TVCB07 Celltillväxt och celldifferentiering Utgångspunkter för basgruppsarbetet 1. Kontaktinhibition och tillväxtfaktorer 2. Könskromatin 3. Kärntransplantation 4. Utvecklingsbiologi 5. Apoptos 6. Burkitt s lymfom
Utgångspunkt #1. Kontaktinhibition. Tillväxtfaktorer med aktivitet in vivo Normala humana fibroblaster som sås ut på petriskålar i närvaro av näringsmedium och serum ökar i antal med tiden. Pågående celldelningsaktivitet kan visas i form av högt mitotiskt index och inbyggnad av 3 H-thymidin i makromolekylärt material. När cellerna närmar sig konfluens avtar celldelningsaktiviteten och avstannar vid en viss s k terminal celltäthet. Cellerna kvarstannar i detta tillstånd oavsett om nytt medium, inklusive blodserum, tillförs, med endast marginell DNA-syntes. När kulturen rispas t ex med en metalltråd startar åter celldelning, nu begränsad till de fria kanterna av den defekt som metalltråden skapat. Där ses livlig inbyggnad av 3 H-thymidin, medan resten av kulturen som exponeras för samma medium, fortfarande vilar. Epidermal growth factor (EGF) är den först kända av tillväxtfaktorerna och har länge stått modell för andra faktorer med liknande funktion. I de första experimenten fraktionerade Cohen tillsammans med Levi-Montalcini biologiskt aktiva extrakt för att isolera de aktiva komponenterna. Reningsarbetet bedrevs bl a med hjälp av en biologisk assay som grundade sig på ögonspringans öppning respektive tändernas frambrytande hos nyfödda råttungar. När EGF injicerades på djuren försköts både ögonöppningen och tanderuptionen mot kortare tider efter födseln. I analoga experiment visade Gospodarowicz att en faktor, senare benämnd fibroblast growth factor, FGF, gynnade utväxten av förlorade extremiteter hos amfibier.
Utgångspunkt #2. Könskromatin Hos däggdjursceller från honor inaktiveras den ena av de två X-kromosomerna tidigt under embryonalstadiet. Inaktiveringen sker slumpvis av maternal eller paternal X-kromosom och visar sig sedan som kondenserat kromatin (s.k. könskromatin, Barr-body). Det finns en intracellulär minnesfunktion, som håller reda på vilken av de båda X-kromosomerna som inaktiverats. Man upptäckte så småningom att könskromatinets DNA hade en högre grad av metylerat cytosin. DNA-metylering har senare visat sig viktigt för ett liknande fenomen, s.k. genomic imprinting. Det verkar dock fortfarande oklart om metyleringen är orsak till geninaktiveringen eller om den är en följd av densamma. För några år sedan upptäcktes en gen för ett speciellt RNA (Xist), som inte kodar för något protein men som på något sätt verkar vara inblandat i inaktiveringen av den ena X-kromosomen.
Utgångspunkt #3. Kärntransplantation Redan i slutet på 50-talet visade engelsmannen John Gurdon genom försök på grodor att celldifferentieringsprocessen inte berodde på irreversibla förändringar av genomet. Han transplanterade cellkärnor, som tagits från grodyngel i olika utvecklingsstadier, till obefruktade ägg där den befintliga kärnan tagits bort manuellt eller inaktiverats genom UV-bestrålning. De flesta experimenten misslyckades men i några få fall resulterade försöken i vuxna, fertila individer. Förutsättningen var dock att cellkärnorna togs från grodyngel och inte från vuxna djur. I det senare fallet kunde man i bästa fall få till stånd en utveckling till simmande grodyngel, men inte längre, och ingen har heller senare lyckats erhålla en vuxen groda genom att transplantera en cellkärna från en annan vuxen groda. För några år sedan blev det stor uppståndelse när en annan engelsman, Ian Wilmut vid Roslininstitutet, lyckades klona ett får med hjälp av en cellkärna, som tagits från en epitelcell från juvret på ett vuxet djur. En förutsättning för det lyckade experimentet tycktes vara att odla donatorcellerna vid låga serumnivåer för att få in dem i G0-stadiet i cellcykeln. Senare har man också lyckats klona flera andra arter, men det har också visat sig att det är stor skillnad mellan de olika arterna vad beträffar möjligheten att klona däggdjur. Dessa försök har också lett till en omfattande diskussion, både inom och utom vetenskapssamhället, om det är etiskt försvarbart att syssla med den här typen av verksamhet. Å ena sidan finns det lovande medicinska tillämpningar, som baseras på odling av embryonala stamceller (terapeutisk kloning), men å andra sidan kan tekniken missbrukas för att klona människor (reproduktiv kloning).
