Utveckling av ny, snabbare, analysmetod för Bacillus cereus-sporer i leverantörmjölk

Rapport nr 4945 1995-07-04 Utveckling av ny, snabbare, analysmetod för Bacillus cereus-sporer i leverantörmjölk Anders Christiansson, Kerstin Ekelund, Irena Ollermark och Inger Andersson Svensk Mjölk Forskning Telefon 0771-191900. E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se

Utveckling av ny, snabbare, analysmetod för Bacillus cereus-sporer i leverantörmjölk 1 Anders Christiansson, Kerstin Ekelund, Irena Ollermark och Inger Andersson Sammanfattning En modifierad rörmetod för mjölkbedömning har tagits fram med syfte att möjliggöra effektivare rådgivning och snabbare korrektionsåtgärder på gården. Olika inkuberingstemperaturer för mjölk i sporanalysen har prövats. Tillräcklig tillväxt för detektion inom ett dygn erhålles vid 20 C inkubering. Vid denna temperatur är det fortfarande lätt att bedöma närvaron av B. cereus i proverna efter odling av en droppe mjölk på blodagar. Vid 30 C inkubering av mjölken ökar förekomsten av andra Bacillus-arter kraftigt i dropparna, vilket försvårar avläsningen. Det bedöms inte vara nödvändigt att ha polymyxin i mjölken vid odling vid 20 C. Värmeresistensen hos psykrotrofa B. cereus-sporer har studerats. Till skillnad från mesofila sporer sker en viss avdödning av dessa sporer under värmebehandling vid 80 C i 10 minuter. Först genom en mildare värmebehandling vid 72 C i 5 minuter kan detta undvikas. Den nya metoden (pastörisering av mjölken vid 72 C/5 minuter och inkubering vid 20 C/1 dygn) minskar analystiden för B. cereus från 8 till 2 dygn. Jämförelse med den gamla metoden (80 C/10min och 8 C/7dygn) visar att fler leverantörer med höga sporhalter upptäcks med den nya metoden. Kopplingen till produktkvalitet bedöms vara likvärdig.

1 Inledning Eftersom sporer av B. cereus förekommer i så låga halter i leverantörmjölk att de inte kan påvisas med plattspridning (vanligen påträffas avsevärt färre än 1/ml; plattspridningsmetoden för B. cereus har lägsta detektionsgräns vid 10/ml), måste man analysera större volymer mjölk genom att först gynna tillväxt av B. cereus i dessa. Man använder därvid t.ex. 6 rör med 4 ml mjölk som värmebehandlas, vanligtvis vid 80 C i 10 minuter för att avdöda vegetativa bakterier, och sedan inkuberas vid 8 C i 7 dygn (1). Syftet med inkuberingen är att låta B. cereus-sporer gro ut och tillväxa så att sådana halter nås, så att man får tillväxt på blodagar om man överför en droppe mjölk från rören. Med ledning av antalet rör där man påvisar B. cereus kan sedan sporhalten grovt uppskattas. Den vanliga 8 C-anrikningen tar 7 dygn och sedan tillkommer 1 dygn för påvisande på blodagar. Detta anses bland mjölkrådgivarna vara en för lång tid, eftersom rådgivningsarbetet försvåras p.g.a. att lantbrukaren många gånger inte minns hur förhållandena på gården var vid analystillfället. Dessutom är det önskemål från mejeriföreningarna att så snabbt som möjligt rätta till eventuella fel i produktionsförhållandena. Målet med denna undersökning har varit att ta fram en metod för att kunna analysera B. cereus-sporer inom 2 dygn. Kravet på metoden har därför varit att själva anrikningssteget skulle vara klart inom ett dygn. Material och metoder 1. Laboratoriestudier: Tillväxt vid olika temperaturer Några olika Bacillus cereus-stammar odlades i 3% konsumtionsmjölk vid 8, 15, 20 och 30 C. Plattspridning gjordes vid olika tidpunkter på blodagar med polymyxin och tillväxtkurvor