Genetisk kartläggning av svenska malbestånd

Genetisk kartläggning av svenska malbestånd Foto: Tobias Borger Slutrapport, juni 2008

Genetisk kartläggning av svenska malbestånd Stefan Palm 1,2, Tore Prestegaard 2, Johan Dannewitz 2, Erik Petersson 2 & Jan Eric Nathanson 2 1 Avdelningen för populationsbiologi, Evolutionsbiologiskt centrum (EBC), Uppsala universitet 2 Fiskeriverkets Sötvattenslaboratorium, Drottningholm Sammanfattning En genetisk kartläggning har genomförts av Sveriges kvarvarande bestånd av mal i Båven, Emån och Möckeln. Det mest överraskande resultatet är förekomsten av två genetiskt distinkta populationer i Emån - nedströms och uppströms. Jämförelser med DNA från två gamla individer födda på 1940-talet tyder på att skillnaden mellan populationerna har funnits längre tillbaka. Den ökade rekryteringen under senare år i övre delen av Emåns utbredningsområde (där malen har verkat vara försvunnen sedan 1980-talet) tycks bero på lyckad reproduktion för ett antal överlevande individer, och i mindre del på utsättning av mal nedströms ifrån. De genetiska skillnaderna mellan mal från Båven, Emån och Möckeln är stora. Överlag tycks få individer stå för reproduktionen, och en jämförelse med mal från övriga Europa visar att mängden genetisk variation i de svenska populationerna är låg. Ur ett bevarandeperspektiv framstår ökade beståndsstorlekar som ett mycket viktigt mål. Fortsatt genetisk övervakning behövs också för att följa utvecklingen och utvärdera åtgärder som vidtas i syfte att förbättra malens situation. Bakgrund Den europeiska malen (Silurus glanis, L.) är en av världens största sötvattensfiskar, med naturligt utbredningsområde från västra Tyskland till Aralsjön i öster. I Sverige har förekomsten av mal minskat kraftigt sedan 1800-talet. Arten står upptagen som akut hotad på den svenska rödlistan och är fredad sedan 1994. Förlust av reproduktions- och uppväxtområden anses vara de viktigaste orsakerna till artens tillbakagång (Nathanson 1995, 1998). Idag förekommer endast ursprungliga malbestånd i tre vattensystem (Figur 1) i sjön Båven med omnejd (Nyköpingsåns vattensystem, Södermanlands län), i Emåns nedre lopp (Kalmar län) samt i sjön Möckeln med närliggande vatten (Helgeåns vattensystem, Kronobergs län). Beståndsutvecklingen i Båven, Emån och Möckeln har varit negativ under en längre tid. Vid en sammanställning av märkningsstudier och annan information från 2003 bedömdes antalet malar i respektive vattensystem ha sjunkit till mellan 30-60 reproduktiva individer (JE Nathanson, opubl.). Vid så låga antal ökar risken att populationer tar skada eller dör ut på grund av demografiska och genetiska faktorer. Nu finns emellertid tecken på att malen i åtminstone Emån och Möckeln kan vara på väg att återhämta sig. Provfisken under de senaste åren har visat på ökad förekomst av unga individer (Borger & Kjellberg 2006; Lessmark 2007). I Emån har arten dessutom återkommit till uppströms belägna områden där inga fångster gjorts sedan 1980-talet. Det är dock oklart hur många föräldrafiskar som ligger bakom den lyckade reproduktionen i Möckeln och Emån. Malar kan bli gamla (50-60 år) och en stor hona producerar mycket stora mängder ägg. Det kan därför inte uteslutas att några få föräldrafiskar ligger bakom - 1 -

reproduktionen under senare tid, vilket kan innebära att populationerna är mer sårbara än vad totala antalet individer indikerar. Vad gäller Emån finns dessutom frågetecken om ursprunget hos malen uppströms i utbredningsområdet. Artens bristande förmåga till uppströms vandring gör det osannolikt att det rör sig om naturlig återkolonisation från området närmast Emåns mynning, där mal hela tiden funnits kvar. Möjligen återspeglar den positiva utvecklingen i området uppströms ett resultat av utsättningar som skett genom åren för att stärka malens situation. Dels genomfördes en mindre förstärkningsutsättning sommaren 1990 