Tentamen Bke1, 10p, 25e Maj 1999. Riktmärke för godkänt 50% (53p av totalt 106 möjliga). Börja svara på varje fråga på ett nytt papper (detta underlättar rättningen av skrivningarna)! Glöm ej kodnummer på varje blad! Vi vill inte ha några uppsatser tillbaka; alla (del)frågor kan besvaras med ett fåtal meningar! Lycka till! 1. Rita en generell formel för en tripeptid vid ph 7 (markera sidokedjan med ett R. (1.5p). a) Markera med en pil vilka bindingar som är peptidbindingar (0.5p). b) Vilka bindingar i huvudkedjan kan roteras fritt (ange mellan vilka atomer)? (1.0p) c) Vilken nettoladdning har terminalerna vid ph 5 respektive ph 8? (1.0p) Totalt 4p Rättningsmall fråga 1: a) b) mellan N och Ca (0.5p); Ca och C (0.5p). c) vid ph 5: NH 3 + ------ COOH (0.5p); vid ph 9: NH 2 ------ COO - (0.5p) 2. Om vi har ett enyzm som har subenhetskompositionen a 3 b 3 gd, och varje b- subenhet har två domäner, hur många N- respektive C-terminaler finns det? (1p) Rättningsmall fråga 2: 8 st av varje (en N- och C-terminal per subenhet). (1p)
3. Du vill rena myoglobin och har från att annat laboratorium fått ett prov som man gjort genom att fälla ut proteiner ur ett muskelextrakt med hjälp av ammoniumsulfat. Detta extrakt innehåller proteinerna serumalbumin, hemoglobin, myoglobin och cytokrom c. Föreslå en metod att rena myoglobin från de andra proteinerna. Du har bestämt dig för att arbeta med en buffert vid ph 8.0. Följande är känt om myoglobin och de kontaminerande proteinerna: Serumalbumin har pi 4.9 and M W (molekylvikt) 67.000 Hemoglobin har pi 6.8 and M W 65.000 Myoglobin har pi 7.0 and M W 17.000 Cytokrom c har pi 10.6 and M W 12.000 Samtilga proteinerna innehåller tryptofan och absorberar alltså vid 280 nm. Tips: Du kan använda mer än en typ av kolonnkromatografi. (5p) Rättningsmall fråga 3: Slutsatser: Serumalbumin har pi 4.9, så dess laddning vid ph 8.0 kommer att vara starkt negativ. Hemoglobin har pi 6.8, så dess laddning vid ph 8.0 kommer att vara negativ. Myoglobin har pi 7.0, så dess laddning vid ph 8.0 kommer att vara negativ. Cytokrom c har pi 10.6, så dess laddning vid ph 8.0 kommer att vara positiv. Serumalbumin och hemoglobin har molekylvikter i samma område liksom myoglobin and cytokrom Föreslaget reningsschema: Lös upp ammoniumsulfatfällningen i bufferten. Börja sedan med att köra en gelfiltreringskolonn. Detta bör ge huvudsakligen två toppar: en med serumalbumin och hemoglobin som eluerar först (högre M W ) och en senare topp med myoglobin som förmodligen kommer att åtminstone partiellt eluera tillsammans med cytokrom c. (2p) Efter analys av fraktionerna vid 280 nm (alla proteiner innehåller tryptofan) och på SDS-geler kan du slå samman de fraktioner som innehåller myoglobin och fortsätta med en jonbytarkolonn t.ex. DEAE-Sepharose. Vid ph 8.0 bör myoglobin binda och cytokrom c som är positivt laddat går rakt igenom med tvätten. (2p) Eluera myoglobinet med en saltgradient t.ex. 0-0.5 M NaCl (1p). Man kan också köra dessa kolonner i omvänd ordning MEN då måste man inkludera ett steg med dialys för att ta bort ammoniumsulfatet från provet innan man kör jonbytaren. Annars binder ingenting!
