B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack

B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack 3300759JAA(04) 2015-07 Svenska AVSEDD ANVÄNDNING BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack (Mycobacterium tuberculosis komplexets (DTB) direkta detektionsreagens), för användning med BD ProbeTec ET system, utnyttjar nukleinsyraamplifierings- (Strand Displacement Amplification, SDA) teknik för den direkta kvalitativa detektionen av Mycobacterium tuberculosis DNA-komplex från dekontaminerade, enzymbehandlade kliniska prov från luftvägarna som t.ex. sputa, inducerade sputa, bronkialsköljningar och andra luftvägsprover. BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis komplexets (DTB) direkta detektionsmetod ska användas som en direkt test för utvärdering av prov från obehandlade patienter som misstänks ha tuberkulos. Obehandlade patienter är de som har: (1) ej fått antituberkulös behandling; (2) ej fått sådan behandling de senaste 12 månaderna; eller (3) har fått mindre än 7 dagars behandling. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING Ungefär en tredjedel av världens befolkning är infekterade med Mycobacterium tuberculosis och löper 10 % risk för utveckling av sjukdomen under sin livstid. 1,2 Det uppskattas att tuberkulos dödar 3 miljoner människor per år i världen, vilket gör att denna är den främsta infektionssjukdomen som orsakar död. 1,3 Den långsamma växten av M. tuberculosis -organismen försenar klinisk diagnos och behandling, vilket bidrar till spridningen av sjukdomen. Centers for Disease Control and Prevention i USA (motsvarand Smittskyddsinstitutet i Sverige) rekommenderar att varje ansträngning ska göras för att laboratorierna ska använda de snabbaste tillgängliga metoderna vid diagnostisk mykobakteriell analysering. 3 Användningen av DNA-amplifieringstekniker, som t.ex. SDA, tillåter snabb detektion och identifiering av M. tuberculosis DNA-komplex i kliniska prover, och främjar därför snabbare medicinsk intervention. Mycobacterium tuberculosis komplexets (DTB) reagensförpackning används med BD ProbeTec ET system. Analyssystemet utnyttjar homogen SDA-teknologi som amplifieringsmetod och fluorescerande energiöverföring (ET) som detektionsmetod för Mycobacterium tuberculosis-komplexet direkt från dekontaminerade, enzymbehandlade luftvägsprover (NALC-NaOH-sediment). Mycobacterium tuberculosis komplexet består av M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, och M. microti. 4,5 PRINCIPER FÖR METODEN BDProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis komplexets (DTB) analys bygger på simultan amplifiering och detektion av det sökta DNA, med hjälp av primers för amplifiering och en fluorescensmärkt detektorprob. 6-8 SDA-reagenserna torkas i två separata mikrobrunnar för engångsbruk. Det preparerade NALC-NaOH sedimentet tillsätts till primningsmikrobrunnen, vilken innehåller primers för amplifiering, fluorescensmärkta detektorprober samt övriga reagenser. Efter inkubering överförs reaktionsblandningen till amplifieringsmikrobrunnen, vilken innehåller två enzymer (ett DNA-polymeras och ett restriktionsendonukleas) som krävs för SDA. Amplifieringsmikrobrunnarna förseglas för att förhindra kontaminering och inkuberas i en temperaturreglerad fluorescensavläsare som övervakar reaktionen för generering av amplifieringsprodukter. Varje reaktion coamplifieras och detekterar en intern amplifieringskontroll (IAC). Avsikten med denna kontroll är att bekräfta validiteten i amplifieringsreaktionen och identifiera potentiell inhibition från det preparerade provet. Resultaten rapporteras såsom positiva, negativa eller ej bestämbara via en algoritm. REAGENSER OCH MATERIAL Varje BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack (Mycobacterium tuberculosis komplexets (DTB) direkta detektionsreagens) innehåller: DTB primningsmikrobrunnar, 3 x 32: 4 oligonukleotider 7,6 pmol; dntp 37,6 nmol; detektorprober 30 pmol; syntetisk oligonukleotid 10 500 kopior DTB amplifieringsmikrobrunnar, 3 x 32: Restriktionsenzym 25,5 enheter; DNA-polymeras 8 units; dntps 10 nmol Tillbehör: 10 skydd, 8 avfallspåsar, 16 förseglingar Varje BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit (Mycobacterium tuberculosis komplexets (DTB) direkta detektionssats för provberedning) innehåller: DTB tvättbuffert 1 225 ml lösning innehållande urea; CAPS-buffert; dimetylsulfoxid; glycerol och natriumhydroxid; DTB lyseringsbuffert 2 50 ml lösning av kaliumhydroxid; DTB neutraliseringsbuffert 3 150 ml lösning innehållande bicin, kaliumhydroxid, dimetylsulfoxid, glycerol och 0,03 % Proclin (konserveringsmedel). Varje BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Control Set (Mycobacterium tuberculosis komplexets (DTB) direkta detektionskontrollset) innehåller: DTB positiv kontroll torkade laxtestes DNA 5 µg och 750 kopior syntetisk oligonukleotid per reaktion 5250 totala kopior. DTB negativ kontroll torkade laxtestes DNA 5 µg. Instrument, utrustning och material: BD ProbeTec ET-instrument och instrumentplatta, BD ProbeTec ET primnings- och förvärmare, BD ProbeTec ET Oven (BD ProbeTec ET-ugn) eller laboratorieugn för allmänt bruk som kan värma provet 1

till 101 C ± 1 C under minst 30 minuter och högst 35 min, BD ProbeTec ET-sonikeringsbad och sonikeringsbadsinsats, BD ProbeTec ET-pipetteringsinstrument och eltillförsel, 2 ml provrörsställ, genomskinligt pipetteringsställ, 2 ml provrör och lock, 2 ml lock och BD ProbeTec ET tillbehörssats, CultureSwab EZ-pinnar. Materials som krävs men ej medföljer: Mikrocentrifug med inneslutande aerosol och standardrotorer kapabla av 12 200 x g (som t.ex. Eppendorfs mikrocentrifug model 5417C), vortexmixer, engånghandskar, pipetter med aerosolresistenta spetsar kapabla att leverera volymerna 100 µl, 500 µl, 600 µl och 1 ml, 1 % (v/v) natriumhypoklorit med Alconox*, sterila behållare kapabla av att hålla alikvoter av de 3 DTB-buffertarna, timer, tuberkulocidal desinficering, absorberande vadd/gasväv, kalibrerad termometer. *Tillsätt 7,5 g Alconox per 1 L 1% (vol/vol) natriumhypoklorit och blanda. Gör i ordning en färsk blandning dagligen. Förvaring och hantering: DTB reagensförpackningar måste förvaras vid 2 33 C. Oöppnade reagensförpackningar får ej användas efter utgångsdatum. Efter att påsen öppnats är mikrobrunnarna hållbara i 4 veckor, förutsatt att påsen är ordentligt försluten, eller fram till utgångsdatum, beroende på vilket som inträffar först. Får ej frysas. DTB beredningsreagens måste förvaras vid 2 33 C. Reagenserna får ej användas efter utgångsdatum. Får ej frysas. DTB kontroller måste förvaras vid 2 33 C. Använd ej kontroller efter utgångsdatumet. Får ej frysas. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSBEAKTANDEN Avsedda för in vitro-diagnostik. 1. Denna tests prestanda för detektion av M. tuberculosis-komplexet från icke-luftvägsprover, inkluderande men ej begränsat till blod, CSF, avföring eller urin, har inte påvisats. BD ProbeTec ET DTB.analysens prestanda har inte utvärderats med prover beredda med andra metoder än de som beskrivits i detta förpackningsinlägg. 2. Steg för hantering och preparering av prover genom värmeinaktivering skall ske i ett biologiskt säkerhetsskåp (Biological Safety Cabinet, BSC) klass II. Centrifugering av prov fore värmeinaktiveringssteget skall endast utföras med användning av aerosolinnehållande rotorn. Den aerosolinneslutande rotorn bör endast öppnas i det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). Använd endast standardrotorn vid centrifugering av prov efter värmeinaktivering utanför det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). 3. Odla alla preparerade prover för att fastställa om andra mykobakterier än tuberkulos (MOTT) finns närvarande, utför antimykobakteriell resistensbestämning, fastställ subspecies av M. tuberculosis-komplex och/eller bedöm viabilitet. 4. Patogena mikroorganismer inklusive hepatit B-virus och humant immunbristvirus (HIV) kan finnas i proverna. Därför bör dessa reagenser hanteras som smittsamma och laboratoriets etablerade rutiner 9,10,11 och/eller institutionens riktlinjer bör följas. 5. Byt inte ut och blanda inte mikrobrunnar, kontroller eller prepareringsbuffertar från satser med olika partinummer. 6. Lakttag vedertagna laboratorieförfaranden vid bortskaffning av använda pipettspetsar, provrör, primningsskydd samt annat engångsmaterial. 7. Använd endast BD ProbeTec ET pipetteringsinstrument och BD ProbeTec ET pipettspetsar för överföring av preparerade prover till primningsmikrobrunnarna och för överföring av prover från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna. 8. Reagenspåsarna med oanvända primningsmikrobrunnar och amplifieringsmikrobrunnar MÅSTE återförslutas noggrant efter att de öppnats. Kontrollera att desickanten finns med innan reagenspåsarna försluts. 9. Plattan med amplifieringsmikrobrunnar MÅSTE förseglas ordentligt med hjälp av amplifieringsförseglingen innan plattan flyttas från BD ProbeTec ET primnings- och förvärmare till BD ProbeTec ET-instrumentet. Försegling är nödvändig för att förhindra kontamination av instrumentet och arbetsområdet med amplifieringsprodukterna. Förseglingsmaterialet får ej avlägsnas från mikrobrunnarna vid något tillfälle. 10. I händelse av att en testplatta överskrider 6 kolumner (> 48 prov och kontroller), måste en HEL karta av amplifieringsförsegling användas för att förhindra kontamination. 11. För att förhindra kontaminering av arbetsmiljön med amplifieringsprodukter, använd de tillhandahållna påsarna för avyttring av de förseglade amplifieringsmikrobrunnarna efter avslutad analysering. 12. BYT HANDSKAR vid specificerade steg under preparering och analys av prover, så att kontaminering av proverna undviks. Om handskarna kommer i kontakt med prover skall de omedelbart bytas så att kontaminering av andra prover undviks. 13. I händelse av att arbetsområdet eller utrustningen kontamineras av preparerat prov skall det kontaminerade området omsorgsfullt rengöras med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox och sköljas noga med avjoniserat/destillerat vatten. Låt ytorna torka fullständigt innan du fortsätter med arbetet. 14. Rengör dagligen hela arbetsområdet arbetsbänkar och instrumentytor med 1 % natriumhypoklorit med Alconox. Skölj noga med avjoniserat/destillerat vatten. Låt ytorna torka fullständigt innan du fortsätter med testningen. 15. Primning av mikrobrunnarna med restvätska (efter överföring av vätska från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna) utgör en källa till kontaminering av provet. Försegla primningsmikrobrunnarna noga med en plattförseglare innan de bortskaffas. 16. Placera inte fingrar eller händer i sonikeringsbadet när ultraljudet är PÅ. Detta kan orsaka obehag och möjlig hudirritation. Skada på mujkvävnad kan också uppträda på lång sikt. 17. Använd ej en kvicksilvertermometer för att kontrollera sonikeringsbadets temperatur. En digital termometer tillhandahålls för detta syfte. 18. Kontakta Teknisk service om det händer något ovanligt, såsom spill i BD ProbeTec ET-instrumentet eller DNA-kontamination som inte kan åtgärdas med hjälp av rengöring. 19. Om du använder en laboratorieugn för allmänt bruk ska du följa användarhandboken för ugnen för lämpliga anvisningar om drift och säkerhetsåtgärder. 20. Tillämpa fastställd laboratoriepraxis för hantering av prov under och/eller efter värmeinaktivering. 2

Kat. nr. Beskrivning 240862 BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, tio 75 ml flaskor med NALC-NaOH-lösning och 5 förpackningar med fosfatbuffert. 240863 BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, tio 150 ml flaskor med NALC-NaOH-lösning och 10 förpackningar med fosfatbuffert. Fara H314 Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. P260 Inandas inte damm/rök/gaser/dimma/ångor/sprej. P280 Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. P264 Tvätta grundligt efter användning. P303+P361+P353 VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/duscha. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren ska kasseras i enlighet med lokala/ regionala/nationella/internationella bestämmelser. Kat. nr. Beskrivning 440643 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit. Varning H315 Irriterar huden. H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H335 Kan orsaka irritation i luftvägarna. P280 Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. P264 Tvätta grundligt efter användning. P312 Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. P405 Förvaras inlåst. P403+P233 Förvaras på väl ventilerad plats. Förpackningen ska förvaras väl tillsluten. P501 Innehållet/behållaren ska kasseras i enlighet med lokala/regionala/nationella/ internationella bestämmelser. Fara H302 Skadligt vid förtäring. H314 Orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon. P260 Inandas inte damm/rök/gaser/dimma/ångor/sprej. P280 Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. P264 Tvätta grundligt efter användning. P303+P361+P353 VID HUDKONTAKT (även håret): Ta omedelbart av alla nedstänkta kläder. Skölj huden med vatten/duscha. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren ska kasseras i enlighet med lokala/ regionala/nationella/internationella bestämmelser. Varning H302 Skadligt vid förtäring. P264 Tvätta grundligt efter användning. P301+P312 VID FÖRTÄRING: Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN eller läkare. P501 Innehållet/behållaren ska kasseras i enlighet med lokala/regionala/nationella/internationella bestämmelser. PROVTAGNING OCH -HANTERING Alla prover skall tas och transporteras enligt rekommendationer från CDC, Clinical Microbiology Procedures Handbook, eller enligt föreskrifter i laboratoriets metodbok. 1,8 Enzymbehandling, dekontaminering och koncentration Provet skall behandlas med NALC-NaOH-metoden enligt rekommendationer från CDC:s Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. 1 Alternativt kan BBL MycoPrep-satsen användas för behandling av mykobakterieprover (se Tillgänglighet ). OBS! Om BD ProbeTec ET-analysen ej utförs på en gång, kan NALC/NaOH-sedimenten förvaras enligt nedan: (a) Vid 2 8 C i upp till 5 dagar. (b) Mer än 5 dagar, förvara fryst vid -20 C eller kallare (ej-cykliskt) i upp till tre månader. Frysta sediment måste tinas vid rumstemperatur innan beredning för BD ProbeTec ET DTB-analyseringen. 3

PROVBEREDNINGSPROCEDUR A. BD ProbeTec ET DTB-analysens provberedning utanför biologiskt säkerhetsskåp 1. Provberedningens buffertar måste vara vid rumstemperatur och välblandade före användning. För att undvika kontamination av buffertlager, alikvotera tillräckliga volymer av buffertar till lämpliga sterila behållare enligt följande: a. DTB tvättbuffert 1 1 ml per NALC/NaOH-sediment som ska beredas samt 1 2 ml extra för bekvämlighet. b. DTB lyseringsbuffert 2 0,1 ml per NALC/NaOH-sediment och kontroller som ska beredas samt 0,5 1 ml extra för bekvämlighet. c. DTB neutraliseringsbuffert 3 0,6 ml per NALC/NaOH-sediment och kontroller som ska beredas samt 0,5 1 ml extra för bekvämlighet. d. Undvik kontaminering av buffertar - häll ej tillbaka överbliven buffert i flaskorna. 2. Använd provrörens tillhandahållna etiketter och märk ett 2 ml provrör för varje NALC-NaOH-sediment som ska analyseras. 3. Avlägsna locken från provrören och dispensera 1,0 ml DTB tvättbuffert 1 till varje rör. Sätt på provrörslocken igen. 4. Flytta provrören till det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). B. Beredning av NALC-NaOH-sedimentprov för analysering med BD ProbeTec ET DTB inuti biologiskt säkerhetsskåp (BSC) OBS! Som en förberedelse för provdekantering, iordningställ en behållare för flytande biologiskt riskavfall. 1. Vortexblanda det första NALC-NaOH-sedimentet i 5 sek. 2. Med användning av ett pipetteringsinstrument med en ny aerosolresistent spets, överför 500 µl av NALC-NaOHsedimentet till det lämpligt märkta provröret med 1 ml DTB tvättbuffert 1. 3. Sätt på locket ordentligt på röret. 4. Upprepa stegen 1 3 får varje NALC-NaOH-sediment. 5. BYT HANDSKAR. 6. Vortexblanda varje provrör i 5 sek. 7. Sätt varje rör i den aerosolinneslutande rotorn och sätt fast det aerosolinneslutande locket ordentligt. Torka av rotorns utsida men handdukar eller gasväv fuktad med en anitmikrobiell lösning. 8. Överför den aerosolinneslutande rotorn till mikrocentrifugen. Centrifugera rören vid 12 200 X g i 3 min. OBS! De specificerade centrifugeringsförhållandena måste följas eftersom otillräcklig centrifugering kan orsaka falskt negativa resultat. 9. Omedelbart efter centrifugering, avlägsna rotorn försiktigt från mikrocentrifugen (utan att ha sönder aerosolens täta försegling) och sätt tillbaka rotorn i det biologiska säkerhetsskåpet. 10. Avlägsna det aerosolinneslutande locket och proverna omedelbart från rotorn med iakttagande av försiktighet för att minimera återblandning av supernatanten och sedimentet. 11. Tag av locket från det första röret och dekantera supernatanten i behållaren för flytande avfall i det biologiska säkerhetsskåpet. Använd en jämn inverterande rörelse och avsluta med en nedåtgående snärt av det inverterade röret. OBS! Sedimentet kan lossna med tiden. Utför stegen 9, 10 och 11 utan fördröjning. 12. Sätt tillbaka locket ordentligt och placera röret i 2 ml-provrörsstället. 13. Upprepa stegen 11 och 12 för alla prover. 14. BYT HANDSKAR. C.1. Provuppvärmning BD ProbeTec ET-ugn. Anmärkningar: Se till att provrörslocken är ordentligt fastsatta. Före uppvärmning av proven i ugnen, inspektera provrörslocken för att bekräfta att O-ringarna sitter riktigt. Om O-ringarna är sneda eller saknas, ersätt dem med ett nytt lock. Se BD ProbeTec ET-systemets användarhandbok för fullständiga användarinstruktioner, inklusive relevanta försiktighetsåtgärder och varningar. 1. Sätt 2 ml-provrörsstället i ugnen och stäng dörren. 2. Välj run (KÖR) #01. Tryck på OK. 3. Tryck på START för att börja körningen. 4. När uppvärmningscykeln startar, utför följande steg: a. Förbered BD ProbeTec ET sonikeringsbad. Detta inkluderar: (1) att placera sonikeringsbadets insats i badet. (2) att fylla sonikeringsbadet till linjen Maximum med hett kranvatten. (OBS! Avjoniserat vatten bör ej användas). (3) att ställa in temperaturen på 65 C och sätt på uppvärmaren. (4) att köra ultraljudet i 60 sek. (förvalsinställning) med sonikeringsbadets skydd på. b. Sätt fast standardrotorn i mikrocentrifugen. 5. Efter 15 min. in I uppvärmningscykeln, kontrollera och registrera ugnens yttre termometer för att säkerställa att temperaturen är 95 C. j 6. I slutet av ugnens uppvärmningscykel, kommer en signal att höras och LCDn kommer att visa att körningen är DONE (KLAR). Lossa på dörrlåset genom att trycka på OPEN DOOR (ÖPPNA DÖRR) och avlägsna 2 ml-provrörsstället. Obs! Eventuella mykobakterier närvarande i provrören är nu icke-viabla och efterföljande manipulationer kan ske utanför det biologiska säkerhetsskåpet. Proverna måste ännu behandlas som potentiellt smittförande. 4