1. Senare (1999) flyttades 28 större individer från Emsfors uppströms till Gåsgöl (Figur 1 & 2). Det kan heller inte uteslutas att illegala utsättningar av mal med okänt/främmande genetiskt ursprung har ägt rum i Emån under årens lopp. En ytterligare möjlighet är att det rör sig om avkomma till ett fåtal överlevande malar som av något skäl nu lyckats med reproduktionen. Sammantaget finns ett behov av att närmare utreda de svenska malbeståndens genetiska status och historik. I denna rapport presenteras resultat från en DNA-baserad kartläggning som genomförts vid Fiskeriverkets Sötvattenslaboratorium, Drottningholm. Material för genetisk analys har samlats in i samarbete med de berörda länsstyrelserna. Studien ingår som en del av det pågående övervakningsarbetet med mal i Sverige och resultaten kommer bland annat att användas i samband med att den nationella rödlistan revideras 2010. Huvudsakliga målsättningar har varit att (1) kvantifiera de svenska beståndens populationsstruktur (mängd och fördelning av genetisk variation, populationsstorlekar, etc.), (2) jämföra svensk mal med populationer från övriga Europa, (3) utreda i vilken mån malens återkomst i övre delen av Emåns utbredningsområde är ett resultat av naturlig reproduktion respektive utsättningar samt (4) utreda det genetiska ursprunget för enskilda individer, varav flera med största sannolikhet har flyttats inom landet utan tillstånd. Material & metoder Analysen omfattar 320 individer infångade under perioden 1982-2007 från dellokaler i Båven, Emån och Möckeln (Figur 1; Tabell 1). För de flesta individer har vävnadsprov (en liten bit fena för DNA-extraktion) tagits i fält i samband med provfisken där fisken återutsatts. De tidigast infångade malarna (t.o.m 1996) har dock hållits i akvarium för kommande avel och utsättningar; i flera av dessa fall har vävnadsprovet tagits först flera år efter fångsten. I materialet ingår även 10 enskilda malar med "udda" ursprung. Det handlar dels om sju individer som fångats i Mälaren under 1998-2005. Dessa malar har med största sannolikhet satts ut illegalt 2 (Nathanson & Prestegaard 2005) och det finns anledning att utreda deras genetiska ursprung. Vi har också analyserat DNA från en mal som fångades 2003 i havet utanför Bergkvara, cirka 10 mil söder om Emåns mynning i Kalmarsund. Slutligen ingår två stora/gamla 1 Totalt 46 ensomriga avkommor från ett avelspar "Minimal" (hona) & "Mallis" (hane) fångade vid Emsfors i början av 1980-talet. Småmalarna sattes ut vid Ryssäng uppströms Finsjö (10 st), samt på ytterligare fem lokaler från Gåsgöl och nedströms 2 Det ursprungliga malbeståndet i Mälaren anses utdött. Senaste kända fynden (innan 1998) är från 1900-talets början - 2 -

malar som 1982-83 påträffades vid Finsjö och nedströms Emsfors i Emån (Figur 1), och från vilka användbart DNA har kunnat utvinnas från en sparad ryggkota respektive muskelvävnad. De båda individerna föddes sannolikt redan någon gång under 1940-talet. Syftet har varit att jämföra dessa individers genotyper med mal från senare tid för att försöka reda ut historiken för den genetiska skillnad som i denna studie påträffats mellan mal från övre och nedre delen av Emåns utbredningsområde (se nedan). Ålder och tillväxt Åldersbestämning av mal sker med hjälp av otoliter eller främsta ryggkotan, vilket kräver att fisken är död. Åldersdata saknas således för individerna som ingår i denna studie. Däremot finns längduppgifter insamlade. Endast riktigt små/unga malar (<25 cm) kan med viss säkerhet åldersbestämmas utifrån sin storlek. Även grova åldersestimat har dock ett visst värde, och vi har använt en tillväxtfunktion för att skatta ålder också för äldre malar. Funktionen har kalibrerats med längd- och åldersuppgifter för mal från Emån (Figur 3); samma funktion har använts i samtliga lokaler, eftersom tillväxtskillnaderna mellan Båven, Emån och Möckeln tycks vara små (JE