Utgångspunkt #4. Utvecklingsbiologi Utvecklingen av bananflugan (Drosophila melanogaster) från det fertiliserade ägget till färdig insekt tar ca 9 dygn. Under de första 2-3 timmarna sker snabba mitoser vilket resulterar i ca 6000 cellkärnor i det fortfarande encelliga embryot. Innan gastrulationen utvecklas cellväggar mellan kärnorna och efter 24 timmar har embryot utvecklats till en segmenterad larv med ett fungerande digestionssystem. Utvecklingen styrs av en mängd olika gener, vars aktiviteter är mycket väl kontrollerade både av spatiala och temporala faktorer. Ett märkligt fenomen är att segmenteringen grundläggs redan innan cellkärnorna separerats av cellväggar. Betydelsen av enskilda gener för utvecklingen har upptäckts genom att studera resultaten av mutationer i dessa gener. Även om utvecklingen av högre organismer är mer komplicerad finns det stora likheter vilket antyder att de utvecklingsbiologiska mekanismerna är konserverade i evolutionen. De s.k. homeotiska generna kodar för proteiner som innehåller domäner (homeodomains), där likheterna mellan t.ex. bananflugan och människan är påfallande. Sådana "homeoproteiner" kan detekteras mycket tidigt i embryonalutvecklingen, hos vertebrater redan under blastocyststadiet.
Utgångspunkt #5. Apoptos En rundmask ger oss en lektion om liv och död. Naturligt förekommande eller programmerad celldöd s.k. apoptos intar en viktig roll i utvecklingen och homeostasen hos alla djurarter. Sådan celldöd, som avlägsnar celler vilka inte behövs eller redan har utfört sin funktion, kan observeras i ett stort antal vävnader hos vertebrater och icke-vertebrater. I förståelsen av apoptos har studier utförda på en nematod (rundmask) med namnet Caenorhabditis elegans spelat en avgörande roll. Under C. elegans utveckling avlägsnas 131 celler av total 1090 celler genom apoptos, ett förlopp som tydligt kan iakttagas i mikroskop. Aktiviteten hos två gener ced-3 och ced-4 (cell death abnormal) är nödvändig för denna apoptos. Dessa geners dödliga aktivitet/funktion kontrolleras av genen ced-9. Homologa gener finns hos människans alla kärnförande celler. Varje cell i kroppen har således ett komplett "maskineri" för apoptos. Anledningen att detta dödsmaskineri inte aktiveras är att varje enskild cell hela tiden är beroende för sin överlevnad av signaler från andra celler s.k. survival factors eller growth factors. Dessa kan vara lösliga cirkulerande cytokiner eller cell-cell adherens proteiner på ytan av andra celler. Apoptosen kan i vissa fall initieras genom aktivering av vissa receptorer som innehåller s.k. death domains. Ett exempel är TNF-α receptorn.
Utgångspunkt #6. Burkitt s lymfom Den engelske läkaren Dennis Burkitt, verksam i Kenya under 50-60- och 70-talet, observerade en barncancerform som förekom i ett geografiskt avgränsat bälte som spänner över den afrikanska kontinenten. Området karakteriseras av endemisk malaria och cancern benämns Burkitt's lymfom. Tumörtillväxt sker generellt genom flera diskreta steg under tumörprogressionen - steg vilka vart och ett kännetecknas av DNA-förändringar, såsom kromosombrott, deletioner, translokationer och punktmutationer. Ett av de viktiga stegen för just denna lymfomtyp är sammanfogningen av proto-onkogenen c-myc med en transkriptionellt väldigt starkt enhancer-element Eµ, som är lokaliserat till immunglobulin (Ig)-generna. Detta sker genom att en bit av kromosom 14 (där IgH-lokuset finns) byter plats med en bit av kromosom 8 (där c-myc lokuset finns), genom en s.k. reciprok translokation t(8:14). Samtliga afrikanska Burkitt's lymfom celler är dessutom infekterade med det humana herpesviruset Epstein-Barr virus (EBV).