uppritades. Sporsuspensioner Sporer framtogs av följande B. cereus-stammar ur SMR's bakteriebank: 161 och 178 (mesofila stammar), 181, 719, 725, 738, 747 (psykrotrofa) samt 146 och 150 (långsamgroende stammar). Bakterierna odlades som utstryk på TGA-plattor vid 30 C under 1 dygn. En bakteriekoloni slammades upp i 1 ml spädvatten varefter utstryk gjordes på 4 st NA (nutrient agar)-plattor supplementerade med 5 mg MnSO 4. H2 O/l. Plattorna inkuberades 5 dygn vid 30 C, varefter mikroskopering gjordes för att kontrollera sporbildningens fullständighet. Sporerna tvättades av plattorna och slammades i PBS-buffert, varefter de tvättades två gånger genom centrifugering vid 8000 rpm (Sorvall SS32) i 10 minuter. Efter tvätt slammades sporerna i 10 ml 0,9% NaCl och förvarades i kylskåp vid 4 C. Sporhalten bestämdes efter värmebehandling vid 80 C i 10 minuter genom ytspridning på TGA-plattor innehållande 0,1% löslig stärkelse (30 C/1 dygn). Avdödningskurvor för sporsuspensioner Sporer från stamlösningarna späddes i steril skummjölk till cirka 1-10 miljoner/ml och fördelades i 5 ml-portioner i sterila provrör. Rören sattes i ett vattenbad tillsammans med ett

2 kontrollrör med 5 ml mjölk, där temperaturen mättes. Då temperaturen uppnått 72, 75 respektive 80 C startades försöket. Efter 1, 5, 10 och 15 minuter uttogs ett rör och sattes i isbad. Från varje rör gjordes en spädningsserie och överlevande sporer bestämdes genom ytspridning på TGA med 0,1% stärkelse. För varje spädningsserie sattes dubbla plattor av varje spädning. 2. Leverantörmjölks-studier Mjölkprover hämtades från slumpmässigt utvalda leverantörer via mjölkbedömningslaboratoriet i Hörby och behandlades senast dagen efter ankomst. Proverna behandlades vid olika pastöriseringstemperaturer och inkubationstemperaturer enligt beskrivning nedan under Resultat. Två försöksserier, benämnda serie 1 och 2, genomfördes. Ett antal stammar isolerades från de olika proverna i försöksserie 1 för artidentifiering och test av förmågan att växa vid 8 C. Identifiering av Bacillus-isolat. Såväl B. cereus som andra Bacillus-kolonier, plockades från agarplattor i försöksserie 1. Kolonierna renodlades och karaktäriserades med hjälp av ett identifikationskit, API 50CHB och API 20E (TrioLab). Avläsning av testerna gjordes dagligen, med slutavläsning efter 7 dygn. Isolat art-identifierades med hjälp av API's identifikationsnyckel, samt jämfördes också med kända referensstammar från SMR's bakteriebank. Test av växt vid 8 C. Sammanlagt 194 B. cereus-stammar från de 6 olika behandlingarna i serie 1 uppodlades i TG-buljong varefter de ströks på mjölkagar ( 2 % agar med 10 % steril skummjölk). Plattorna inkuberades vid 8 C och 30 C och avlästes med avseende på synlig växt dagligen efter 7 dygn och framåt för 8 C, samt efter 1 dygn för 30 C. 30 C tjänade härvid som en kontroll att levande bakterier funnits i ympen. 3. Statistisk utvärdering. Utvärdering gjordes med SYSTAT ver 5.0 för Windows. Resultat Inkuberingstemperatur: För att kunna påvisa B. cereus vid överföring av en droppe mjölk till blodagar måste man ha minst en B. cereus-cell i droppen. Droppvolymen är cirka 0.03 ml, d.v.s. det krävs minst 33 bakterier/ml i den inkuberade mjölken. Det är intressant att kunna påvisa B. cereus-sporer i halter som överstiger 100/l (0,1/ml), eftersom sådana halter kan försämra mjölkens hållbarhet. För att nå från denna nivå till cirka 100/ml krävs en ökning av bakterietalet med 3 10-potenser. För att kunna uppnå