Nathanson, opubl.). Genetiska analyser Individerna har genotypbestämts enligt väl beprövad metodik 3 för 13 genmarkörer (s.k. mikrosatelliter), varav 10 har ingått i de statistiska analyserna av de svenska bestånden (Tabell 3). En av mikrosatelliterna (s5-f) uteslöts då den tycks vara fixerad för samma genvariant (anlagsvariant/allel) i Båven, Emån och Möckeln. Vidare samvarierar genotyperna för S1-40a & S1-40b respektive S1-154a & S1-154b kraftigt, vilket tyder på fysisk koppling mellan dessa par av markörer (inte oväntat då de är framtagna från gemensamma kloner; Dr. R. Guyomard, Laboratoire de Génétique des Poissons, INRA, Frankrike, pers. komm.). Av denna anledning har även S1-40b och S1-154b uteslutits. Samma uppsättning av mikrosatelliter (med undantag för s3-81) har tidigare studerats hos mal från centrala, södra och östra Europa (Triantafyllidis m.fl. 2002). Skillnader i apparatur vid olika laboratorier förväntas ofta ge olika resultat vad avser anlagsvarianternas absoluta längd (antalet baspar). För att möjliggöra direkta jämförelser mellan svenska bestånd och populationer i övriga Europa har vi genomfört en kalibrering där DNA för ett begränsat antal svenska och grekiska malar analyserats "sida vid sida" (grekiska vävnadsprover med känd genotyp erhållna från Dr. A. Triantafyllidis, Aristototle University of Thessaloniki). Det antal baspar per anlagsvariant (allel) som anges i denna rapport följer de längder som rapporterats av Triantafyllidis m.fl. (2002). Statistiska analyser Ett flertal statistiska analysmetoder och datorprogram har nyttjats för olika frågeställningar och ändamål. Dessa är i korthet: F-statistik och permutationstest för avvikelser från Hardy-Weinberg proportioner och kopplingsjämvikt (FSTAT, Goudet 1995); förväntat heterozygositet och "allelic richness" (HP-RARE, Kalinowski 2005); fylogenetisk analys och trädkonstruktion (PHYLIP, Felsenstein 2004; MEGA, Tamura m.fl. 2007); analys av populationsblandningar och individers populations- och generationstillhörighet (STRUCTURE, Pritchard m.fl.2000; GENECLASS 2.0, Piry m.fl. 2004; NEWHYBRIDS, Anderson & Thompson, 2002); skattning av effektivt antal föräldrar, N b (LDNE, Waples & Do, in press); identifiering av potentiella hel- och halvsyskongrupper 3 Tekniska detaljer (PCR-protokoll etc.) kan erhållas efter förfrågan - 3 -

(COLONY; Wang 2004). Ytterligare detaljer om vissa av metoderna ges i samband med resultatredovisningen. Resultat Studien omfattar ett antal olika frågeställningar och resultatdelen är strukturerad enligt följande. Först ges en övergripande presentation av den genetiska populationsstrukturen (mängd och fördelning av genetisk variation) hos de svenska malbestånden, inklusive jämförelser med populationer från övriga Europa. Därefter följer mer detaljerade resultat avseende genetisk variation inom de respektive vattensystemen med särskilt fokus på Emån, samt estimat av antalet reproducerande individer per population. Slutligen följer analyser av sannolikt ursprung hos enskilda malar med avvikande fångstplats eller historik. Genetisk variation Antalet alleler (anlagsvarianter) varierar mellan två och sju per locus (genmarkör) med ett genomsnitt av fyra. Antalet alleler totalt (N A ) och korrigerat för skillnader i stickprovsstorlek (A R ) är påfallande lika för de olika vattensystemen. Däremot finns en tendens till något högre förväntad heterozygositet i Båven (Tabell 3). Jämfört med vilda och odlade populationer från övriga Europa är mängden genetisk variation i de svenska populationerna påfallande låg; endast två populationer utanför Sverige (PIN från Grekland och MOR från Schweiz) uppvisar färre alleler och lägre genomsnittlig heterozygositet (Figur 4). Ingen statistiskt signifikant avvikelse från de genotypproportioner som förväntas enligt Hardy- Weinbergs lag kan påvisas i materialet från Båven (F IS = -0.04; P=0.29) eller Möckeln (F IS = -0.02; P=0.25), sett över samtliga loci. I Emån finns däremot ett kraftigt genomsnittligt underskott av heterozygoter (F IS = 0.11; P<0.001) vilket förväntas vid blandning av två eller flera genetiskt distinkta populationer (en s.k. Wahlund-effekt). En närmare analys av data från Emån (se nedan) tyder också på förekomst av två skilda populationer i nedre respektive övre delen av ån. Parvisa test för slumpmässig association av genotyper i olika loci ger en relativt hög andel signifikanta avvikelser i samtliga tre vattensystem vilket tyder på avvikelser från kopplingsjämvikt (gametic phase [linkage] equilibrium). I de flesta fall avviker olika kombinationer av mikrosatelliter i de tre vattensystemen, vilket indikerar en effekt av begränsade (effektiva) populationsstorlekar snarare än fysisk koppling. Andelen signifikanser i Båven och Möckeln är 19-20%, medan motsvarande andel för Emån är hela 61%, vilket utgör en ytterligare indikation på populationsblandning i detta vattensystem. Storskalig genetisk struktur Stora genetiska skillnader finns mellan malen från Båven, Emån och Möckeln vilket bland annat framgår av Figur 5, där allelernas frekvensfördelningar är åskådliggjorda grafiskt. Närmare hälften av den totala genetiska variationen hos svensk mal förklaras av allelfrekvensskillnader mellan de tre vattensystemen (F ST =0.43; P<<0.001). Vid parvisa jämförelser framgår vidare att skillnaden tycks vara allra störst mellan Möckeln och Båven (F ST =0.56) följt av Emån och Båven (F ST =0.52), medan mal från Möckeln och Emån är något mindre olika (F ST =0.37). Ett släktskapsträd (dendrogram; Figur 6) som illustrerar de inbördes genetiska relationerna mellan samtliga malpopulationer som hittills studerats visar att svenska malar, ovanstående skillnader till trots, är jämförelsevis lika sett ur ett större geografiskt perspektiv. De två - 4 -

populationerna från Emån hamnar närmast varandra, relativt nära Möckeln, medan Båven sitter något längre ner på samma gren tillsammans med den enda egentligt västliga/vilda populationen från Europa (MOR; sjön Morat i Schweiz). I övrigt är trädet inte i påfallande grad korrelerat med det geografiska ursprunget hos populationerna. Detta tolkades av Triantafyllidis m.fl. (2002) som ett tecken på att malen efter senaste istiden kan ha återkoloniserat Europa från ett östligt refugium kring Volga (VOL i Figur 4), där den högsta mängden genetisk variation finns idag. Genetisk variation i Emån Det signifikanta underskottet av heterozygoter kombinerat och den höga andelen avvikelser från kopplingsjämvikt i Emån utgör tydliga tecken på förekomst av mer än en population. Vi har använt STRUCTURE för att uppskatta antalet populationer och det genetiska ursprunget hos de enskilda malarna. Programmet är utvecklat för att, utan hänsyn taget till annat än rent genetisk information, kunna identifiera grupper av individer (kluster eller populationer) inom vilka avvikelserna från Hardy-Weinberg-proportioner och kopplingsjämvikt är så små som möjligt. I ett första steg skattas det mest troliga antalet populationer i blandningen och dessa populationers allelfrekvenser. Därefter kan denna information nyttjas för att identifiera eventuella immigranter och hybrider. De mest troliga antalet populationer i Emån är två enligt STRUCTURE, och efter skattningar av hur stor andel av de enskilda malarnas gener som har sitt ursprung från respektive population (q; Figur 7) framgår att de båda populationerna är uppdelade mellan nedre och övre delen av ån. Undantag från mönstret förekommer i form av individer med q-värden som avviker från majoriteten. Mest tydligt är detta i Gåsgöl där de flesta malar har ett intermediärt q-värde. Ett antal individer med avvikande q förekommer även i de mer uppströms belägna lokalerna (Högsbyplatån-Finsjö; Figur 7). Sannolikt är malarna med avvikande genotyp i övre delen av Emåns utbredningsområde hybrider som