KORTSVARSFRÅGOR 1. Restriktionsenzymet KpnI klyver sekvensen 5 -GGTACC-3 och lämnar ett fyra basers 3 -överhäng. Enzymet BamHI klyver sekvensen 5 -GGATCC-3 och lämnar ett fyra basers 5 överhäng. Ange det längsta DNA-fragmentet som bildas efter klyvning av nedanstående given sekvens (3p). 5 -GATCGGTACCATCGCTATCTCGGGATCCGATC-3 3 -CTAGCCATGGTAGCGATAGAGCCCTAGGCTAG-5 SV: 5 - CATCGCTATCTCGG-3 3 -CATGGTAGCGATAGAGCCCTAG-5 2. Vilken enzymatisk aktivitet har alkaliskt fosfatas och vad är dess vanligaste användningsområdet? (2p) SV: defosforylerar 5 -ändan på DNA fragment. Defosforylaring av plasmider före ligering för att förhindra självligering. 3. Hur många PCR produkter har man efter 3 cykler av PCR om man startar med en templatmolekyl? (1p) SV: 1x2 3 =8 4. Fråga: Hur stort är det mänskliga genomet, ungefärligt antal baser, ungefärligt antal gener? Ungefär hur stor del av människans DNA representeras av proteinkodande gener? (3p) Svar: Det humana genomet innehåller ca 3 miljarder baspar, Ca 22,000-25,000 unika gener (genomet), endast ~1,5% är alltså proteinkodande sekvens. (och > 50% är repetitivt DNA). 5. Ge exempel på tre olika reportergener (3p) SV: Luciferase, LacZ, GFP, alkaline phosphatase, CAT (chloramphenicol acetyl transferase) 1
6. Nämn tre vanliga transfektionsmetoder? (3p) Katjoniska lipider, Electroporering, CaPO 4 metoden, DEAE-dextran metoden, virus och mikroinjektion. 7. Vad är skillnaden mellan en promotor och en enhancer i en gen? (2p). SV: Promotorn ligger vid transkriptionsstartsitet och binder RNA polymeras medan en enhancer kan ligga långt från startsitet (både före i och efter genen) och påverkar aktiviteten av promotorn.. 8. Ge 3 experimentella metoder för att studera protein-protein interaktioner. (3p) SV: Mammalian två-hybrid jäst två-hybrid GST pull-down assay Biacore system (Surface plasmon resonance) co-immunoprecipitation Phage display FRET Protein microarrays ChIP med rechip 9. Beskriv kortfattat hur Cre/loxP systemet fungerar. (3p) SV. Cre/loxP systemet är utvecklat från bakteriofag P1 och används ofta för att göra konditionella knockouter. Cre är ett enzym, ett recombinase, som orsakar rekombintion mellan två loxp sites (en 34 bp lång sekvens). Detta resulterar i att sekvensen mellan två loxp sites avlägsnas och endast ett loxp site blir kvar. 2
10. Vad är cdna? Hur framställs det? Vad är ett cdna bibliotek?(3p) SV: cdna är DNA komplementär till mrna. Det framställs med hjälp av mrna som template samt enzymet reverse transcriptas och antingen random primers eller oligo dt primer. Ett cdna bibliotek är cdna från en cell linje eller vävnadstyp inklonat i en vektor. cdna bibliotek kan användas för att leta efter gener som är uttryckta i en viss vävnad. 11. Why is EMSA also called gel shift assay?(2p) SV: When a protein is bound to the DNA, the DNA is a lot heavier, resulting in retardation of the DNA in a non-denaturing gel. This results in a shift of the DNA band in the gel. 12. Why can we say that ChIP is an in vivo method, even though most of the experimental procedure is in vitro?(2p) SV: Because we cross-link the proteins to DNA while the cells are alive or directly in the tissue. The resulting binding is so stable that it survives all the in vitro treatments. So what we get in the end is a snap-shot of what happened in a living cell. 13. How does ligand-binding to nuclear receptors influence their transcriptional activity? (2p) SV: cytoplasmic-nuclear transport, coactivator (coregulator) recruitment, corepressor release 3
BERÄTTARFRÅGOR 14. Du ska klona in sekvensen angiven nedan, i EcoRI sitet på plasmiden pbs. Du har tillgång till cdna från celler som uttrycker denna sekvens som kan användas som templat i PCR-reaktioner (både sense och antisense strand ges nedan). EcoRI klyver sekvensen GAATTC. Sekvensen som ska klonas: 5 CGCGAATGCGCGAATATGCGCGTATATGCGCGCTATGGGCCCCGTATATTGTGTGAGAGA 3 GCGCTTACGCGCTTATACGCGCATATACGCGCGATACCCGGGGCATATAACACACTCTCT GGGGAGAGAGGGAGAGAGGGCGCGCGAGAGAGTTTTAGGATGATTAGATAGATGATATGAGA CCCCTCTCTCCCTCTCTCCCGCGCGCTCTCTCAAAATCCTACTAATCTATCTACTATACTCT TGTATATTATATATTGGGCGCGCGTATTAGCGCTAGGCTCGATGCTAGCTGATGCGGCT 3 ACATATAATATATAACCCGCGCGCATAATCGCGATCCGAGCTACGATCGACTACGCCGA 5 A. Ange DNA-sekvensen på två stycken primers som kan användas för att amplifiera sekvensen med PCR och samtidigt få den flankerad av EcoRI sites. (4p) B. Beskriv dessutom vilka steg som måste utföras för att klona in PCR-produkten i EcoRI sitet i pbs samt rena fram den slutliga plasmiden. (3p) SV A. primer 1 5 GATCGAATTCCGCGAATGCGCGAATATGCG primer 2 5 GATCGAATTCAGCCGCATCAGCTAGCATC (Röda nucleotider = extra baser för att kunna klyva, kan vara andra) B. 1. Rena PCR produkten 2. Klyv vektor och PCR-produkt med EcoRI 3. Defosforylera vektorn 4. Värmeinaktivera både vektor och klyvd PCR-produkt. 5. Ligera PCR-produkt + vektor. 6. Transformera ligering 7. Plocka bakteriekoloni och starta kultur 8. Rena plasmid 4
15. Du jobbar på ett läkemedelsbolag där kemisterna har framställt några substanser som är tänkta att vara ligander till östrogenreceptorerna. Hur kan du undersöka om detta är fallet? (6p) SV: Genom att använda mammalian två hybrid system bestående av Gal4DBD fuserad co-activator och ligandbindande domän av någon av östrogenreceptorerna fuserad till VP16 aktiveringsdomän. Som reporter används en plasmid med Gal4 bindningssites framför en promotor som driver en reportergen. Alternativt använd en reporter med östrogenresponse element framför en minimal promotor drivande en reportergen. 5
16. Du studerar ett protein, Callas2. Hur kan du identifiera proteiner som interagerar med detta protein? (6p) (rita gärna figur) SV: Använd jäst två-hybridsystemet klona in Callas2 i en vektor med en Gal4DBD. Transformera vektorn och ett cdna-bibliotek bestående av cdna fuserat till en Gal4AD från en celltyp där du tror att det finns interagerande proteiner. Odla den transformerade jästen på agarplattor som saknar Trp, Leu och His. Isolera plasmid DNA från jästkolonier som bildas på plattorna och sekvensera dessa. Sekvensen du erhåller borde innehålla cdna sekvensen för ett protein som kan binda till Callas2. Allternativt svar: Det går även att använda metoder som bygger på proteinrening och proteinsekvensning. 6