C.2. Provuppvärmning - laboratorieugn för allmänt bruk OBS! Se till att provrörslocken är ordentligt fastsatta. Innan uppvärmning av prover i ugnen ska du visuellt inspektera provrörslocken för att bekräfta att O-ringarna sitter riktigt. Om O-ringen är sned eller saknas, ersätt den med ett nytt lock. Se användarhandboken för ugnen för fullständiga användarinstruktioner, inklusive relevanta försiktighetsåtgärder och varningar. 1. Sätt 2 ml-provrörsstället i ugnen och stäng luckan. 2. Provtemperaturen måste uppnå 101 C ± 1 C under minst 30 min och högst 35 min. Följ lämpliga tids- och temperaturanvisningar för inkubation. 3. Utför följande steg medan proverna värms upp i ugnen: a. Förbered BD ProbeTec ET-ultraljudsbad. Detta inkluderar: (1) Placera ultraljudsbadets insats i badet. (2) Fyll på ultraljudsbadet med hett kranvatten till linjen Maximum. (OBS! Avjoniserat vatten ska inte användas.) (3) Ställ in temperaturen på 65 C och sätt på uppvärmaren. (4) Kör ultraljudet i 60 min (förvalsinställning) med ultraljudsbadets skydd på. b. Sätt fast standardrotorn i mikrocentrifugen. 4. Ta bort 2 ml-provrörsstället i slutet av ugnens uppvärmningscykel. VARNING! Hantera inte heta provrörsställ utan lämplig personlig skyddsutrustning. Om du gör det kan du få brännskador. OBS! Eventuella mykobakterier som finns i provrören är nu icke-viabla och efterföljande manipulationer kan ske utanför det biologiska säkerhetsskåpet (BSC). Proverna måste ännu behandlas som potentiellt smittförande. D. Provlysering BD ProbeTec ET-sonikeringsbad VARNING! Placera inte fingrar eller händer i sonikeringsbadet när ultraljudet är PÅ. Detta kan orsaka obehag och möjlig hudirritation. Skada på mujkvävnad kan också uppträda på lång sikt. VARNING! Använd ej en kvicksilvertermometer för att kontrollera sonikeringsbadets temperatur. En digital termometer tillhandahålls för detta syfte. OBS! Se BD ProbeTec ET-systemets användarhandbok för fullständiga användarinstruktioner, inklusive relevanta försiktighetsåtgärder och varningar. 1. Sätt provrören i mikrocentrifugen med standardrotorn. 2. Stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. 3. Avlägsna rören från centrifugen och undersök om det finns kondensation i rörlocken. Om kondensation finns, upprepa centrifugeringen. 4. Sätt tillbaka rören i 2 ml provstället. 5. Tag av locket från det första röret. Med användning av ett pipetteringsinstrument med en aerosolresistent pipettspets, dispensera 100 µl DTB lyseringsbuffert 2 till röret. Ersätt och sätt på locket ordentligt på provröret. 6. Upprepa för alla proverna med användning av en ny spets för varje prov. 7. BYT HANDSKAR. 8. Vortexblanda varje prov i 5 sek. När rören sätts tillbaka i 2 ml-provrörsstället, kontrollera att dessa är ordentligt lockförsedda och tryck fast röret så att dess kant sitter i den utstansade skåran på stället. Detta orienterar rören riktigt för maximal exponering för ultraljudsenergin. 9. Stäng AV ultraljudet och bekräfta att vattennivån ligger mellan linjerna Minimum och Maximum på sonikeringsbadets insats. Avlägsna eller sätt till varmt kranvatten vid behov. Kontrollera sonikeringsbadets temperatur med den digitala termometern för att säkerställa att temperaturen är 65 ± 5 C. Avlägsna termometern från badet. 10. Överför 2 ml-provrörsstället till sonikeringsbadets insats. Ersätt sonikeringsbadets skydd. 11. Ställ sonikeringsbadets timer på 45 min., sätt PÅ ultraljudet. 12. I slutet av sonikeringen, stäng AV sonikeringsbadet och tag bort 2 ml-provrörsstället. Placera stället på absorberande pappershanddukar för att torka. E. Provneutralisering 1. Sätt provrören i mikrocentrifugen med standardrotorn. 2. Stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. 3. Avlägsna rören från centrifugen och undersök om det finns kondensation i rörlocken. Om kondensation finns, upprepa centrifugeringen. 4. Sätt rören i det genomskinnliga pipetteringsstället. 5. Tag av locket från det första röret. Med användning av ett pipetteringsinstrument med en aerosolresistent pipettspets, dispensera 600 µl DTB neutraliseringsbuffert 3 till röret. Ersätt och sätt på locket ordentligt på provröret. 6. Upprepa för alla prover med användning av en ny spets för varje rör. 7. BYT HANDSKAR. 8. Vortexblanda varje rör i 5 sek. 9. Pulscentrifugera rören genom att följa stegen 1 3 ovan. 10. Sätttillbaka rören i det genomskinnliga pipetteringsstället. 5

11. De preparerade proverna är nu klara för analysering på BD ProbeTec ET-systemet. OBS! Om analysering inte sker på en gång, kan de preparerade proverna förvaras enligt följande: a) Vid 18 33 C i upp till 12 h b) Vid 2 8 C i upp till 4 dagar. Proverna måste återuppvärmas i BD ProbeTec ET-ugnen eller laboratorieugnen för allmänt bruk som kan värma provet till 101 C ± 1 C under minst 30 min och högst 35 min, innan analysering. c) Frysta vid -20 C eller kallare (ej-cykliskt) i upp till 3 månader. Frysta prover måste tinas vid rumstemperatur och återuppvärmas i BD ProbeTec ET-ugnen eller laboratorieugnen för allmänt bruk som kan värma provet till 101 C ± 1 C under minst 30 min och högst 35 min, innan analysering. d) Efter att rören har återuppvärmts (i stegen b och c ovan) sätt rören i mikrocentrifugen med standardrotorn. Stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. Avlägsna rören från centrifugen och undersök om det finns kondensation i rörlocken. Om kondensation finns, upprepa centrifugeringen. Sätt rören i det genomskinnliga pipetteringsstället. Proverna är nu klara för analysering på BD ProbeTec ET-systemet. TESTFÖRFARANDE A. Förberedelse av instrumentet 1. Sätt på instrumentet och tillåt uppvärmning före start av analysen. a. Uppvärmning och stabilisering av primnings- och förvärmaren tar cirka 90 min. Inställd temperatur för primningsdelen i primnings- och förvärmaren är 72,5 C. Inställd temperatur för förvärmningsdelen i primnings- och förvärmaren är 54 C. b. BD ProbeTec ET-instrumentet styrs av programvaran och tar cirka 30 min. att värma upp. 2. Temperaturer för primnings- och förvärmaren måste kontrolleras innan analysen påbörjas. Termometern för värmarens primningsdel skall visa ett värde inom 72 73 C. Termometern för värmarens förvärmardel skall visa ett värde inom 53,5 54,5 C. 3. Kontrollera temperaturen som visas på BD ProbeTec ET-skärmen. Termometern skall visa ett värde mellan 47,5 55,0 C. B. BD ProbeTec ET pipetteringsinstrument Se BD ProbeTec ET-systemets användarhandbok för utförliga informationer om funktionerna hos knappsatsen till BD ProbeTec ET pipetteringsinstrument. Följande program krävs för att utföra DTB-analysen: Program 1 ombesörjer överföring av vätska från de preparerade proverna till primningsmikrobrunnarna. Program 5 ombesörjer överföring av vätska från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna. Utför nedanstående steg för att programmera pipetteringsinstrumentet: Program 1: 1. Slå PÅ pipetteringsinstrumentet. Pipetteringsinstrumentet avger ett pip, ZERO och därefter programversion visas snabbt, varefter ytterligare ett pip avges. 2. Tryck på den blå Prog (program)-knappen. Tryck på knappen Vol (volym) tills 1 visas, för att välja Program 1. Tryck på Enter. 