uppstått genom parning med individer från populationen nedströms, vilka har flyttats med hjälp av människan. En sådan tolkning får visst stöd när materialet från Emån delas upp i två geografiska grupper ("Emån Nedre" och "Emån Övre"; jmf. Tabell 2) som då blir kraftigt genetiskt åtskilda (F ST =0.33). Efter uppdelningen kvarstår ingen signifikant avvikelse från Hardy-Weinberg proportioner inom Emån Nedre, medan Emån Övre uppvisar ett signifikant överskott av heterozygoter (Tabell 3) vilket är vad som väntas vid hybridisering. Likaså minskar andelen signifikanta avvikelser från kopplingsjämvikt från tidigare 61% i totalmaterialet till 11% och 21% i det nedre respektive övre stickprovet. För att närmare undersöka förekomsten av eventuella hybrider har malarna från Emån även analyserats med programmet NEWHYBRIDS, vilket är utvecklat specifikt för analys av hybridisering mellan två populationer. Resultatet består av sannolikheter för att individerna utgör en hybrid (F1, F2 eller återkorsning) eller hör till någon av föräldrapopulationerna (P1 eller P2). Analysen med NEWHYBRIDS (Tabell 4) ger stöd till tolkningen att det finns två genetiskt differentierade malpopulationer i Emåns olika delar och att hybrider mellan dessa förekommer. Av resultatet framgår också att hybriderna, med något undantag, sannolikt är av F1-typ (första avkommegenerationen) och att sådana hybrider förekommer såväl uppströms som nedströms. Vad gäller hybrider i nedersta delen av Emån (Karlshammar-Emsfors) skiljer sig resultatet således från det som ges av STRUCTURE, där det är svårt att urskilja några genetiskt avvikande individer inom detta område (Figur 7). Även i lokalen Gåsgöl ger de båda metoderna något olika resultat. En mer detaljerad statistisk utvärdering kommer att krävas för en bedömning av vilket av de båda analysmetodernas resultat som är mest trovärdigt. - 5 -

Historisk populationsstruktur i Emån En viktig fråga är huruvida den genetiska skillnad som föreligger mellan mal uppströms och nedströms i Emån är "ursprunglig", eller om den återspeglar utsättningar och/eller kraftig genetisk drift på grund av få föräldrar (en genetisk flaskhals) under senare tid. Det finns inga tecken på inblandning av mal från något annat vattensystem (illegala utsättningar); trots att frekvensskillnaderna mellan populationerna är stora, förekommer samtliga anlagsvarianter som påträffats uppströms även nedströms (Figur 5). Placeringen av de båda populationerna nära varandra i Figur 6 ger ytterligare stöd för att båda populationerna representerar Emån. Dessa observationer svarar emellertid inte på frågan om hur gammal dagens genetiska skillnad är. I ett försök att belysa historiken närmare har vi analyserat DNA från de två gamla individer, födda redan på 1940-talet, som påträffades vid Emsfors respektive Finsjö under 1980-talets början. Analyser med STRUCTURE och GENECLASS (se nedan) visar att dessa individer har genotyper som mycket väl stämmer överens med dagens populationer i respektive del av ån. Samma tolkning ger också en så kallad faktoriell korrespondensanalys baserad på genetiska data, där de två gamla malarna är jämförda grafiskt med nutida individer (Figur 8). Det tycks således som att en genetisk struktur i Emån liknande dagens fanns redan under 1940-talet, och att återkomsten av mal i området från Högsbyplatån till Finsjö till stor del kan förklaras av att överlevande individer lyckats med reproduktionen efter ett längre uppehåll. Genetisk struktur i Möckeln och Båven Analyser med STRUCTURE av mal från Båven och Möckeln anger en population per vattensystem som mest sannolikt. Trots detta finns i Möckeln små men statistiskt signifikanta genetiska skillnader mellan de tre delområdena (Agunnarydsån, Lilla Helgeå och Helgeå; F ST =0.03; P<0.001). En motsvarande geografisk jämförelse av lokaler inom Båven är inte möjlig, då samtliga individer utom två kommer från den