detta måste man ta hänsyn till dels den tid det tar innan sporerna gror ut och börjar tillväxa (lagfasen), dels tillväxthastigheten (båda är temperaturberoende) under exponentiell tillväxt (Figur 1A). Studier av några B. cereusstammar i renkultur indikerade att 15 C var en för låg inkuberingstemperatur, medan 20 C gav tillräcklig tillväxt (Fig. 1B). Vid 30 C erhölls mycket höga bakterietal på ett dygn. Inkubering vid 20 C borde därför vara tillräcklig för att få en säker detektion, samtidigt som man inte i onödan gynnar andra bakteriers tillväxt. Dessa slutsatser bekräftades vid inkubering av 45 olika leverantörmjölksprov vid 8, 15, 20 och 30 C (se nedan). Medianhalterna efter

3 inkubering var 8 C/7d: 400/ml, 15 C/1d: 5/ml, 20 C/1d: 13000/ml och 30 C/1dygn: 5 miljoner/ml. Värmebehandlingstemperatur: Den värmebehandling man ger proverna före inkubering har till syfte att avdöda alla vegetativa bakterier av alla slag, eftersom dessa annars skulle tillväxa under inkuberingstiden och skulle kunna förhindra att B. cereus-sporerna gror ut och tillväxer. Värmebehandlingen aktiverar också sporerna så att de lättare gror ut. Denna värmebehandling är mycket kraftig i förhållande till den lågpastörisering som mjölken utsätts Figur 1A. Exempel på tillväxtkurva för Bacillus cereus B. cereus/l 10000000 1000000 100000 Detektionsgräns 100 B. cereus/ml 10000 1000 100 10 Lagfas Exponentiell tillväxt 1 0 5 10 15 20 25 Inkubationstid (tim) Figur 1B. Tillväxt av B. cereus 747 i steril skummjölk vid 15 respektive 20 C. Log B. cereus 747/ml 6 20 C 5 4 15 C 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 Inkubationstid (tim)

4 för i mejeriprocessen. Den mest använda temperatur/tid-kombinationen är 80 C/10 minuter, som är tillräckligt effektiv för att döda alla icke sporbildare, samtidigt som sporerna anses tåla denna behandling. Det har i tidigare försök vid SMR visats att den halt B. cereus som påträffas i pastöriserad mjölk efter inkubering vid 8 C påverkas av pastöriseringstemperaturen. Vid ökad mejeripastöriseringstemperatur erhålles högre B. cereus-halter efter förvaring till bäst före-dagen (2). Detta anses bero på att fler sporer aktiveras och gror ut vid högre pastöriseringstemperatur. Det ansågs bl. a. av denna anledning motiverat att pröva lägre värmebehandlingstemperaturer för att undersöka om kopplingen till mejerimjölkens hållbarhet förbättrades. Sporer av 2 mesofila (växer ej vid 8C ), 5 psykrotrofa (isolat från k-mjölk som förvarats vid 8 C) och 2 långsamgroende (psykrotrofa men gror endast ut långsamt vid 8 C) stammar av B. cereus undersöktes med avseende på värmestabilitet i steril skummjölk vid 80 C. De mesofila sporerna påverkades ej av värmebehandlingen, medan en viss avdödning skedde för samtliga psykrotrofa sporer (Fig. 2A). De långsamgroende sporerna ökade något i antal under behandlingen (dvs fler sporer aktiverades att gro ut). För de psykrotrofa stammarna gjordes också avdödningskurvor vid 75 och 72 C. Först vid 72 C och 5 minuters värmebehandling kunde avdödning minimeras (Fig. 2B). Figur 2A. Avdödnngskurvor för sporer av två Bacillus cereus-stammar vid 80 C. Log sporer/ml 7,8 7,6 7,4 7,2 178 (mesofil) 719 (psykrotrof) 7 6,8 6,6 6,4 6,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Värmningtid (min.) Figur 2B. Avdödningskurvor vid olika temperaturer för B. cereus 719. Log sporer/ml 7,8 7,6 7,4 7,2 7 6,8 80 C 75 C 72 C 6,6 6,4 6,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Värmningstid (min.)