3. Håll knappen Prog intryckt tills i programmeringsfunktionen öppnas. Fortsätt att hålla knappen Prog intryckt och tryck samtidigt på knappen för specialfunktioner med hjälp av en pipettspets eller änden på ett gem. 4. Tryck på knappen Fill (fyll). Tryck på upp-pilen tills 200 visas. Tryck på Enter. 5. Tryck på knappen Disp (dispensera). Tryck på upp-pilen tills 150 visas. Tryck på Enter. 6. Press Purge. Tryck på Enter. 7. Tryck på Enter en gång till för att spara programmet och lämna denna funktion. Ett pip bör nu höras som bekräftelse på att programmeringen är klar. 8. Kontrollera din programmering genom att trycka på utlösaren så att du stegar framåt ett steg i taget. Ställ in aspirerings-/ dispenseringshastigheten med hjälp av knappen Vol efterhand som du stegar dig fram. För varje steg visas hastighetsindikatorn (Speed). Använd Vol -knappen för att ställa in hastighetsindikatorn så att den visar 2 fyrkanter för stegen Fill och Disp och 3 fyrkanter för Purge. Program 5 1. Tryck på Prog (program)-knappen. Tryck på knappen Vol (volym) tills 5 visas, för att välja Program 5. Tryck på Enter. 2. Håll knappen Prog intryckt tills i programmeringsfunktionen öppnas. Fortsätt att hålla knappen Prog intryckt och tryck samtidigt på knappen för specialfunktioner med hjälp av en pipettspets eller änden på ett gem. 3. Tryck på knappen Fill (fyll). Tryck på upp-pilen tills 100 visas. Tryck på Enter. 4. Tryck på Disp. Tryck på upp-pilen tills 100 visas. Tryck på Enter. 5. Tryck på Mix. Tryck på upp-pilen tills 50 visas. Tryck på Enter. 6. Tryck på Enter en gång till för att spara programmet och lämna denna funktion. Ett pip bör nu höras som bekräftelse på att programmeringen är klar. 7. Kontrollera din programmering genom att trycka på utlösaren så att du stegar framåt ett steg i taget. Ställ in aspirerings-/ dispenseringshastigheten med hjälp av knappen Vol efterhand som du stegar dig fram. För varje steg visas hastighetsindikatorn (Speed). Använd Vol -knappen för att ställa in hastighetsindikatorn så att den visar 2 fyrkanter för funktionerna aspirering och dispensering. Använd Vol -knappen för att ställa in hastigheten för blandningen så att den visar 3 fyrkanter. 6

Granskning av program Programmen bör granskas innan testförfarandet påbörjas. För att granska programmen skall pipetteringsinstrumentet först slås PÅ. Tryck på den blå Prog (program)-knappen. Tryck på knappen Vol (volym) tills det programnummer som ska granskas visas. Tryck på Enter -knappen. Använd pipetteringsutlösaren för att stega dig fram ett steg i taget genom programmet. Program 1: Detta program aspirerar 200 µl och dispenserar 150 µl. Pipetteringsinstrumentets display bör visa följande: Fyll 200 µl S II Dispensera 150 µl S II Purge S III Program 5 granskas på samma sätt: Program 5: I detta program aspireras 100 µl, 100 µl dispenseras och 50 µl blandas tre gånger. Pipetteringsinstrumentets display bör visa följande: Fyll 100 µl S II Dispensera 100 µl S II Mix 50 µl S III Zero (blinkar) C. Plattlayout Plattlayoutrapporten (Plate Layout Report) genereras av BD ProbeTec ET-instrumentet efter att analystyp(er), provdata, kontrollpartinummer och satspartinummer loggats in i systemet. Plattlayoutrapporten visar hur proverna och kontrollerna är placerade på varje platta som skall testas. Denna orientering används för både plattan med primningsmikrobrunnar och plattan med amplifieringsmikrobrunnar. Primningsmikrobrunnarna för DTB-analysen utgörs av enfärgade orange mikrobrunnremsor. Amplifieringsmikrobrunnarna utgörs av orangerandiga mikrobrunnremsor. D. Beredning av analyskontroller Obs! BD ProbeTec ET DTB kontroller, DTB lyseringsbuffert 2 och DTB neutraliseringsbuffert 3 bör vara vid rumstemperatur före användning. Använd buffertarna som tidigare alikvoterades för provberedning. Blanda ordentligt fore användning. 1. Bered ett rör med negativ DTB-kontroll och ett rör med positiv DTB-kontroll för varje omgång (platta) som skall testas. Om en platta innehåller mer än ett DTB-reagenspackpartinummer måste kontroller testas tillsammans med varje enskilt parti. 2. Ta av locket från röret med negativ kontroll. a. Med användning av en ny pipett, dispensera 100 µl DTB lyseringsbuffert 2. b. Med användning av en ny pipett, dispensera 600 µl DTB neutraliseringsbuffert 3. 3. Sätt tillbaka locket ordentligt på röret och vortexblanda i 5 sek. 4. Ta av locket från röret med den positiva kontrollen. a. Med användning av en ny pipett, dispensera 100 µl DTB lyseringsbuffert 2. b. Med användning av en ny pipett, dispensera 600 µl DTB neutraliseringsbuffert 3. 5. Sätt tillbaka locket ordentligt på röret och vortexblanda i 5 sek. 6. Sätt kontrollrören i mikrocentrifugen med standardrotorn. Stäng locket och pulscentrifugera i 10 sekunder. Ta bort rören från centrifugen och sätt dem i det genomskinliga pipetteringsstället. E. Testmetod 1. Avlägsna och kassera locken från provrören och kontrollerna för första körningen. 2. BYT HANDSKAR. 3. Förbered primningsmikrobrunnsplattan med hjälp av plattlayoutrapporten som en guide. 4. Försegla åter primningsmikrobrunnpåsen på följande sätt: a. Lägg påsen på en plan yta. Håll den öppna änden platt med ena handen. b. Tryck och för samtidigt fingrarna längs förseglingens utsida från ena änden av påsen till den andra. c. Kontrollera att påsen är förseglad. 5. Välj Program 1 på BD ProbeTec ET pipetteringsinstrumentet. 6. Plocka upp pipettspetsarna. Expandera pipetteringsinstrumentet genom att dra ut distanseringsratten hela vägen. OBS! Kontrollera att spetsarna sitter väl fast på pipetteringsinstrumentet så att läckage förhindras. Obs! När proverna aspireras, undvik försiktigt pelleterat debris, vilket kan täppa till pipettspetsarna och påverka testresultaten. 7. Aspirera 200 µl från den första kolumnen prover. 8. Fäll varligt ihop pipetteringsinstrumentet, snudda med pipettspetsarna mot brunnarnas sidor och dispensera 150 µl i den första kolumnen primningsmikrobrunnar (1 A-H). OBS! För att säkerställa att noggrannheten och precisionen upprätthålls och för att undvika kontaminering är det viktigt att vätskan dispenseras mot mikrobrunnarnas innerväggar. 9. Kasta spetsarna. Tryck in pipetteringsutlösaren för att återställa pipetteringsinstrumentet. 10. Plocka upp nya spetsar, expandera pipetteringsinstrumentet och aspirera 200 µl från den andra kolumnen prover. 11. Fäll varligt ihop pipetteringsinstrumentet, snudda med pipettspetsarna mot brunnarnas sidor och dispensera 150 µl i den andra kolumnen primningsmikrobrunnar (2 A-H). 7

