Molekylärbiologiblocket Molekylärbiologins centrala dogma m Nukleinsyror (struktur och egenskaper) och replikation: DNA o RNA Transkription: mrna Translation: Protein
Nukleinsyrornas uppbyggnad Två olika nukleinsyror: DNA deoxyribonukleinsyra RNA ribonukleinsyra Monomererna som bygger upp nukleinsyrorna kallas NUKLEOTIDER. En nukleotid består av tre delar: en fosfatgrupp en sockerenhet en kvävebas v v Nukleinsyra
Nukleinsyrornas uppbyggnad Båda sockermolekylerna är pentoser Deoxy betyder från syre I RNA ärsockretribosochidna ärsockretdeoxyribos: Deoxyribos Ribos
Nukleinsyrornas uppbyggnad Det finns fem olika kvävebaser som delas in i två grupper efter deras struktur: Purinbaser Bicykliska A G Pyrimidinbaser Monocykliska C U T I DNA finns: A G C T I RNA finns: A G C U
Nukleinsyrornas uppbyggnad Sockretochkvävebasenkopplassammanvia en N-glykosidbindning en nukleosidbildas: N Syftar till konfigurationen på bindningen Kvävebas H OH N C + H 2 O Socker Nukleosid = Kvävebas + socker C H H Vatten spjälkas av vid ihopkopplandet
Nukleinsyrornas uppbyggnad När en fosfatgrupp kopplas på C5 erhålls en nukleotid. 5 4 3 1 2 Guanin Nukleotid = Kvävebas Socker Fosfat Jämför med ATP Ribos Guanosin 5 -monofosfat (GMP) Energirika bindningar Adenosin 5 -trifosfat Nukleotid med tre fosfatgrupper Jämför med dgmp Deoxyguanosin 3 -monofosfat 3 Deoxyribos http://www.kursnavet.se/kurser/ke1202/ htm/m06/61040.htm
Nukleinsyrornas uppbyggnad Nukleinsyror bildas när nukleotiderkopplas samman. Två nukleotider förbinds via fosfatgruppen i en FOSFODIESTER-BINDNING. Det är C3 i ett socker som förbinds med C5 i nästa. Tymin Utgångsmaterialet för syntes av nukleinsyra är TTP, ATP, CTP, GTP energikrävande process!! 3 5 Adenin Nukleotid som har tre fosfatgrupper 3 Cytosin 5 3 Guanin Fosfodiester bindning 5
Nukleinsyrornas uppbyggnad I nukleinsyrorna kopplas sockermolekylerna ihop med varandra via en fosfatgrupp Kolatom 3 på e kol förbinds med kolatom 5 på nästa 3,5 -fosfodiesterbindning Notera att fosfatgruppen bär en negativ laddning detta gör fosfodiesterbindningenmer stabil än en vanlig esterbindning det är svårare för OH - att attackera bindningen då minusladdningarna repellerar varandra Detta gör att nukleinsyran inte kan brytas ner så lätt!!
Nukleinsyrornas uppbyggnad Ordningen på kvävebaserna står för den genetiska informationen!! Tre kvävebaser i sekvens motsvarar en viss aminosyra i ett protein kallas för kodon
Nukleinsyrornas uppbyggnad En DNA-eller RNA-sekvens skrivs ALLTID 5 3 så att inte missförstånd ska uppstå (precis som proteinsekvensen alltid skrivs N C). Man börjar med den nukleotidsom har en fri OH-grupp i 5 -positionen OH Man slutar med den nukleotidsom har en fri OH-grupp i 3 - positionen Jämför med OH H
Nukleinsyrornas uppbyggnad DNA är dubbelsträngat medan RNA är enkelsträngat. En DNA-molekyl består av två antiparallella nukleotidkedjor. Den ena kedjan löper 5 3 och baspararmed en annan kedja som går 3 5. 5 3 3 5 De två kedjorna är komplementära till varandra. Kedjorna associeras spontant Vätebindninger mellan kvävebaserna håller ihop kedjorna
Nukleinsyrornas uppbyggnad I DNA-helixen basparar cytosin(c) med guanin(g) adenin(a) med tymin(t) 3 vätebindningar mellan G och C 2 vätebindningar mellan A och T
Nukleinsyrornas uppbyggnad Den 3-dimensionella formen av DNA presenterades 1953 av Watson & Crick 3 5 5 3 DNA spiral eller DNA helix: -Två DNA kedjor som är virade runt varandra - Kedjorna hålls samman med vätebindningar mellan kvävebaserna
Nukleinsyrornas uppbyggnad Fosfatgrupperna och sockerenheterna sitter på utsidan och kvävebaserna inåt. Eftersom en större pyrimidinbasalltid baspararmed en mindre purinbasär helixens diameter hela tiden konstant 20Å(1Å = 0.1 nm). Basparen sitter vinlkelrätt mot helixaxeln 20 Å http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/pa ge/molecular%20biology/dna-structure.html
Nukleinsyrornas uppbyggnad Minor groove Major groove Minor groove Major groove http://academic.brooklyn.cuny.edu /biology/bio4fv/page/molecular%2 0biology/dna-structure.html 20 Å Högervriden helix Ett varv i dubbelhelixenär 34 Å(1Å = 0.1 nm) och innehåller 10 baspar. På ett varv finns en MAJOR GROOVE och en MINOR GROOVE. I dessa fördjupningar kan proteiner fästa. Utsidan av helixen är negativtladdad (fosfatgrupper) vilket stabiliserar DNA-helixen. Positivt laddade joner (katjoner) som Na + och Mg 2+ associerastill DNA:t.