5 Tabell 1 visar D-värden och z-värden för de olika B. cereus-stammarna. D-värdet vid en given temperatur visar hur lång tid man behöver värma för att reducera sporhalten med en faktor 10. Z-värdet visar hur många grader man måste förändra värmningstemperaturen för att D-värdet ska förändras med en faktor 10. Tabell 1. Inverkan av värmebehandling på sporer från olika B. cereus-stammar D-värde (minuter) Stam nr. 80 C 75 C 72 C z-värde C Egenskap 161 Ingen avdödn. - - - Mesofil 178 Ingen avdödn. - - - Mesofil 146 Ingen avdödn. - - - Långsamgr. 150 Ingen avdödn. - - - Långsamgr. 181 19 50 72 14 Psykrotrof 719 14 48 71 11 Psykrotrof 725 13 36 71 11 Psykrotrof 738 14 28 53 15 Psykrotrof Jämförande studier på leverantörmjölksprover: För att jämföra analysresultaten mellan några olika kombinationer av värmebehandlingstemperatur och inkuberingstemperatur för leverantörmjölk utfördes två försöksserier. I serie 1 inkuberades mjölk från 45 leverantörer i sex olika behandlingar: Pastörisering vid 80 C/10 minuter följd av inkubering antingen vid 8 C/7dygn, 20 C/1 dygn eller vid 30 C/1 dygn, samt pastörisering vid 72 C/5 minuter följd av inkubering vid samma temperaturer. Varje prov utgjordes av 5 ml mjölk. Efter inkubering gjordes plattspridning för alla prover på såväl blodagar med polymyxin (för räkning av B. cereus och andra Bacillus) som på TGA (för att bestämma om totalantalet översteg antalet bakterier på blodagar, p.g.a tillväxt av eventuella icke sporbildande pastöriseringsöverlevande bakterier). På TGA påträffades mycket få icke pastöriseringsöverlevande bakterier, även vid den låga pastöriseringstemperaturen. Från varje prov sattes dessutom en droppe på blodagar, för att kunna avgöra om man kunde identifiera B. cereus i lika hög frekvens i dropparna som vid plattspridningen. Vid inkubering av en droppe finns det alltid möjlighet att andra bakterier också kan tillväxa och därvid försvåra bedömningen av B. cereus. Resultatet bekräftade att 20 C är en lämplig inkuberingstemperatur (se medianvärden ovan, sidan 2), eftersom man säkert når upp till de B. cereus-halter som krävs för detektion i en droppe, samtidigt som man inte onödigtvis gynnar tillväxt av andra bakterier. Vid både 8, 20 och 30 C uppträdde ibland även andra Bacillus-arter, huvudsakligen Bacillus pumilis, B. sphaericus och B. licheniformis på plattorna. Andra Bacillus uppträdde i 3 gånger högre frekvens (3-stjärnigt signifikant skillnad, d.v.s. frekvenserna skiljer sig åt med 99,9% sannolikhet) vid 30 C än vid de andra temperaturerna (Tabell 2). Det var ingen skillnad i frekvens mellan 8 och 20 C. Pastöriseringstemperaturen hade ingen signifikant inverkan på förekomsten av andra Bacillus-arter. Jämförelse mellan antalet prover där B. cereus påvisats i droppe respektive vid plattspridning visade inga signifikanta skillnader i förekomst (Tabell 3). Detta betyder att en väl utbildad mjölkbedömare inte bör ha några svårigheter att känna igen B. cereus i droppar efter 20 C-anrikning. I vissa 30 C-prover fanns dock höga halter av andra Bacillus men saknades B. cereus, trots att B. cereus fanns i 20 C-anrikningarna. Det allmänna omdömet om 30 C var att det uppträdde betydligt flera falskpositiva och svårbedömda plattor som tog längre tid att behandla.