OBS! Pipetteringsinstrumentet får inte fällas ihop över proverna eller mikrobrunnarna, eftersom detta kan orsaka kontaminering. Plötsliga rörelser kan ge upphov till bildning av droppar eller aerosoler. 12. Kasta spetsarna. OBS! Kasta spetsarna försiktigt så att droppar och aerosoler som kan kontaminera arbetsområdet undviks. 13. Fortsätt att överföra de återstående proverna i analysomgången. 14. Täck över primningsmikrobrunnarna med primningsskyddet och inkubera plattorna vid rumstemperatur i minst 20 min. (Kan inkuberas i upp till 6 h.) OBS! Förslut de preparerade proverna med nya lock. BYT HANDSKAR. 15. När primningsinkuberingen är avslutad skall plattan med amplifieringsmikrobrunnar göras i ordning. Konfigurera amplifieringsmikrobrunnarna på en platta enligt plattlayoutrapporten (på samma sätt som primningsplattan). Försegla åter amplifieringsmikrobrunnpåsen enligt anvisningarna i steg #4. 16. Ta av skyddet från plattan med primningsmikrobrunnar och sätt in plattan i primningsvärmaren. Sätt OMEDELBART in plattan med amplifieringsmikrobrunnar i förvärmaren. 17. Ställ in tidtagaren på 10 min. (OBS! Korrekt tid för detta steg är ytterst viktigt.) 18. Välj program 5 på pipetteringsinstrumentet efter den 10 min. långa (+/- 1 min.) inkuberingen. 19. Plocka omedelbart upp pipettspetsar och överför 100 µl från kolumn 1 på plattan med primningsmikrobrunnar till kolumn 1 på plattan med amplifieringsmikrobrunnar. Snudda med pipettspetsarna vid brunnarnas sidor och dispensera vätskan. Låt pipetteringsinstrumentet automatiskt blanda vätskan i brunnarna efter utförd dispensering. 20. Kasta spetsarna. Plocka upp nya spetsar och fortsätt att överföra reaktionsblandningen från primningsmikrobrunnarna till amplifieringsmikrobrunnarna, kolumn för kolumn, med nya pipettspetsar för varje kolumn. 21. När den sista kolumnen har överförts, avlägsna fodret från en amplifieringsförsegling. (En amplifieringsförsegling [1/2] kommer att täcka upp till 6 kolumner; om plattan överstiger 6 kolumner, MÅSTE ett helt ark försegling användas.) Håll i förseglingens kanter och placera den över mikrobrunnarna. Använd styranordningarna på förvärmaren som vägledning vid påsättning av förseglingen. Tryck ned förseglingen så att samtliga mikrobrunnar är fullständigt förseglade. 22. Vid BD ProbeTec ET-användargränssnittet, ta ut hållaren, öppna dörren och plattskyddet. Överför OMEDELBART (inom 30 sek.) den förseglade plattan med amplifieringsmikrobrunnar till BD ProbeTec ET-instrumentet och starta analysomgången. (För detaljerade anvisningar hänvisas till användarhandboken för BD ProbeTec ET-systemet.) 23. Slutför följande del av rengöringsproceduren efter att analysomgången satts igång: a. Försegla primningsmikrobrunnarna med en amplifieringsförsegling och avlägsna plattan från primnings- och förvärmaren. (Använd den värmeresistenta handsken för att avlägsna plattan temperaturen överskrider 70 C.) b. Låt pattan svalna av på bänken under 5 min. Kassera primningsmikrobrunnarna i en behållare för biologiskt riskavfall. c. Rengör metallplattan: Skölj plattan med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Skölj plattan med destillerat eller avjoniserat vatten. Linda in plattan i en ren handduk och låt den torka fullständigt innan den åter används. 24. När analysomgången är avslutad genereras en utskrift av analysresultaten. 25. Flytta ut platthållaren ur stativet, öppna dörren och avlägsna plattan. Stäng dörren och för plattstativet tillbaka in i instrumentet. 26. Ta upp de förseglade amplifieringsmikrobrunnarna från plattan. Försiktighet: Förseglingsmaterialet får ej avlägsnas från mikrobrunnarna. De förseglade mikrobrunnarna kan enkelt avlägsnas från plattan som en enhet genom att man håller i förseglingens över- och nederdel och lyfter brunnarna rakt upp och ut ur plattan. Lägg in de förseglade mikrobrunnarna i avfallspåsen. Försegla påsen. 27. Rengör metallplattan: Skölj plattan med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Skölj plattan med destillerat eller avjoniserat vatten. Linda in plattan i en ren handduk och låt den torka fullständigt innan den åter används. 28. Utför följande rengöringsprocedurer efter att den sista analysomgången för dagen är avslutad: a. Rengör arbetsbänkarna med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Låt lösningen ligga kvar på arbetsytorna under 2 3 min., torka sedan med destillerat eller avjoniserat vatten. b. Rengör provrörsstället och det genomskinliga pipetteringsstället genom att sänka ned den i 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox i max. 60 sek. Skölj noggrant med destillerat eller avjoniserat vatten och låt lufttorka. c. Rengör de yttre ytorna på primnings- och förvärmaren samt BD ProbeTec ET-instrumentet med 1 % (vol/vol) natirumhypoklorit med Alconox. Torka ytorna med destillerat eller avjoniserat vatten. d. Rengör pipetteringsinstrumentets handtag (ENDAST HANDTAGET) med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Torka handtaget med destillerat eller avjoniserat vatten och torka torrt med en ren handduk. e. Återuppladda pipetteringsinstrumentet. f. Bortskaffa de förseglade avfallspåsarna och påsen med biologiskt riskavfall enligt fastställda rutiner för bortskaffande av kontaminerat biologiskt avfall. 8

Kvalitetskontroll BD ProbeTec ET DTB-kontrollset tillhandahålls separat. En positiv och en negativ kontroll måste inkluderas i varje analysomgång samt för varje nytt reagenspartinummer. Kontrollerna kan utplaceras slumpartat. DTB positiva kontroll används för att övervaka reagensmisslyckande, slutförande av viktiga procedurmoment (pipettering och inkuberingar), amplifiering och detektion. DTB negativa kontrollen används för att övervaka kontaminering av reagens och/eller omgivning. För att provresultaten skall kunna rapporteras måste analysresultatet för de DTB positiva och DTB negativa kontrollerna utfalla positivt respektive negativt. Om resultaten för kontrollerna inte utfaller som förväntat betraktas analysomgången som ogiltig och patientresultaten rapporteras inte av instrumentet. Om kvalitetskontrollen inte utfaller med förväntat resultat skall hela analysomgången upprepas med ett nytt set kontroller, nya mikrobrunnar och de preparerade proverna. Om upprepad kvalitetskontroll inte ger förväntat resultat skall Teknisk service kontaktas (se Tolkning av resultat ). Se avsnitt D i TESTFÖRFARANDE för anvisningar om beredning av kontrollerna. Fortsätt med testproceduren enligt anvisningarna i avsnitt E i TESTFÖRFARANDE efter att kontrollerna beretts. En intern amplifieringskontroll (IAC, Internal Amplification Control) är inbyggd i primningsmikrobrunnen. IAC innehåller nukleinsyra som amplifieras i närvaro av provmatrix. IAC är utformad för att bekräfta validiteten i amplifieringsreaktionen och identifiera potentiell inhibition från det preparerade provet. Provbearbetningskontroll: För att testa effektiviteten av provberedning, bör en procedurkontroll testas rutinmässigt i enlighet med lokala bestämmelser. Procedurkontrollen består av en lösning av M. tuberculosis (t.ex. American Type Culture Collection, H37Ra ATCC 25177). Lösningen bör prepareras enligt följande: 1. Förbered en McFarland nr. 1-suspension av organismen. 