4. Varför är enzym som katalyserar reaktioner nära ekvilibrium (near-equilibrium reactions) i regel inte reglerade? I motsatts till ovan nämnda enzym är de som katalyserar metaboliskt irreversibla reaktioner i allmänhet reglerade. Beskriv tre olika mekanismer för att reglera ett enzym (4p). Rättningsmall fråga 4: Den fria energin DG för en reaktion ges av där DG = DG 0 + RTlnQ Q = [Produkter] / [Reaktanter] (För t.ex. reaktionen A + B == C + D blir Q = [C][D] / [A][B]) För reaktioner nära ekvilibrium gäller att DG 0 + RTlnQ 0, d.v.s. DG 0 -RTlnQ -RTlnK eq Små förändringar i kvoten Q kan i detta fall ha stor inverkan på DG och även ändra dess tecken. Reaktionen kan alltså lätt fås att gå i ena eller andra riktningen genom att den svarar direkt på små förändringar i koncentrationerna av reaktanter och produkter. (1p)
Exempel 1: DG 0 = -0.1 kj/mol Ë Keq = exp (100/RT) = exp (100/8.315 x 298) = 1.04 Om Q = 0.95 Ë DG = DG 0 + RTlnQ = -100 + 8.315 x 298 x ln 0.95 = -0.227 kj/mol Om Q = 1.05 Ë DG = DG 0 + RTlnQ = -100 + 8.315 x 298 x ln 1.05 = +0.021 kj/mol Exempel 2: DG 0 = -11.3 kj/mol Ë Keq = exp (11300/RT) = exp (11300/8.315 x 298) = 95.6 Om Q = 90 Ë DG = DG 0 + RTlnQ = -11300 + 8.315 x 298 x ln 90 = -0.150 kj/mol Om Q = 100 Ë DG = DG 0 + RTlnQ = -11300 + 8.315 x 298 x ln 100 = +0.111 kj/mol
Enzymreglering (1p för varje korrekt svar; max 3p): Reglering genom allosteri. När bindning av substrat och/eller annan effektor på ett bindingställe påverkar bindning på ett annat ställe. Allosteriska regulatorer kan vara inhibitorer eller aktivatorer. Detta är ett exempel på en reversibel modifikation. Ex. Den kooperativa bindningen i fosfofruktokinas och dess reglering medelst effektorer. Reglering genom reversibel kovalent modifiering. Den kovalenta bindingen av en liten grupp medelst en enzymkatalyserad reaktion. Ex. Fosforyleringen av en serinrest i glykogenfosforylas aktiverar enzymer medan hydrolysen av fosfatesterbindningen deaktiverar enzymet. Regulatoriska proteiner eller kontrollproteiner Bindningen av specifika stimulerande eller inhiberande proteiner. Ytterligare ett exempel på reversibel modifiering. Ex. Calmodulin som binder och aktiverar många enzymer när den innehåller bundna kalciumjoner. På det viset blir dessa enzymer aktiva när den intracellulära kalciumnivån ökar. Proteolytisk aktivering Den här typen av reglering är inte reversibel. Många enzymer blir aktiverade genom hydrolys av en eller några peptidbindingar i icke-aktiva prekursorer som kallas zymogener eller proenzymer. Till exempel aktiveringen av matsmältningsenzymer som trypsin.
5. Vilken egenskap hos aminosyran histidin gör att den ofta deltar i enzymatiska reaktioner? Hur skiljer sig aminosyran prolin från andra i proteiner förekommande aminosyror? Vilka konsekvenser har detta för sekundärstruktur? (3p). Rättningsmall fråga 5: pka-värdet för histidin ligger nära fysiologiskt ph (ca 7) vilket gör att den lätt kan uppta och avge protoner (delta i syra-baskatalys) (1p). Sidokedjan binder tillbaka till peptidkvävet i en ringstruktur (0.5p). Peptidkvävet saknar därför väte och kan alltså inte delta i vätebindningar (0.5p). Sekundärstruktur stabiliseras av vätebindingar mellan karbonylsyren och peptidkväven prolin kan alltså inte medverka till att stabilisera sekundärstruktur (1p).