6 Tabell 2. Förekomst av andra Bacillus-arter på blodagar. Andra Bacillus Summa Anrikningstemp. Ja Nej prov 8 C 10 35 45 20 C 11 34 45 30 C 33 12 45 Tabell 3. Jämförelse mellan detektion av Bacillus cereus vid plattspridning och i droppe för 45 leverantörmjölksprover Anrikning vid Detektionsmetod 8 C 20 C 30 C Summa Spridning 34 34 37 105 Droppe 28 34 34 96 Bakterieisolat från samtliga temperaturer ströks på mjölkagarplattor som inkuberades vid 8 C för att undersöka om det fanns skillnader i förmågan hos de B. cereus-stammar som anrikats vid de olika temperaturerna att växa vid 8 C (Tabell 4). Av isolaten som kom från 8 Canrikningarna saknade endast 3% förmågan att tillväxa vid 8 C på mjölkagar. Cirka 15% av isolaten som anrikats vid de högre temperaturerna kunde inte tillväxa vid 8 C. Paradoxalt nog fanns det fler stammar bland 8 C-isolaten som krävde mer än 7 dygn för att ge synligt tillväxt än bland de övriga. Med tanke på att 82% av isolaten från 20 C-anrikningarna uppvisade psykrotrofa egenskaper får man anse att en analys vid 20 C på ett rimligt sätt avspeglar förekomsten av psykrotrofa stammar i mjölkproverna. Tabell 4. Tillväxtförmåga på mjölkagar vid 8 C för B. cereus-stammar som isolerats vid olika anrikningstemperaturer. Procentuell fördelning m.a.p. anrikningstemperatur. Tid för tillväxt Anrikningstemperatur Ej växt Max 7d 8-13 d Summa % Antal isolat 8 C 3 68 29 100 63 20 C 18 67 15 100 74 30 C 15 65 20 100 59 Total % 12 67 21 100 196 Antal isolat 24 131 41 196 I försöksserie 2 analyserades 90 leverantörmjölksprover med samma sex metoder som ovan, men kvantitativa jämförelser gjordes. För varje prov sattes 10 rör med 2 ml mjölk med MPNmetoden. 10 rör användes för att kunna mäta skillnader med god precision inom ett större mätområde. Detektion gjordes på blodagar med droppmetoden. Dessutom värmebehandlades 50 ml mjölk vid 63 C i 30 minuter, vilket värmemässigt motsvarar en lågpastörisering vid 72 C i 15 sekunder. Denna mjölk förvarades vid 8 C i 7 dygn, varefter kvantitativ bestämning av B. cereus gjordes med plattspridning på blodagar. Några exempel på jämförelser mellan analysresultat för olika metoder visas i tabell 5A-C. Tabell 5A visar att i genomsnitt erhölls högre analysvärden för prover som pastöriserats vid 72 C än vid 80 C. Detta är sannolikt en effekt av den avdödning av sporer som sker vid 80 C. Frekvensen prover med 1150 sporer/l eller däröver var väsentligt högre efter 72 C-behandling än efter 80 C-behandling. Vid 20 C inkubering blev analysvärdena högre än vid 8 C efter 72 C-behandling (tabell 5B). 15-20% av proverna gav klart högre halter vid 20 C. Tabell 5C visar jämförelsen mellan den tidigare standardmetoden (80 C/10 minuter och 7 dygn vid 8 C) och resultatet vid pastörisering vid 72 C/ 5 minuter följd av inkubering vid 20 C i 1 dygn (metod B). Väsentligt högre analysvärden erhålls för många prover med den senare

7 analysvarianten. En sammanfattande jämförelse mellan de olika analysmetodvarianterna visas i tabell 6. Friedmans S-test är en icke-parametrisk motsvarighet till en variansanlys och testet visar på trestjärnigt signifikanta skillnader i medianvärden mellan analysmetoderna. Wilcoxon signed rank test är en icke-parametrisk jämförelse mellan parade analysdata och motsvarar en parad t-test för normalfördelade data. Tabellen visar att pastöriserings-temperaturen har en signifikant effekt på medianvärdet för analysresultaten, oavsett inkuberingstemperaturen. Inkubering