är beroende av en tillräckligt stor population av kvarvarande nervceller samt en effektiv elektrisk stimulering. Omfattande forskning bedrivs i syfte att antingen behandla innerörat så att hörsel- och nervceller överlever efter en skada eller skapa underlag för en cellterapi där skadade celler kan ersättas med nya, implanterade celler. I det aktuella projektet har vi arbetat med att studera vilken skyddsfunktion som erhålls av substanser frigjorda från olika celltyper, hur sinnesceller kan deriveras från stamceller, interaktionen mellan olika exogena celler och celler från innerörat samt bidra till utvecklingen av en elektrod i vilken celler som frisätter aktiva substanser integreras (encapsulated cells). Arbetshypotesen i projektet har varit att en cellbaserad behandling kan bidra till att, efter en skada, bibehålla en population av fungerande celler i innerörat. Detta visar vi också i ett av de arbeten som baseras på det projekt som stötts av AFA Försäkring (Fransson et al., 2015). Arbetet i projektet inriktades initialt på att dels ta fram lämpliga celler för transplantation till innerörat (Ali et al. 2014). Därefter inleddes ett långsiktigt arbete att med utgångspunkt från humana embryonala stamceller utveckla implanterbara nervceller motsvarande de som normalt finns i nervsystemets perifera delar och i innerörat (Ali et al. 2015). Parallellt har vi testat dels hur effektivt faktorer frisatta från olika typer av odlade celler stimulerar tillväxt hos andra celler och dels hur olika kandidatceller interagerar med innerörats vävnad (in vitro) (Dash-Wagh, opubl.). Under projektets senare del har arbetet fokuserat på tester i vår djurmodell av en biolelektrod där s.k. encapsulated cells frisätter aktiva skyddssubstanser. Utöver projektledaren har projektgruppen huvudsakligen bestått av forskaren Suvarna Dash- Wagh, ansvarig för in vitro-studierna, forskaren Anette Fransson, som huvudsakligen arbetat med de djurexperimentella delarna av projektet, och doktoranden Rouknuddin Ali, som utvecklat olika kandidatceller för transplantation. I de delar som rör in vitro-arbetet har också en student, Lovisa Franzén, och en gästforskare, dr. Ibtihel Smeti, deltagit. Vi har liksom tidigare ett nära samarbete med professor Lars Ährlund-Richter (Karolinska Institutet) när det gäller embryonala stamceller och med dr. Jens Tornøe och dr. Lars Wahlberg (NsGene A/S, Danmark) kring s.k. encapsulated cells och utvecklingen av bioelektroden. Nyligen inleddes också ett samarbete med docent Anna Falk (Karolinska Institutet) för att få tillgång till en speciell typ av humana stamceller.
Uppnådda resultat i projektet Utveckling av celler lämpliga för transplantation till innerörat För att få lämpliga celler för transplantation till innerörat har vi arbetat med att utveckla ett protokoll för att ta fram nervcellsliknande celler från humana embryonala stamceller (Figur 1). Figur 1. Schematisk illustration över de olika protokoll som testats för att inducera bildningen av sensoriska nervceller. (Ali et al. 2014) Cellerna var immunoreaktiva för såväl nestin, en vanligt markör för neuronala progenitorceller, som Tuj1, en tidig markör för nervceller (Figur 2). Förekomsten av nestin och Tuj1 minskade gradvis när immunoreaktiviteten för perferin, en markör för sensoriska nerverceller, samt TrkB och TrkC ökade (Figur 3). Immunohistokemiska studier och PCRanalys indikerar att ett visst protokoll ger celler som bör vara mer lämpliga för transplantation. Figur 2. Celler (s.k. neuronal rozettes) deriverade från humana embryonala stamceller märkta med antikroppar mot Tuj1 (grönt), en tidig markör för neuronala celler. Cellkärnorna är märkta med DAPI (blått). Samma celler är också positiva för nestin (visas ej här), vilket visar att de är progenitorceller. Skalstrecket är 50 µm. (Ali et al., opubl.) Figur 3. Expressionen av perferin, TrkB och TrkC i olika cellpopulationer. (Real time PCR ; Ali et al., opubl.) 2 (7)