6. En helix har följande aminosyrasekvens: -Gln-Gly-Ala-Met-Asn-Lys-Ala-Leu-Glu-His-Phe-Arg-Lys-Asp-Ile-Ala- Q G A M N K A L E H F R K D I A Rita ett helix-hjul av dessa, enligt modell nedan, och markera den sida som troligen sitter begravd i protein (2p). Rättningsmall fråga 6: A A D H K K F I A E M R L N Q G 0.5p för rätt riktning 0.5p för rätt placering 1p fär rätt markering av begravd sida
7. En Sydasiatisk frukt innehåller stora mängder av ett toxin som fullständigt inhiberar enzymet triosefosfatisomeras (TIM). Vilka är de troliga fysiologiska effekterna av att äta denna frukt? (6p) Rättningsmall fråga 7: TIM katalyserar omvandling av dihydroxyacetonfosfat till glyceraldehyd-3-fosfat i glykolysen. Om denna reaktion inhiberas kommer endast en mol pyruvat att bildas per mol glukos. Eftersom det i glykolysen går åt två ATP för att göra fruktos-1,6-bisfosfat (föregångaren till DAP och G3P) och produceras två ATP per mol glyceraldehyd-3-fosfat som omvandlas till pyruvat, blir det i detta fall ingen nettoproduktionen av ATP (2p). Eftertersom endast halva mängden pyruvat bildas per mol glukos kommer också nettoproduktionen av ATP i citronsyracykeln och genom oxidativ fosforylering att bli hälften jämfört med normalt. (2p) Överskottet av dihydroxyacetonfosfat kommer troligen att omvandlas till glycerol-3-fosfat vilket används i uppbyggnaden av t.ex. trigycerider och fosfolipider. Konsumption av den giftiga frukten skulle altså kunna tänkas ge upphov till fettma. (2p) I sammanfattning gör den här frukten människor feta och lata! 8. Ange om följande är sant eller falskt: a) Z-DNA är en högervriden dubbelhelix. b) Insulin inhiberar glykolysen medan glukagon stimulerar. c) Två varv genom citronsyracykeln behövs för att fullständigt omvandla en molekyl pyruvat till koldioxid. d) Samma metabolsikt irreversibla reaktioner förekommer i både glykolysen och glukoneogenesen. e) Det finns lika mycket puriner som pyrimidiner i dubbelsträngat DNA. f) Transport över biologiska membran sker i regel inte genom fri diffusion. (3p) Rättningsmall fråga 8: a) (Fel) b) (Fel) c) (Rätt) d) (Fel) e) (Rätt) f) (Rätt) (0.5p för varje korrekt svar)
9. Fyra orsaker brukar anges som förklaring till att enzymer har hög katalytisk effektivitet. Ge ett exempel på vart och ett av dessa i serinproteasernas katalys eller hos något annat enzym. (4p) Rättningsmall fråga 9: Kovalent katalys (0.5p). Exempel: binding av substratets peptidkedja till serinet i aktiva ytan hos serinproteaserna (0.5p). Syra-bas-katalys (0.5p). Exempel: Histidinet i aktiva ytan hos serinproteaserna (0.5p). Närhetseffekten (proximity effect) (0.5p). Exempel: Närheten av enzymets katalytiska grupper till reaktiva grupper hos substratet (0.5p). Övergångstillståndsstabilisering (transition state stabilisation) (0.5p). Exempel: Oxyanjonhålet hos serinproteaserna (0.5p). 10. Protongradienter används ofta i naturen för att driva energikrävande reaktioner. a) Ge två exempel där detta förekommer. b) Ange i båda fallen ovan varifrån den energi tas, som krävs för att skapa protongradienten. c) Beskriv mycket kortfattat principen för hur energi i form av ATP skapas med hjälp av en protongradient. (4p) Rättningsmall fråga 10: a) Protongradienter används i oxidativ fosforylering (andningkedjan) (0.5p) i mitokondrierna och i fotosyntesens ljusreaktion (0.5p). b) I oxidativ fosforylering tas energin från oxidering av NADH och QH 2 (1p). I fotosyntetisk fosforylering tas energin från solljuset (1p) (som driver ett elektron flöde från vatten till NADP och som resulterar i en protongradient). c) Då protoner av protongradienten drivs att flöda genom ett membranbundet ATPas genereras ATP från ADP (1p).