nordvästra delen (Lillsjön-Hornsundssjön, Kvarnsjön). Populationsstorlekar Ovanstående analyser har visat att det finns fyra malpopulationer i Sverige Båven, Möckeln, samt "Emån Nedre" och "Emån Övre". I samtliga fall (med viss reservation för Emån Övre, där omfattande hybridisering komplicerar bilden) finns genetiska indikationer på att antalet reproducerande individer kan vara lågt. Dels förekommer genomgående svaga heterozygotöverskott (negativa F IS -värden; Tabell 3), vilket är väntat vid små populationsstorlekar. Samma tolkning gäller också det höga antalet avvikelser från slumpmässig association av genotyper i olika loci (kopplingsojämvikt). Genetiska data kan användas för uppskattningar av antalet individer, även om sådana analyser i detta fall försvåras av små stickprovsstorlekar och brist på goda åldersbestämningar. Vi har närmat oss frågan om populationernas storlek genom att dels skatta det genetiskt effektiva antalet föräldrar per år (N b ) 4 utifrån graden av avvikelse från kopplingsjämvikt (Waples 2006; Waples & Do, in press). Ett grundantagande för denna metod är att den analyserade avkomman tillhör samma årsklass. I första hand har därför de "årsklasser" som omfattar minst 10 individer analyserats (jmf. Tabell 2). För att erhålla ökade materialstorlekar har vi även analyserat stickprov bestående av individer födda under flera efterföljande år. De senare resultaten bör 4 Det effektiva antalet föräldrar per år (N b ) relaterar till mängden genetisk drift och inavel i populationen, och förväntas i de allra flesta situationer vara mindre än det totala antalet reproducerande individer under samma år - 6 -

emellertid tolkas med försiktighet; beroende på bland annat parningsmönstret (vem som parat sig med vem och när) kan den erhållna skattningen representera allt ifrån ett genomsnitt för de ingående årsklasserna till en summa av N b över samma tidsperiod. För Möckeln, där små genetiska skillnader inom vattensystemet förekommer, har vi också testat att skatta N b per dellokal. Vi har även använt programmet COLONY för att identifiera potentiella hel- och halvsyskongrupper i totalmaterialen, vars antal har översatts till ett motsvarande antal föräldrafiskar (en helsyskongrupp motsvarar två föräldrar, etc.). En svaghet med att på detta vis försöka skatta totala antalet individer (N t ) som gett upphov till det analyserade stickprovet är att stickprovsstorleken sätter en övre gräns för hur många familjegrupper som är möjliga att identifiera. De antal föräldrar som beräknas måste därför betraktas som minimumestimat. Erhållna estimat av N t och N b presenteras i Tabell 5. Som jämförelse ges också bedömningar av totala antalet reproduktiva individer utifrån provfiskedata (N t (provfiske) ) som sammanställdes 2003 (JE Nathanson, opubl.). Överlag är punktskattningarna av N t och N b låga, och skillnaderna mellan populationerna förefaller små. Där jämförelser är möjliga finns också en tendens till att N b skattas lägre än N t. I Båven och Emån Nedre är N t (Colony) lägre än N t (provfiske), vilket kan tyda på att materialstorlekarna är alltför små i dessa fall för att metoden att skatta antal föräldrar från familjer skall vara tillförlitlig. Inga uppenbara skillnader förekommer mellan N b -estimat erhållna för stickprov omfattande olika många årsklasser, även om de osäkra estimaten (breda konfidensintervall) försvårar sådana jämförelser. I Möckeln finns en tendens till något lägre N b - estimat för Helgeå än för de övriga dellokalerna. Förekomsten av hybrider i Emån Övre innebär att samtliga estimat för denna lokal/population bör tolkas med extra försiktighet. Genetiskt ursprung för "udda" malar Med hjälp av programmet GENECLASS och så kallade assignment-test har det genetiska ursprunget analyserats för de 10 enskilda malar med udda ursprung eller historik som ingår i Tabell 6. Referenspopulationer vid analyserna har utgjorts av