Monitorering av immunmodulerande behandling med flödescytometri Maria Hjorth & Charlotte Dahle Klinisk immunologi & Transfusionsmedicin Universitetssjukhuset Linköping
Immunmonitorering med flödescytometri Autoimmuna sjukdomar Immunbristutredning HIV Hematologpatienter / stamcellstransplanterade
Totalt antal lymfocyter i blod 2 x 10 9 /L = 2.000.000.000/L T-celler 60-80 % B-celler 5-20 % NK-celler 5-20 % Totalt ca 0,5 kg lymfocyter i kroppen
Monitorering vid immunmodulerande behandling Allt fler prover från patienter med immunmodulerande behandlingar Följa behandlingseffekt på cellulär nivå Ofta kraftig påverkan på en eller flera lymfocytpopulationer Ökning / minskning av antal och andel. Utgångsprov innan behandling ( hade varit bra )
Flödescytometri = Vätska Cell Mätning Fluorescerande antikroppar binder till markörer på/i celler. Fluorescensen som avges mäts när celler passerar lasrar i ett vätskeflöde.
Flödescytometri Analyserar tusentals celler per sekund www.abcam.com
Granularitet Flödescytometri Storlek - FSC Granularitet - SSC Fluorescens Storlek Membranbundna receptorer (CD-markörer) Cytoplasmatiska antigen Nukleära antigen
Lymfocytprofil CD3+ = T-cell CD3+CD4+ = T-hjälparcell CD3+CD8+ = Cytotoxisk T-cell Lymfocyter som saknar CD3: CD19+ = B-cell CD16+56+ = NK-cell
Immunmodulerande behandling vid multipel skleros
Vad är MS? kronisk inflammatorisk sjukdom i CNS myelin och axon angrips av immunsystemet demyelinisering axonskada och nervcellsdöd T-celler, B-celler, antikroppar, komplement, cytokiner, kemokiner, toxiska metaboliter, oxidativ stress, neurotrofa faktorer, hormoner etc
Fakta om Multipel skleros (MS) Vanlig orsak till neurologiskt handikapp hos unga Ca 10/100.000 diagnosticeras per år 1/500 har MS i Sverige Kvinnor/män = 3/1 Insjuknande ålder 10-59 år (topp kring 30 år) Flera bromsmediciner alla påverkar immunsystemet
Gilenya Fingolimod Första tablettbehandlingen vid MS. Binder till S1P-receptorer. S1PR uttrycks i varierande nivåer på många olika celltyper. SIPR1 internaliseras och degraderas. Bevan & Fink, Nature 2008 Receptorn är nödvändig för att T- och B-celler ska kunna ta sig ut från lymfoida organ. Ffa CCR7+ celler som påverkas. Effekt = kraftig lymfopeni
a n t a l x 1 0 6 / L Före behandling Efter 1 års behandling L y m f o c y t e r 6 0 0 0 p < 0, 0 0 1 5 0 0 0 4 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0 0 F ö r e E f t e r
a n t a l x 1 0 6 / L a n t a l x 1 0 6 / L CD8 Fingolimods effekt på CD4+ och CD8+ T-celler Före Efter CD4 CD4+ C D 4 + Th-cell CD8+ Tc-cell C D 8 + 2 5 0 0 p < 0, 0 0 1 1 4 0 0 p < 0, 0 0 1 2 0 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 8 0 0 1 0 0 0 6 0 0 5 0 0 0 4 0 0 2 0 0 0 F ö r e E f t e r F ö r e E f t e r
a n t a l x 1 0 6 / L a n t a l x 1 0 6 / L Fingolimods effekt på B- och NK-celler C D 1 9 + C D 1 6 + 5 6 + 1 0 0 0 p < 0, 0 0 1 1 0 0 0 n. s 8 0 0 8 0 0 6 0 0 6 0 0 4 0 0 4 0 0 2 0 0 2 0 0 0 0 F ö r e E f t e r F ö r e E f t e r
CD62L/CCR7 Differentiering av T-celler Central Memory (CM) Naive Effector Memory (EM) T effector memory (TEMRA) CD45RA Naiva och CM cirkulerar genom lymfoida organ. EM och TEMRA vandrar till inflammatoriska härdar. Sallusto et al, 1999, Nature Amyes et al, 2005, J Immunol
CD62L Fingolimods påverkan på fördelning av T-celler i blod Före behandling Efter 1 års behandling CD45RA
Fingolimod Gilenya Skrämmande låga antal T- och B-celler i cirkulationen Finns i lymfkörtlar (antigen kommer dit) Risk för infektioner, dock ovanligt med allvarliga
B-cellsdepletion vid reumatisk sjukdom
Genetech Inc., Biogen Idec Inc.
Mabthera (Rituximab ): Anti-CD20 Behandling av B-cellslymfom o Effekt på antikroppsmedierade sjukdomar. Förbättring av samtidig autoimmun sjukdom. Betydelse av B-celler vid T-cellsmedierad sjukdom o Dämpar inflammation genom cytokinproduktion och minskad antigen-presentation. Variation i respons på Rituximab-behandling o Liten population kvarvarande B-celler efter Rituximab kan ge fortsatta kliniska besvär. Nytta av ytterligare dos (Dass et al., Arthritis & Rheumatism, 2008).
Genetech Inc., Biogen Idec Inc.
B-cellspanel med hög känslighet Rituximab ger lågt antal B-celler (CD19+) Konventionell analys visar vanligen avsaknad av CD3 CD19 CD20 CD21 CD27 CD38 IgD B-celler. Eventuella kvarvarande celler kan detekteras med flödescytometri med hög känslighet. Dubbel volym blod + antikropp + insamling av allt provmaterial, helst 50 000 100 000 lymfocyter.
Gatingstrategi - plasmablaster Plasmablaster 1,5x10 6 /L 0,5% av B- celler
Effekt av Rituximab Plasmablaster Obehandlad 11x10 6 /L 4,6% av B-celler Två doser; fyra mån efter senaste dosen Plasmablaster 4,5x10 6 /L 32% av B-celler Fyra doser; en vecka efter senaste dosen Plasmablaster 0,1x10 6 /L 12% av B-celler
Konklusioner Immunmodulerande behandling allt vanligare Ökande behov av immunmonitorering Utgångsprov före behandling