11. Vad är ett G-protein? Ge ett exmpel på en sekundär signalsubstans i signalprocesser. (1p) Rättningsmall fråga 11: Ett G-protein är ett protein som är aktivt när GTP är bundet och inaktivt då GDP är bundet (0.5p). camp, Ca 2+, Inositol-1,4,5-trifosfat (IP 3 ) (0.5p). 12. Vad menas med induced fit? Ge ett exempel på ett enzym som arbetar på detta sätt. Vilken fördel har denna mekanism? (2p) Rättningsmall fråga 12: Aktiva ytan färdigbildas (formas) genom konformationsförändringar orsakade av bindning av ett substrat (eller kosubstrat) (0.5p). Exempel: hexokinas, citratsyntas (0.5p). Fördelen är att oönskad hydrloys kan undvikas (1p). 13. Med utgångspunkt från din kännedom om vilka krafter som stabiliserar proteiners tertiärstruktur, vilken av följande behandlingar har störst sannolikhet att denaturera ett protein: behandling med trypsin eller med 8M urea (behandling med 8M urea leder till solvering av hydrofoba grupper i proteinets inre)? Varför? (2p) Rättningsmall fråga 13: Packning av hydrofoba grupper inuti proteinet ger en mängd stabiliserande van der Waals-interaktioner vilka är viktiga för att hålla ihop 3D-strukturen (1p). Klyvning av peptidkedjan (troligen på ytan av proteinet) rubbar inte dessa interaktioner. Därför bör behandling med 8M urea ha störst sannolikhet att denaturera proteinet (1p). 14. Rita schematiskt en vätebinding och ange vilket slags längd en vätebinding har (du kan ange ett intervall eller ett riktvärde). Vilka grupper i ett protein kan delta i vätebindingar? Vätebindningar är viktiga i biologiska system bland annat därför att de möjliggör bildandet av sekundärstruktur hos proteiner. Beskriv de två huvudtyperna av sekundärstruktur hos proteiner och ge exempel på proteiner som domineras av respektive sekundärstrukturtyp (4p). Rättningsmall fråga 14: -N-H...O- eller liknande (0.5p), 2.8-3.1 Å (0.5p). Huvudkedjans peptidkväve och karbonylsyre (0.5p), polära sidokedjor (0.5p). alfa-helix (0.5p), globiner (0.5p). beta-flak (0.5p), immunoglubliner (0.5p).
15. Vad skulle hända med enzymfunktionen om His 57 i serinproteaset chymotrypsin muterades till Asn (Asparagin, R=-CH 2 CNH 2 O)? Skulle K M för substrat öka, minska, eller inte påverkas? Varför? Skulle enzymet fortfarande kunna katalysera klyvning av en peptidkedja? Varför/varför inte? Skulle i så fall aktiviteten öka, minska, eller inte påverkas alls? Motivera svaret! Du kan anta att asparaginen kan ersätta histidinen utan att ge veckningsproblem, och att asparaginens sidokedja kan vätebinda till Asp 102 och Ser 195 på motsvarande sätt som histidinen. (3p) Rättningsmall fråga 15: Mutationen skulle troligen inte påverka substratbindning eftersom histidinen inte är direkt inblandad i substratbinding, så K M skulle inte påverkas (1p). Viss aktivitet skulle finnas kvar p.g.a. av övergångsformstabilisering (1p). Den katalytiska aktiviteten skulle minska (troligtvis med flera tiopotenser) eftersom Asn 57 inte skulle kunna delta i syra-bas katalys (1p). 16. Du har identifierat två närbesläktade proteiner som är involverade i syntes av doftsignaler hos människa. Din upptäckt leder till intensiv forskning på området, och ett år senare har man upptäckt över hundra besläktade proteiner i allt från bakterier till växter och djur. Dessa bildar alltså en familj av proteiner som alla kan antas ha uppkommit ur ett gemensamt ursrungsprotein. Ange ett ungefärligt minsta värde på sekvensidentitet för att ett protein skall få räknas till familjen. Efter ytterligare något år har två av de avlägsnaste släktingarna i familjen strukturbestämts med röntgenkristallografi. Liknar dessa proteiner varandra? Om så är fallet, ungefär hur stor andel av aminosyraresterna kommer att inta liknande positioner i de två proteinerna? Var i strukturen finner man företrädesvis de aminosyrarester som inte intar liknande positioner? (3p) Rättningsmall fråga 16: Identitet ca 25% (1p). Proteinerna liknar varandra och har ca 50% av aminosyraresterna i liknande positioner (1p). De aminosyrarester som inte intar liknande positioner i de två proteinerna återfinns företrädesvis i loopar på ytan av proteinerna (1p).