Båven, Emån Nedre, Emån Övre och Möckeln. Malen som fångades vid kusten i Bergkvara är med hög säkerhet klassad till Emån Nedre, och har sannolikt på egen hand vandrat ut ur Emån och simmat de cirka 10 milen söderut i Kalmarsund. Som tidigare nämnts passar de två gamla malarna från Emsfors och Finsjö (födda på 1940-talet) väl överens med dagens populationer från Emån Nedre respektive Övre. Däremot är deras respektive genotyper mycket osannolika i den andra populationen ("absoluta sannolikheter" <0.01 och 0.001; syns ej i Tabell 6). Sammantaget tyder detta på att en genetisk skillnad liknande den som observeras idag fanns redan tidigare i Emån. Vad gäller de förmodat illegalt utsatta malarna i Mälaren härstammar de fem individerna från Kolbäcksån (2004 och 2005) med hög sannolikhet från Emåns nedersta del, medan de två malarna från Strängnäs (1998) respektive Upplands-Bro (1999) klassas till Båven. Den senare 5 har dock en genotyp som, trots att den passar Båven bäst bland referenserna, är osannolik i denna population ("absolut sannolikhet"<0.001; Tabell 6); bland annat är individen homozygot 5 Denna mal, som dog i samband med fångsten vid Upplands-Bro i juli 1999, påträffades ursprungligen vid Nyköpingsåns mynning varifrån den transporterades till akvariet vid Fjäderholmarna i Stockholm. Det beslöts senare att den skulle återutsättas vid Nyköping. Så blev dock aldrig fallet. Efter närmare undersökningar erkändes att malen istället hade släppts i Mälaren. - 7 -

för en allel (259 i locus s7-e) som helt saknas bland de malar som hittills analyserats från såväl Båven, Emån och Möckeln. Möjligen rör det sig ändå om en gammal mal från Båven som vandrat ut i havet, men det kan också handla om en långvandrare från exempelvis Baltikum, där arten förekommer (men ännu ej är studerad genetiskt). Enstaka långvandrande malar har påträffats tidigare i Östersjön, kring Gotland samt vid Utö i Stockholms skärgård. Diskussion Denna studie har gett ett antal resultat som bör beaktas vid det fortsatta bevarandearbetet med mal i Sverige. Den största överraskningen är förekomsten av två genetiskt differentierade populationer i Emån. Studien har även visat att få individer står för reproduktionen och att de isolerade bestånden i Båven, Emån och Möckeln uppvisar jämförelsevis låg grad av genetisk variation. De svenska populationerna som lever i utkanten av utbredningsområdet utgör inte desto mindre viktiga delar av artens totala genetiska mångfald. Mal i Emån Den genetiska skillnad som påträffats mellan mal nedströms och uppströms i Emån är intressant och av betydelse för det fortsatta bevarandearbetet. Även om ett begränsat antal föräldrar under senare år kan ha resulterat i ökad differentiering mellan populationerna i Emån, tyder jämförelserna med DNA från gamla malar på att en tydlig genetisk skillnad fanns redan under 1940-talet (och därmed förmodligen tidigare än så). Förklaringen är sannolikt reproduktiv isolering. Gränsen mellan populationerna sammanfaller med den del av Emåns nedre lopp där fallhöjden är som störst (Figur 2) och malar tycks ha bristande förmåga till uppströms vandring (Nathanson & Calles, in prep.). I en situation där endast migration nedströms är möjlig förväntas den övre (isolerade) populationen med tiden förlora variation, bli genetiskt avvikande och anpassa sig till ett stationärt beteende (eftersom de individer som vandrar nedströms inte kommer tillbaka). Liknande observationer finns bland annat för olika laxfiskar (ex. Palm m.fl. 2003). Bland mal från övre delen av utbredningsområdet i Emån finns även ett påtagligt inslag av genetiskt avvikande malar (cirka 20%) som tycks kunna utgöra F1-hybrider med fisk nedströms ifrån (Tabell 4, Figur 7). Utifrån grova åldersskattningar tycks dessa vara födda i två omgångar dels kring mitten av 1990-talet samt cirka 10 år senare. Det kan handla om avkomma till de 10 småmalar som sattes ut