Med utgångspunkt från det beskrivna arbetet har vi försökt öka andelen celler med en lämplig fenotyp för implantation genom att påverka olika signalvägar, exempelvis för att stimulera differentiering (Figur 4-5). Figur 4. Blockering av signalvägen TGF-β (med molekylen SB431542; SB) resulterade i ett ökat uttryck av transkriptionsfaktorn GATA3 i celler deriverade från humana embryonala stamceller. (Ali et al., opubl.) Figur 5. Immunohistokemisk märkning för markörer för sensoriska nervceller. De neuroepiteliala stamcellerna behandlades med s.k. small molecules (ISX9,isoxazole 9, och SB431542; två molekyler som stimulerar nybildning av nervceller samt blockerar signalvägen TGF-β). Skalstrecket är 20 µm (Ali et al. 2015) 3 (7)
Frisatta substanser med effekt på målvävnaden (conditioned media) En betydande del i projektet har varit att studera effekten av de faktorer olika typer av celler (exv. från hörselsystemet eller stamceller) frisätter. Utöver att använda detta i försök att påverka olika cellpopulationer ger den typen av experiment en möjlighet att indentifiera specifika substanser som skulle kunna användas för läkemedelsutveckling. I försöken odlades cellerna in vitro och odlingsmediet, s.k. conditioned medium, samlades upp vid olika tidpunkter. Detta conditioned medium tillfördes sedan andra celler (in vitro) och effekten på tillväxt och överlevnad studerades. I en serie försök med ett ett modellsystem baserat på SH-SY5Y-celler har vi undersökt hur substanser frisatta in vitro från hörselorganet respektive spiralgangliet påverkar utväxt av nervcellsutskott, neuriter. Resultaten visar att conditioned medium från innerörats vävnader har en positiv effekt på utväxten av nervcellsutskott (Figur 6). Figur 6. Utväxt av nervcellsutskott stimuleras av conditioned medium från hörselorganet (OCCM) och spiralgangliet (SGNCM). Till vänster ses AH-AY5Y-celler som odlats i närvaro av condition medium. Pilarna visar att det bildas längre utskott jämfört med kontrollen. Utskottens längd var signifikant större i närvaro av båda typerna av conditioned medium (höger). (Dash-Wagh, opublicerat.) Conditioned medium från hörselsystemets vävnader användes också för att undersöka eventuell påverkan på neuronal differentiering av omogna celler deriverade från humana embryonala stamceller. Här har vi kunnat visa en effekt på differentiering mot nervcellsliknande celler av faktorer frisatta från det perifera hörselsystemet (hörselorganet och spiralgangliet) men inte av conditioned medium från hjärnstammen. Cellöverlevnaden ökade, vilket visar att vävnaden frisätter också trofiska faktorer. Alla tre typer av conditioned medium hade en positiv effekt på nervcellsutskottens tillväxt (Figur 7). Figur 7. Stimulering av utväxt av närvcellsutskott från differentierade neuronala progenitorceller (deriverade från humana embryonala celler) i närvaro av conditioned medium från hjärnstammen (BSCM), hörselorganet (OCCM) och spiralgangliet (SGNCM). En tydlig och signifikant effekt på nervcellsutskottens längd sågs speciellt i närvaro av conditioned medium från spiralgangliet (SGNCM). (Dash-Wagh et al., opublicerat.) 4 (7)
Utveckling av en bioelektrod Framtagandet av en implanterbar kombination av en stimuleringselektrod och celler med effekt på målvävnaden, en s.k. bioelektrod, har varit ett av projektets huvudsyften. Detta har skett i nära samarbete med det danska företaget NsGene och innefattat såväl in vitro- som in vivo-försök (se nedan). Tekniken baseras encapsulated cells, d.v.s celler inneslutna i en kapsel med ett semipermeabelt membran som medger frisättning av substanser samtidigt som cellerna hålls på plats. In vitro-försöken har syftat till att både testa de substanser som frisätts från de cellinjer som används (Figur 8) och direkt testa effekten av att kombinera de inkapslade cellerna (i en speciell struktur, device ) på vävnad från hörselorganet (Figur 9-10). Figur 8. Utväxt av nervcellsutskott från spiralgangliet (in vitro) efter behandling med conditioned medium från en celltyp som utsändrar tillväxtfaktorn BDNF (två olika koncentrationer, 10 och 50 ng/ml). (Dash-Wagh et al., opublicerat) Figur 9. Tillväxtfaktorer från encapsulated cells i devices stimulerade överlevnad av celler från innerörat. I dessa försök sågs speciellt god effekt av BDNF. (Dash-Wagh, opublicerat) Figur 10. Faktorer frisatta från en device (med encapsulated cells) placerad i samma vävnadskultur som celler från hörselorganet stimulerade såväl utväxt av nervcellsutskott (neurites) från spiralgangliet (in vitro) som deras längd. Tydligast effekt sågs med BDNF. (Dash-Wagh et al., opublicerat) 5 (7)