vid 20 C gav den mest signifikant förhöjda skillnaden. Tabell 5. Jämförelse mellan sporanalysresultat (sporer/l) för 90 leverantörmjölksprover analyserade med olika metoder. Tabellerna visar frekvensen prover med olika utslag vid jämförelse mellan två analyser. Tabell 5A. 80 C/8 C MPN/l 25 52 112 178 255 347 458 602 805 1150 2000 n % 25 14 4 3 21 23.3 52 4 1 3 1 1 10 11.1 112 2 3 2 5 1 13 14.4 178 1 1 2 2.2 255 2 1 1 1 1 6 6.7 72 C/8 C 347 2 1 3 1 7 7.8 458 2 2 1 2 7 7.8 602 1 1 2 1 5 5.6 805 1 2 2 1 6 6.7 1150 3 2 1 6 6.7 2000 1 1 4 1 7 7.8 n 22 9 9 10 6 8 5 10 5 4 2 90 % 24.4 10.0 10.0 11.1 6.7 8.9 5.6 11.1 5.6 4.4 2.2 Tabell 5B. 72 C/20 C MPN/l 25 52 112 178 255 347 458 602 805 1150 2000 n % 25 10 5 3 2 1 21 23.3 52 2 2 3 2 1 10 11.1 112 1 1 5 1 4 1 13 14.4 178 1 1 2 2.2 255 1 1 2 1 1 6 6.7 72 C/8 C 347 1 1 1 1 1 1 1 7 7.8 458 2 3 2 7 7.8 602 1 2 2 5 5.6 805 1 1 4 6 6.7 1150 3 3 6 6.7 2000 1 6 7 7.8 n 13 8 12 6 9 5 7 5 7 4 14 90 % 14.4 8.9 13.3 6.7 10.0 5.6 7.8 5.6 7.8 4.4 15.6 sum Tabell 5C 80 C/8 C MPN/l 25 52 112 178 255 347 458 602 805 1150 2000 n % 25 8 2 2 1 13 14.4 52 3 3 1 1 8 8.9 112 4 2 3 3 12 13.3 178 2 1 1 1 1 6 6.7 72 C/20 C 255 2 1 1 2 1 1 1 9 10.0 347 1 2 2 5 5.6 458 1 1 3 1 1 7 7.8 602 2 2 1 5 5.6 805 1 2 1 1 2 7 7.8 1150 1 3 4 4.4 2000 2 4 2 4 2 14 15.6 n 22 9 9 10 6 8 5 10 5 4 2 90 % 24.4 10.0 10.0 11.1 6.7 8.9 5.6 11.1 5.6 4.4 2.2

8 Tabell 6. Jämförelser mellan B. cereus-sporanalysmetoder för 90 Hörbyleverantörer hösten 93 10*2ml mjölk Metoder A 72 C/5min+8 C/7dygn B 72 C/5min+20 C/1dygn C 72 C/5min+30 C/1dygn D 80 C/10min+8 C/7dygn E 80 C/10min+20 C/1dygn F 80 C/10min+30 C/1dygn Friedmans S-test: p<0.001 *** Wilcoxon signed rank test Jämförelse Störst p signifikans A/D A 0,018 * B/D B 0,000 *** C/D C 0,006 ** E/D E 0,095 ns F/D F 0,558 ns A/B B 0,001 *** A/C C 0,268 ns B/C B 0,049 * D/E E 0,095 ns D/F F 0,558 ns E/F F 0,178 ns A/D A 0,018 * B/E B 0,000 *** C/F C 0,019 * Tabell 7 visar medelvärdena för analysresultaten med respektive metod. Analysvärdena blev i genomsnitt 50% högre med metod B än med metod D. Denna skillnad kan tyckas relativ liten men har en ganska stor effekt på fördelningen av analysdata med MPN-metoden, vilket visas i tabell 8. Andelen extremt höga analysvärden blev högre med samtliga 72 C-metoder, i synnerhet vid 20 C-inkubering. Skillnaderna blir ännu större om klassen 458 sporer/l ingår i 3:orna. Ett exempel på sambandet mellan sporhalten mätt med en MPN-metod och halten B. cereus i samma mjölk efter 7 dygn vid 8 C efter en 63 C/30 minuters-behandling (G) visas i figur 3. Det är anmärkningsvärt att B. cereus-halterna vid denna behandling blev mycket höga efter 8 C-inkubering. Detta kan tyda på att behandlingen inte ur biologisk synpunkt är ekvivalent med en lågpastörisering, men problem med inkubatortemperaturen har troligtvis också inverkat. En relativ jämförelse mellan metoderna och behandling G kan ändå göras (tabell 9). Högst korrelationskoefficient erhölls vid pastörisering vid 72 C/5min och inkubering vid 8 C. Detta tyder på att 72 C-pastörisering och 8 C-inkubering ger resultat som mera påminner om en mejeribehandling ur hållbarhetssynpunkt än övriga metoder. Sambandet mellan G och den gamla sporbestämningsmetoden (D) är svagare, men korrelationskoefficienten har samma värde som för metod B, vilket tyder på att ett byte av metod till metod B inte skulle försämra produktkvalitetskopplingen i förhållande till den nuvarande metoden.