Nukleinsyrornas uppbyggnad DNA:ti cellkärnan är uppvirat på positivt laddade proteiner, s k histoner,vilket ger effektiv tätpackning (1 m DNA/cell kan packas till μm-skala) Elektronmikroskopbild på DNA som visar pärlor på en tråd. Pärlorna är proteinkomplex som DNA kedjan är uppvirad kring Schematisk bild som visar tätpackning av DNA uppvirad runt histoner Prokaryot DNA är cirkulärt medan eukaryot DNA är linjärt.
Olika strukturvarianter av DNA: - A-DNA - B-DNA - Z-DNA Cellulärt DNA: Vanligen B-DNA Nukleinsyrornas uppbyggnad A-DNA: Kortare och bredare högervriden helix där basparen inte är vinkelräta mot helixaxeln. HybridhelixarDNA-RNA som temporärt bildas har en struktur som påminner om A-DNA. Deoxyribosenhetenhar en annan konformation än i B-DNA.
Nukleinsyrornas uppbyggnad Z-DNA: Vänstervriden helix. Där fosfatgrupperna sitter i sicksack (Z-DNA). Uppkommer vid sekvenser med varannan purinoch varannan pyrimidinsom CGCGCG. Man har funnit proteiner som känner igen just sådana här sekvenser genom deras speciella struktur.
Denaturering av DNA Eftersom dubbelhelixenbara hålls samman av nonkovalenta bindningar (vätebindningar) räcker det att värma ett DNA-prov för att de två kedjorna ska separera. När DNA-kedjorna separeras säger man att DNA:tdenatureras eller smälter. Vilken temperatur som krävs beror på andelen GC-basparrelativt AT-baspar-Högre temperatur krävs vid flera GC-basparpga3väte-bindningaristället för 2hos AT. Om temperaturen sänks återbildas dubbelhelixenspontant. Man kan följa denatureringen spektrofotometrisktvid 260 nm. Denaturerat DNA absorberar mer ljus än den nativa formen eftersom kvävebaserna som svarar för absorptionen exponeras i denaturerat DNA. HYPOKROMISM T m -den temperatur som krävs för att hälften av helixarna ska ha förlorat sin struktur (ca 80-90 C)
Denaturering av DNA Enkelsträngat DNA har en högre absorbansvid 260 nmjämfört med dubbelsträngat DNA
Enkelsträngat RNA Även enkelsträngat RNA bildar väldefinierade tredimensionella strukturer som stabiliseras av vätebindningar. Vätebindningarna binder ihop olika delar av en och samma RNA-kedja. Ett vanligt motiv är s k hårnålsloopar RNA-molekyl Även DNA kan bilda hårnålsloopar
Molekylärbiologins centrala dogma m Replikation:Bassekvensen i DNA står för den genetiska informationen. När en cell ska delas måste DNA:tdupliceras man måste få nytt DNA med exakt samma bassekvens som originalet. Vid proteinsyntes överförs informationen från DNA till aminosyrasekvens i två steg: Transkription:Bassekvensen i DNA översätts till bassekvens i mrna. mrnafungerar sedan som mall för proteinsyntesen. Translation:Bassekvens i mrnaöversätts till aminosyrasekvensm h a trna. Processen sker på ribosomerna. En sekvens av tre baser utgör den GENETISKA KODEN och specificerar en viss aminosyra.
Replikationen Först måste de två DNA-kedjorna separeras och sedan ska två nya kedjor bildas med originalen som mallar: Eftersom det i varje ny DNA-molekyl kommer att finnas en ny och en gammal DNA-kedja säger man att DNA-replikationen är SEMIKONSERVATIV. (DNA) n + dntp (DNA) n+1 + PP i (dntp= deoxy-nukleotid-tri-fosfat) Det är en energikrävande process dntp = datp, dctp, dgtp, dttp Reaktionen katalyseras av DNA-polymeraser.