17. Många kalciumbindande proteiner använder ett liknande motiv, en s.k. kalciumbindande EF-hand, för att binda kalciumjoner. Motivet består av två helixar förbundna med en loop. Nedan visas sekvensen i EF-handen från tre olika kalciumbindande proteiner. Identifiera de konserverade aminosyrorna och ange deras troliga funktion (varför är de konserverade?) (motivera svaret). (3p) Parvalbumin Calmodulin Troponin-C V K K A E A I I D Q D K S G F I E E D E L K L F L Q N E F K E A F S L F D K D G D G T I T T K E L G T V M R S L L A D C F R I F D K N A D G F I D I E E L G E I L R A T <-- helix E --><---- loop ----><-- helix F --> Rättningsmall fråga 17: Parvalbumin Calmodulin Troponin-C V K K A E A I I D Q D K S G F I E E D E L K L F L Q N E F K E A F S L F D K D G D G T I T T K E L G T V M R S L L A D C F R I F D K N A D G F I D I E E L G E I L R A T * * * * * * Konserverade: markerade med * ovan (1p). F, G, I, L är konserverade av strukturella skäl (1p). F, I, L p.g.a. packning, G behövs i loopen för att den skall böjas rätt så att kalciumliganderna hamnar på rätt plats. D, E (negativt laddade) funktionella skäl - binder kalciumjonen (1p) 18. Oxaloacetat bildas i det sista steget i citronsyracykeln genom en NAD + -beroende oxidation av malat. Kan en nettosyntes av oxaloacetat ske från acetyl-coa genom att använda enbart enzymer och kofaktorer i ctronsyracykeln utan att cykelns intermediärer förbrukas? Förklara. Hur återfås oxaloacetat som försvunnit från citronsyracykeln? (2p) Rättningsmall fråga 18: Nej. För varje 2-kolskropp som går in i citronsyracykeln som acetyl-coa, kommer två kol att lämna citronsyracykeln som CO 2. Därför kan det inte ske någon nettosyntes av oxaloacetat (1p). En nettosyntes av oxaloacetat sker genom karboxylering av pyruvat till oxaloacetat (1p). (2p) 19. Vid svält, eller under ett hårt träningspass, ökar produktionen av ketonkroppar (acetoacetat och D-3-hydroxybutyrat) i levern. Förklara varför! (2p) Rättningsmall fråga 19: Vid svält (eller hård träning) finns begränsad tillgång till glukos (glykogenlagret förbrukat) och kroppen övergår då till fettsyror som energikälla (0.5p). Koncentrationen av oxaloacetat sjunker eftersom det används till att bilda glukos via glukoneogenesen (hjärnan måste ha glukos) (0.5p). Sålunda finns inte tillräckligt med oxaloacetat för kondensation med acetyl-coa (0.5p) som bildats i ß-oxidationen, varför acetyl-coa omvandlas till acetoacetat och D-3- hydroxybutyrat (0.5p).
20. Glukos oxideras vanligtvis via glykolysen men även via den så kallade pentosfosfat shunten. Vilka är de två viktigaste produkterna som bildas i pentos-fosfat shunten och vad används de huvudsakligen till? (2p) Rättningsmall fråga 20: NADPH (0.5p) och Ribos-5-fosfat (0.5p). NADPH behövs vid fettsyntes (0.5p) och ribos-5-fosfat är byggsten i nukleotidsyntesen (0.5p).