2. Späd McFarland-lösningen till 1:100 med bovint albumin (FractionV)), (t.ex. pipettera 0,1 ml McFarland-lösning till 9,9 ml bovint albumin och blanda noggrant). 3. 1,0 ml alikvoter kan frysas vid -20 C eller kallare (ej-cykliskt). 4. Cellsuspensionen bör prepareras som ett rutinprov för analys i BD ProbeTec ET-systemet. Övervakning av förekomst av DNA-kontamination: Innan den första körningen av BD ProbeTec ET DTB-analysen och åtminstone månatligen därefter, bör den följande testproceduren utföras för att övervaka arbetsområdet och utrustningens ytor avseende närvaro av DNA-kontamination. Övervakning av miljön är av avgörande betydelse för att detektera kontaminering innan sådan hinner utvecklas till ett problem. 1. Använd en CultureSwab EZ provtagningspinne för varje område* som skall testas. 2. Märk ett provrör för varje område som ska testas och pipettera 100 µl DTB lyseringsbuffert 2 och 600 µl DTB neutraliseringsbuffert 3 till varje rör. 3. Doppa den första provtagningspinnen i provrörets buffertblandning, och torka av det första området med en bred, svepande rörelse. 4. Stoppa ned provtagningspinnen i buffertblandningen, exprimera provtagningstoppen, sätt på locket på röret och vortexblanda i 5 sek. Kassera provtagningspinnarna. 5. Upprepa ovanstående steg för varje område som skall provtas. 6. Sätt rören i provrörsstället och värm i ugnen (avsnitt C i PROVBEREDNINGSPROCEDUR). 7. Använd rena handdukar indränkta med vatten för att avlägsna rester av buffertblandning från provtagningsområdena medan rören värms. 8. Efter uppvärmning, sätt rören i mikrocentrifugen med standardrotorn, stäng locket och pulscentrifugera i 10 sek. 9. Avlägsna rören från centrifugen och undersök om det finns kondensation i locken. Om kondensation finns, upprepa centrifugeringen. 10. Sätt rören I det genomskinliga pipetteringsstället och fortsätt med TESTFÖRFARANDET. * Rekommenderade testområden inkluderar: ugnens yta, sonikeringsbad, 2 ml provrörsställ, genomskinligt pipetteringsställ, primnings- och förvärmare, svarta mikrobrunnsplattor, pipetteringsinstrumentets handtag, touchtangentinstrument, tangentinstrument och hela arbetsbänken. Vid positivt resultat för ett område skall området rengöras med 1 % (vol/vol) natriumhypoklorit med Alconox. Se till att hela området fuktas med blekmedelslösningen och låt den verka på ytan i minst 2 min. eller tills den torkat. Torka vid behov bort överflödig blekmedelslösning med en ren handduk. Torka av området med en ren handduk indränkt med avjoniserat eller destillerat vatten och låt ytan torka. Testa området på nytt. Upprepa förfarandet tills ett negativt resultat erhålls. Kontakta Teknisk service för ytterligare information om det inte går att få bukt med kontaminationen. TOLKNING AV ANALYSRESULTAT DTB analysresult Positivt Negativt Ej bestämbart Rekommenderat resultat Probe-analys positiv för M. tuberculosis komplexets DNA. I avvaktan på AFB-odling. Probe-analys negativ för M. tuberculosis komplexets DNA. I avvaktan på AFB-odling. Upprepa probe-analysen från preparerat prov. Om positivt eller negativt använd lämpligt uttlåtande ovan. Om ännu ej bestämbart är Initiala och upprepade probe-analyserna ej bestämbara. Lämna prov för ny analys. I avvaktan på AFB-odling. 9

METODENS BEGRÄNSNINGAR 1. Denna metod har endast testats med luftvägsprover som t.ex. sputum (inducerat eller expektorerat), bronkoalveolärat lavage samt aspirat från bronker och trachea. Prestandan vid användning med andra provtyper har ej utvärderats. 2. Ett negativt resultat exkluderar inte möjligheten av att målorganismens koncentration ligger nedom testets sensitivitet. 3. Som vid andra diagnostiska tester skall resultaten som erhålls med DTB-analysen tolkas i kombination med andra laboratorieoch kliniska data som läkaren har tillgång till. 4. DTB-anlaysen differentierar inte mellan medlemmar från M. tuberculosis komplexet M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum och M. microti. 5. För optimalt resultat av denna analys krävs att provtagning och hantering av proverna utförs korrekt. 6. De specificerade centrifugeringsförhållandena måste följas eftersom otillräcklig centrifugering kan orsaka falskt negativa resultat. 7. DTB-analysen detekterar inte varianter av M. tuberculosis komplexet som saknar sekvensen IS6110. 8. Användning av DTB-analysen är begränsad till personal som har tränats i analysförfarandet och BD ProbeTec ET-systemet. 9. DTB-analysen kan inte användas för att bedöma huruvida behandlingen varit framgångsrik eller misslyckad, eftersom nukleinsyror från Mycobacterium tuberculosis-komplexets organismer kan kvarstå även efter antimikrobiell behandling. 10. DTB-analysen är ej avsedd att ersätta odling i antimikrobiellt resistensbestämningssyfte. 11. DTB-analysen tillhandahåller kvalitativa resultat. MOTA-poängens storlek och antalet celler i ett positivt prov är inte korrelerade med varandra. 12. M. tuberculosis-komplexets probe-sekvens, IS6110, är specifik får M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum och M. microti. 13. DTB-analysen kommer att detektera varianter av icke-tuberkulösa mykobakteriella species som kan innehålla IS6110-sekvensen. 14. Det prediktiva värdet hos en analys är beroende av prevalensen för sjukdomen i en viss population. 15. Effekten av andra möjliga variabler som t.ex. antimikrobiell behandling eller saminfekterade prover har inte fastställts. 