Reaktionsmekanism för formation av en ny fosfodiesterbindning 1. Ny trifosfatnukleotidbinder först till mallkedjan genom basparningi.e. vätebindning mellan två matchande kvävebaser 2. Hydroxylgruppenpå C3 i den intilliggande nukleotidengör en nukleofilattack på den innersta fosfor-atomen i den nya trifosfatnukleotiden. 3. PPihydrolyseras och den nya nukleotidensätts ihop kovalent med resten av DNA kedjan 4. Energikrävande process. Pyrofosfat(PP i ) hydrolyserasvarvid energi frigörs
Reaktionsmekanism för formation av en ny fosfodiesterbindning Nukleofil attack av OH på C3 3 3 5 3,5 -fosfodiesterbindning 5 5 Ny nukleotid 3 H-bindningar Fosfaten är kopplad från C3 i kedjan till C5 i nästa socker, alltså 3,5 -fosfodiesterbindning. Kedjan växer 5 3 förklaring till varför man valt att alltid skriva sekvensen 5 3
DNA polymeras DNA-polymeraserkräver en primerför att kunna starta syntes av en ny kedja. Primernutgörs av en kort RNA-sekvens och det viktigaste strukturmotivet är en fri 3 -OH-grupp: Katalyserar syntes av primer I eukaryot DNA startar replikationen på flera ställen och pågår tills hela DNA är replikerat LINJÄRT I prokaryotdna (E.coli) så finns ett startställe - CIRKULÄRT RNA-primern tas bort av DNA-polymeras I och ersätts av rätta deoxynukleotider
DNA polymeras Finns flera olika DNA-polymeraser men de viktigaste är: DNA-polymeras III: Främst ansvarig för polymerisationen av den nya kedjan. DNA-polymeras I: Kontrollerar att rätt nukleotidsatts in. DNA-polymeras I har EXONUKLEAS-aktivitetvilket innebär att om ett fel upptäcks kan polymeraset klippa bort det och sätta in rätt nukleotid istället. Mycket viktigt eftersom fel vid replikationen kan få stora konsekvenser!
Replikationen Problem: DNA-polymeras katalyserar bildande av ny DNA-kedja 5 3 och rör sig längs den gamla kedjan 3 5. Men en av kedjorna i helixen exponeras ju 5 3. Lösning: Den ena kedjan syntetiseras diskontinuerligt i s k Okazakifragment. FEL HÅLL!! För varje Okazakifragmentkrävs en primer och för att sedan koppla ihop fragmenten krävs ytterligare ett enzym, DNA-ligas. 5 5 3 3 RÄTT HÅLL!! 3 5 5 5 3 Lagging Leading Laggingstrand formar en loop vid DNA syntesen så att polymeriseringen av den komplementära DNA-strängen får samma riktningsom den nya DNA strängen som är komplementär till leading strand 3 5
Proteiner som är viktiga vid replikationen: Replikationen Topoisomeras och helikas: Öppnar upp dubbelhelixen. Singlestrand bindingproteins : Binder till enkelsträngat DNA som temporärt bildas och skyddar det från nukleaser som annars attackerar enkelsträngat DNA och bryter ner det. Primas: Katalyserar bildandet av RNA-primers som behövs för att DNA-polymerasetska kunna syntetisera ny kedja. Ligas: Kopplar ihop fragment kovalent.
Uppgift Komplementärt DNA Den ena kedjan är i DNA är: 5 CGGATATGTACCTTTACGTA 3 Ange den komplementära sekvensen från 5 3
Mutationer i DNA PUNKTMUTATIONER Tre typer: SUBSTITUTION: DELETION: INSERTION: en kvävebas byts ut mot en annan en bas tas bort en bas sätts till De två sista är allvarligast eftersom de förskjuter hela läsramen. Substitution är vanligast och finns i två varianter: *TRANSITION purin purin pyrimidin pyrimidin *TRANSVERSION purin pyrimidin pyrimidin purin Felfrekvens: 1/10 10 nukleotider
Mutagener Kemiska mutagener: Ämnen som liknar de normala baserna och därför kan inkorporeras i deras ställe. Ex. 5-bromouracil. Ämnen som modifierar befintliga baser vilket leder till mutationer vid nästa replikation. Ex. HNO 2 (reduktionsmedel) Ämnen som interkalerar, binder in mellan baserna, i DNAstrukturen och kan uppfattas som en bas vid nästa replikation. Ex. etidiumbromid. http://en.wikipedia.org/wiki/file:5- Bromouracil_structure.png UV-ljus: UV-ljus kan leda till ihopkoppling av närliggande tyminer. Skydd: Reparationsmaskineri i tre steg: Felet upptäcks och felaktig bas tas bort olika enzymer för olika fel. Ny korrekt bas sätts in av DNA-polymeras I. Kedjan kopplas ihop av DNA-ligas.
Mutationer - konsekvenser Flera cancersjukdomar orsakas av defekt DNA-reparationsmaskineri: Exempel: I sjukdomen Xeroderma pigmentosum saknas enzymet som tar bort tymindimerernasom bildas vid exponering för UV-ljus. Patienterna får hudcancer och dör ofta innan de fyllt 30 år. Tyst mutation: En mutation som ger skillnad på DNA-nivå men inte på proteinuttrycket pgaatt den genetiska koden är degenererad Detta återkommer vi till vid nästa lektion!