En omfattande serie försök har gjorts där en device med inkapslade celler placerats i marsvinets hörselorgan samtidigt som en stimuleringselektrod implanterats (Figur 11). Härigenom har det varit möjligt att studera huruvida de faktorer som frisätts från de inkapslade cellerna har förmåga att skydda hörselorganets celler från fortsatt degeneration orsakad av en experimentell hörselskada (i marsvinsmodellen dövgörs djuren kemiskt före implantationerna). Försöken har varit mycket lyckade och tydligt visat både överlevnad och bibehållen funktionalitet i form av elektrisk retbarhet (Figur 12). Figur 11. Vänster: En fripreparerad hörselsnäcka från marsvin (cochlea). I nedre delen ses änden på en device (vänster) samt stimuleringselektroden (höger). Nedan: En tvärsnittad device med GDNF-frisättande celler (encapsulated cells). (Fransson et al., opubl.) Figur 12. Resultat från in vivo-försök med inkapslade celler. Den vänstra bilden visar hur elektriska trösklar förändrades efter dövgörning (Vecka 0) och implantation (Vecka 3) av en device innehållande antingen inga celler alls ( Empty device ) eller celler frisättande BDNF eler GDNF. I kontrollsituationen (utan tillväxtstimulering) stiger trösklarna (d.v.s. djuret hör sämre) som förväntat medan i närvaro av i synnerhet GDNF så hålls de på en signifikant (p<0,05) lägre nivå. Detta innebär att hörselsnäckans elektriska retbarhet är bibehållen, d.v.s. en bevarad funktionalitet. Till höger illustreras att antalet celler (densiteten) också var högre i inneröronen hos de djur som implanterats med devices som frisätter tillväxtfaktorer. (Fransson et al. 2015) 6 (7)
Avvikelser i projektet utifrån projektbeskrivningen Projektet har till största delen genomförts enligt den ursprungliga planen. Initialt var avsikten att i vår djurmodell testa om implanterade celler deriverade från humana stamceller kunde, genom sin fysiska närvaro i vävnaden eller genom frisatta substanser, bidra till att reparera skadade celler. De försöken har endast i begränsad omfattning kunnat göras p.g.a. svårigheter att dels få god överlevnad av implanterade celler och dels tekniska problem att vid den histologiska analysen med tillräckligt stor säkerhet kunna särskilja implanterade celler från värddjurets egna celler. Projektets arbetshypotes, att en cellbaserad behandling kan bidra till att bibehålla en population av fungerande celler i det skadade innerörat har dock bevisats genom våra avslutande djurförsök (Fransson et al., 2015). Insatser som skett och planeras för att resultatet ska komma till praktisk användning i arbetslivet Resultaten har rapporterats vid vetenskapliga konferenser och har eller kommer att publiceras på sedvanligt vis. Genom vårt samarbete med det danska företaget NsGene och den europeiska cochleaimplantattillverkaren MedEl säkerställs att resultaten tas vidare i studier som i ett längre tidsperspektiv har möjlighet att komma till praktisk nytta i sjukvården och därmed bidra till rehabilitering av yrkesverksamma individer med hörselskador. Vetenskapliga rapporter baserade på projektets resultat Ali RQ, Blomberg E, Falk A, Ährlund-Richter L, Ulfendahl M (2015) Induction of sensory neurons from neuroepithelial stem cells by the ISX9 small molecule. Submitted to American Journal of Stem Cells. Ali R, Cheng Y, Kostyszyn B, Ährlund-Richter L, Ulfendahl M (2014) Differentiation of human embryonic stem cells towards a sensory neural phenotype. Advances in Stem Cells, Vol. 2014, Article ID 252491, DOI: 10.5171/2014.252491 Dash-Wagh S, Ali RW, Ärhlund-Richter L, Ulfendahl M (2015) Influence of target tissue on survival and differentiation of neurons derived from HES cells. In preparation. Fransson A, Tornøe J, Wahlberg L, Ulfendahl M (2015) Preservation of auditory neuron function by an encapsulated cell device implanted in the deafened guinea pig. In preparation. 7 (7)