9 Tabell 7. Medelvärden för analys av B. cereus-sporer med olika metoder för 90 leverantörmjölksprover Metod Sporer/l Past. 72 C/5min, inkubering 8 C/7dygn 374 Past. 72 C/5min, inkubering 20 C/1dygn 452 Past. 72 C/5min, inkubering 30 C/1dygn 392 Past. 80 C/10min, inkubering 8 C/7dygn 311 Past. 80 C/10min, inkubering 20 C/1dygn 354 Past. 80 C/10min, inkubering30 C/1dygn 326 Tabell 8. Analys av leverantörmjölk med avseende på B. cereus-sporer. 6 metoder. % utslag med resp. sporhalt MPN B. cereus-sporer/l Metod <52 52 112 178 255 347 458 602 805 1150 >1150 Bc /l % 3or * 72 C 5min + 8 C 7 dygn (A) 23,3 11,1 14,4 2,2 6,7 7,8 7,8 5,6 6,7 6,7 7,8 26,7 72 C 5 min + 20 C 1 dygn (B) 14,4 8,9 13,3 7,8 8,9 5,6 7,8 5,6 7,8 4,4 15,6 33,4 72 C 5 min + 30 C 1 dygn (C) 15,6 20,0 7,8 10,0 2,2 8,9 8,9 5,6 3,3 5,6 12,2 26,7 80 C 10 min + 8 C 7 dygn (D) 24,4 10,0 10,0 11,1 6,7 8,9 5,6 11,1 5,6 4,4 2,2 23,3 80 C 10 min + 20 C 1 dygn (E) 21,1 13,3 7,8 10,0 10,0 4,4 7,8 5,6 8,9 6,7 4,4 25,6 80 C 10 min + 30 C 1 dygn (F) 20,0 12,2 16,7 4,4 5,6 8,9 7,8 10,0 7,8 4,4 2,2 24,5 Analyserna gjorda med 10*2 ml mjölk per analys. 90 leverantörer. * % 3or vid analys av 6*4 ml mjölk Med normal B.c.-analys 6*4 ml mjölk ligger gränsen för 3a mellan 448 och 602 sporer/l Figur 3. Samband mellan sporhalt i leverantörmjölk enligt metod A och halten B.cereus/ml i samma mjölkprov som värmebehandlats och förvarats 7 dygn vid 8 C.

10 Tabell 9. Korrelation mellan sporhalt vid analys enligt 6 olika metoder (se tabell 6) och halten B. cereus i mjölk som pastöriserats vid 63 C/30min. och sedan förvarats vid 7 C dygn i 8 C. Metod Korrelationskoefficient* Past. 72 C/5min, inkubering 8 C/7dygn (A) 0,568 Past. 72 C/5min, inkubering 20 C/1dygn (B) 0,460 Past. 72 C/5min, inkubering 30 C/1dygn (C) 0,504 Past. 80 C/10min, inkubering 8 C/7dygn (D) 0,457 Past. 80 C/10min, inkubering 20 C/1dygn (E) 0,451 Past. 80 C/10min, inkubering 30 C/1dygn (F) 0,507 * Spearmans rangkorrelationskoefficient, p<0,001 för samtliga koefficienter Jämförelse med fältundersökningar Parallellt med ovanstående undersökningar genomfördes vid några mjölkbedömningslaboratorier analysverksamhet med värmebehandling vid 80 C/10 minuter, samt inkubering vid 30 C 1 dygn. Anledningen till detta var att man ville pröva effekten av snabba analysresultat för rådgivningen. En svårighet i samband med detta var att välja en analysvolym som kunde ge ett rimligt antal 3:or, eftersom man kunde misstänka att frekvensen skulle öka vid bibehållen volym. Figur 4 visar fördelningen av sporhalterna hos skånska leverantörer vid tre analystillfällen. Det kan konstateras att vid augustimätningen var sporhalterna mycket höga, varför 6*1 ml valdes som analysvolym för rutinverksamheten. Figuren visar också att fluktutioner i sporhalt förekommer, varför valet av volym är svårt. Tyvärr var valet av 1 ml-volymen olyckligt eftersom relativt få prover uppnådde ett högt antal positiva rör för denna provvolym under höstens prövning av metoden. Vid ett laboratorium jämfördes analysresultaten med 30 C-metoden med 8 C-metoden. Eftersom olika rörvolymer användes i analyserna är det inte möjligt att direkt jämföra antalet positiva rör. % leverantörer 70 60 Figur 4. Bacillus cereus-sporer i skånsk mjölk vid tre tillfällen 1993 50 Analysmetod: 80 C/10 min, inkubering vid 30 C i 1 dygn 40 30 Juni, 96 lev Aug, 200 lev Sept.-okt. 90 lev 20 10 0 Sporer/l mjölk