16. Om du använder en laboratorieugn för allmänt bruk ska du se till att vätskan i provrören uppnår en temperatur på 101 C ± 1 C under minst 30 min för att göra eventuella mykobakterier i proverna icke-viabla. FÖRVÄNTADE RESULTAT Totalt 1157 prover insamlade från 986 patienter vid två geografiskt olika kliniska studieplatser har analyserats med BD ProbeTec ET DTB-analysen. En frekvensdistribution av de initiala MOTA-poängen visas I figure 1. BD ProbeTec ET DTB-resultat presenteras i jämförelse med resultat från referens-tb och utstryk med syrafasta bakterier (AFB). Ett referens TB-resultat baserades antingen på ett mykobakteriellt odlingsresultat eller patientdiagnos från journalgenomgång Närvaro eller frånvaro av Mycobacterium tuberculosis -komplex fastställs genom att jämföra BDProbeTec ET DTB MOTA-poängen för proven ifråga med de tidigare fastlagda gränsvärdena. MOTA-poängen är ett mått som används för att bedöma storleken på den signal som genereras som resultat av reaktionen. Storleken på MOTA-poängen är inte ett mått på hur stor mängd av organismen som finns närvarande i provet. Alla beräkningar utförs automatiskt av programvaran i instrumentet. Proven som analyserades vid de två platserna identifierades med BD ProbeTec ET som positiv, negativ eller ej bestämbar. Endast ett prov genererade ett obestämbart resultat vid den ursprungliga testningen. Detta prov analyserades som negativt när det upprepades. Figur 1: Frekvensdistribution av DTB MOTA-poäng 900 800 700 600 792 Frekvens 500 400 300 200 184 100 0 31 10 12 1 36 6 3 82 2 < 3 400 3 400 19 999 20 000 39 999 40 000 59 999 60 000 79 999 80 000 Referens TB (-) Referens TB (+) DTB MOTA 10

Stryk och referens TB-resultat 0 3 399 3 400 19 999 20 000 39 999 40 000 59 999 60 000 79 999 80 000 Stryk (+) TB (+) 2 1 19 144 60 1 Stryk (+) TB ( ) 18 0 1 1 0 0 Stryk ( ) TB (+) 29 11 17 40 22 1 Stryk ( ) TB ( ) 774 10 0 5 1 0 FUNKTIONSEGENSKAPER Klinisk utvärdering BD ProbeTec ET DTB-analysen utvärderades vid två geografiskt olika kliniska plaster där prevalensen av tuberkulos varierade från 9,2 % till 34,1 %. Totalt analyserades 1157 prover från 986 patienter med DTB-analysen och resultaten jämfördes med mykobakteriell odling. BD ProbeTec ET DTB-analysens resultat visas i tabell 1 (per prov) och i tabell 2 (per patient). Resultat separeras med hjälp av resultat från utstryk. Alla prover från en patient används i kategoriseringen av den patienten. Antalet prover per patient varierade från ett till tre. En patient som bidrar med ett eller flera positiva DTB-resultat definieras som en DTB-positiv patient. En patient som bidrar med ett eller flera odlingspositiva resultat för MTB-komplexet definieras som en odlingspositiv patient. Tabell 1: Resultat från DTB i jämförelse med initial odling per patient DTB-resultat Utstryks-resultat Odling (+) Odling ( ) (+) Utstryk (+) 223 4 Utstryk ( ) 88 19 ( ) Utstryk (+) 2 18 Utstryk ( ) 29 774 Tabell 2: Resultat från DTB i jämförelse med initial odling per patient DTB-resultat Utstryks-resultat Odling (+) Odling ( ) (+) Utstryk (+) 192 3 Utstryk ( ) 82 16 ( ) Utstryk (+) 2 17 Utstryk ( ) 23 651 Det fanns 54 avvikande DTB-resultat i jämförelse med initiala odlingsresultat. Genomgång av patientjournal användes för att ställa diagnos vid alla avvikande resultat. Ett referens TB-resultat baserades antingen på ett mykobakteriellt odlingsresultat eller patientdiagnos från journalgenomgång BD ProbeTec ET DTB analysresultat i jämförelse med referens TB-resultat visas i tabell 3 (per prov) och i tabell 4 (per patient). Resultat separeras med hjälp av resultat från utstryk. Tabell 3: Resultat från DTB i jämförelse med referens TB-resultat per prov DTB-resultat Utstryks-resultat Referens TB (+) Referens TB ( ) (+) Utstryk (+) 225 2 Utstryk ( ) 91 16 ( ) Utstryk (+) 2 18 Utstryk ( ) 29 774 Tabell 4: Resultat från DTB i jämförelse med referens TB-resultat per patient DTB-resultat Utstryks-resultat Referens TB (+) Referens TB ( ) (+) Utstryk (+) 192 3 Utstryk ( ) 82 16 ( ) Utstryk (+) 2 17 Utstryk ( ) 23 651 Uppskattade prestandaparametrar visas i tabell 5 I jämförelse med initiala odlingsresultat och referens TB-resultat. Sensitivitetsparametrar är separerade med hjälp av utstryksresultat. Tabell 5: Uppskattad prestanda av DTB-analys BD ProbeTec ET i jämförelse med odlingsresultat Total sensitivitet Utstryk (+) sensitivitet Utstryk ( ) sensitivitet Specificitet BD ProbeTec ET i jämförelse med referens TB-resultat Total sensitivitet Utstryk (+) sensitivitet Utstryk ( ) sensitivitet Specificitet 90,1% 99,1% 75,2% 97,2% 91,1% 99,1% 75,8% 97,8% 11

Analytiska studier Precision: Precisionspaneler testades på tre plaster (två externa och en intern). Varje panel bestod av två negative prover, två lågt positva prover (95 CFU/mL) och två måttligt höga positive prover (1 000 CFU/mL). De positive proverna preparerades genom att spetsa en negative NALC-NaOH.sedimentpool med kända mängder av Mycobacterium tuberculosis. Proverna testades I tripletter vid sex olika körningar. Positiva och negativa analyskontroller inkluderades i varje körning. Eftersom ingen variabilitet mellan platserna eller dagtill-dag förekom, har data från alla platserna kombinerats och de presenteras i tabell 6. Tabell 6 Prov # Observationer % korrekta Måttligt höga (+) 108 100 Låga (+) 108 97,2 Negativa ( ) 108 99,1 Analytisk sensitivitet: Detektionsgränsen för DTB-analysen (Limit of detection, LOD) definieras som det minsta antal nukleinsyremål som kan detekteras 95 % av gångerna med systemet. Detta LOD fastställdes till att vara 204 kopior per reaktion av målsekvensen IS6110. Denna sekvens kan förekomma i Mycobacterium tuberculosis komplexets organismer i upp till 23 kopior per organism. När 31 isolat tillhörande komplexet hade testats, visade det sig att LOD var nio CFU per reaction, eller 125 CFU/mL. Den lägsta gränsen av sensitivitet för ett AFB-utstryk är ungefär 1 x 10 4 CFU/mL. Analytisk specificitet: DTB-analysens specificitet utvärderades med testning av ett hundra tjugo (120) organismer vid koncentrationer mellan 10 6 10 8 CFU/mL. Dessa organsimer, vilka kan eller behöver inte vara närvarande i luftvägsprover, inkluderade 66 bakterier, 39 icketuberkulösa mykobakterier, sex jäst och svamp samt nio virus. Ingen av de testade organsimerna korsreagerade med DTB-analysen och det fanns ingen inhibition av IAC. Interfererande substanser: Möjliga interfererande substanser, vilka kan påträffas i luftvägsprover, testades med DTB-analysen. Potentiellt interfererande substanser utvärderades i frånvaro av målorganism. Ingen av de testade substanserna interferade med DTB-analysen och det fanns ingen inhibition av IAC. Testad substans Helblod (2,5 % 10 %) Humana vita blodkroppar (1 000 50 000 LPK/µL*) Lidokain (2%) Fenolisk svalgspray (0,02 x normaldosering) Induktionslösning för sputum (3 % NaCl) Astmaläkemedel (fyra vid normaldosering) Anti-tuberkulösa läkemedel (nio vid normaldosering) Anti-retrovirala läkemedel (tre vid normaldosering) *Prover innehållande 50 000 LPK/µL kan resultera i att NALC-NaOH-sedimentet lossnar under dekanteringssteget. 12