11 I tabell 10 jämföres den procentuella fördelningen av prover från analysserie 2 med fördelningen i fältundersökningarna uttryckta i sporhaltsintervall. Med 80 C/30 C-metoden erhölls i försök 2 en fördelning som påminner om de olika analyscentralernas resultat. En jämförelse mellan 80 C/8 C-metoderna visar att fler höga analysvärden erhölls i försöket än vid analyscentralen. Detta kan bero på fluktuationer i sporhalterna i tid och mellan områdena. Tabell 10. Jämförelse mellan analysutfall i fältundersökningar och labtest. 30 C Sporhalt/l Götene % Jönköping % Katrineholm % F (80 C/30 C) % <200 49,2 51,8 25,2 48,9 2-300 28,2 25,0 34,0 10,0 4-500 11,0 15,1 22,3 16,7 600-1000 6,4 4,6 9,7 17,8 11-1200 2,9 1,8 5,8 4,4 >1200 2,2 1,6 2,9 2,2 Antal prov 780 608 103 90 8 C Sporhalt/l Katrin. aug. % Katrin.sept % D (80 C/8 C) % <50 28,7 49,1 24,4 50-100 26,7 15,7 20,0 100-200 17,8 12,0 12,2 200-300 5,9 8,3 5,6 300-500 13,9 6,5 14,4 >500 6,9 8,3 23,3 Antal prov 101 108 90,0 Diskussion Resultataten av de laboratoriemässiga undersökningarna visar att man bör använda 72 C/5 minuter som pastöriseringsmetod. Den extrema känslighet för värme som uppvisats av psykrotrofa B. cereus-sporer i denna undersökning har inte varit känd tidigare. Eftersom variationer med några grader i pastöriseringstemperatur vid 80 C kan ge relativt stora skillnader i avdödningseffekter är det sannolikt att pastöriseringstemperaturen kan ha varit en osäkerhetskälla i den gamla analysmetoden. Genom att sänka temperaturen till 72 med endast 5 minuters värmningstid elimineras denna felkälla, vilket innebär att man mera kvantitativt kan bestämma sporhalten. För att uppnå kravet att kunna detektera sporer i mjölk inom ett dygn är det nödvändigt att höja inkuberingstemperaturen. 30 C bedömes härvid vara en alltför hög temperatur, eftersom den innebär en ökad risk för tillväxt av andra Bacillus-arter som stör analysen. 20 C får anses vara den bästa temperaturen. En nackdel med 20 C jämfört med 8 C är att metoden gynnar växt även av vissa B. cereus-stammar som inte skulle ha detekterats vid en 8 C-inkubering. Flertalet av dessa stammar har dock förmåga att tillväxa även vid 8 C, om än långsammare. Studierna av samband mellan B. cereus-halter i laboratoriepastöriserade prover (63 C/30 min.) inkuberade vid 8 C och sporhalterna uppmätta med MPN-metodik med metoderna B och D visar dock på ungefär lika höga korrelations-koefficienter. Man kan därför inte säga att kopplingen mellan sporhaltsbestämningsmetod och hållbarhets-förutsägelser försämras genom byte till metod B. Ur analyssäkerhetssynpunkt medför också 20 C en förbättring, eftersom fluktationer i t.ex. skåptemperatur är av mindre betydelse vid 20 C än vid 8 C. Dessa analyssäkerhetsaspekter måste anses väga tungt om B. cereus-sporanalyser ska införas i ett betalningssystem. Det återstår dock ytterligare arbete för att bättre lära känna sambandet mellan de sporhalter som uppmäts i leverantörmjölksanalysen och

12 konsumtionsmjölkens kvalitetsegenskaper. Som ny metod för snabbare analys av B. cereussporer i leverantörmjölk föreslås därför att mjölken pastöriseras vid 72 C i 5 minuter och därefter inkuberas vid 20 C i 1 dygn. Detektion av B. cereus göres genom att en droppe mjölk per rör överföres till blodagar för inkubering och avläsningar av B. cereus-växt på samma sätt som tidigare. Referenser 1. A. Christiansson, I. Andersson, K. Ekelund & E. Månsson (1992). Två metoder för bestämning av Bacillus cereus-sporer i leverantörmjölk. SMR reg.nr. 4883. 2. A. Christiansson & F. Törngren (1986). Reducering av Bacillus cereus i k-mjölk genom dubbel värmebehandling kombinerad med mellanförvaring vid förhöjd lagringstemperatur. SMR reg.nr. 4823