ovanför Finsjö 1990, men förekomst av andra okända (illegala) omflyttningar inom Emån kan inte heller uteslutas. I Gåsgöl längre nedströms är inslaget av individer med "intermediära" genotyper ännu tydligare. Under 1999 flyttades 28 vuxna malar (31-70 cm) upp till denna lokal från området nedströms Emsfors, vilket kan förklara den höga andelen av förmodade hybrider. Det kan emellertid inte uteslutas att området kring Gåsgöl, som ligger mellan malens båda huvudområden, redan tidigare representerade en genetisk "blandpopulation". Större material från Gåsgöl (n=8 i denna studie) behövs för att undersöka dessa frågor närmare. Några nya fiskevårdande insatser i form av utsättningar/uppflyttingar av mal från nedre Emån till området Högsbyplatån-Finsjö bör inte genomföras utan tungt vägande skäl. Den lämpligaste strategin är istället att genomföra åtgärder för att förbättra miljön för mal, samtidigt som utvecklingen följs noga. En ökande andel hybrider förefaller inte otänkbart i takt med att uppflyttade föräldrafiskar med genetiskt ursprung nedströms växer sig större och ökar sin reproduktiva förmåga. En ytterligare möjlighet är att hybriderna i högre omfattning än övriga malar tenderar att söka sig nedströms och lämnar området för att inte komma tillbaka. Viss - 8 -

förekomst av hybrider kan också tänkas vara positivt genom att det reducerar eventuella inavelsproblem som annars kan bli resultatet i en liten population som grundats av få individer. Mal i Båven & Möckeln Det material som hittills analyserats från Båven är för litet för att medge några slutsatser om eventuella delpopulationer. I Möckelnområdet däremot finns små men statistisk säkra skillnader mellan malar från Agunnarydsån, Lilla Helgeå och Helgeå. Det är emellertid oklart om detta ska tolkas som förekomst av flera egentliga populationer. Ett alternativ är att skillnaderna snarare återspeglar jämförelser mellan ett begränsat antal familjegrupper. De låga skattningarna av antalet (genetisk effektiva) föräldrar per dellokal (Tabell 5), tillsammans med en icke slumpmässig geografisk fördelning inom de med COLONY relativt få rekonstruerade familjegrupperna, antyder att så kan vara fallet. På 1980-talet var förekomsten av mal i Möckeln dessutom koncentrerad kring Agunnarydsån (med vissa tecken på reproduktion vid Lilla Helgeå), och spridningen nedströms mot Helgeå har skett relativt nyligen. Populationsstorlekar Skattningarna baserade på genetiska data av antalet reproduktiva individer har försvårats av små stickprovsstorlekar och brist på goda åldersuppgifter, och resultaten bör tolkas försiktigt. Sammantaget verkar de ändå relativt överensstämmande med bedömningar från tidigare provfisken som visat att Emån (nedre) tycks vara den största populationen och Båven den minsta. De låga skattningarna av antalet genetisk effektiva föräldrar per år (N b ) tyder vidare på att samtliga populationer kan vara tillräckligt små genetiskt sett för att slumpmässig drift och inavel ska utgöra hot, även om sambandet mellan N b och dessa processer ännu inte är helt klarlagt för arter som mal, där generationerna överlappar och individerna kan reproducera sig flera gånger. Också ur ett rent demografiskt perspektiv utgör låga individantal ett hot, genom att populationer förväntas bli mer känsliga för enstaka händelser och katastrofer. Ökade populationsstorlekar framstår därför som en mycket viktig målsättning även fortsättningsvis. Genetisk övervakning Denna studie har visat att tillgång till genetiska data ger möjligheter att studera frågor som annars är svåra eller omöjliga att belysa. Det påbörjade arbetet med att studera svensk mal med hjälp av genetiska metoder bör fortsätta. Genetisk övervakning behövs för att följa utvecklingen i samtliga populationer vad gäller antalet individer och eventuella förluster av genetisk variation, samt för att identifiera illegala utsättningar. I första hand bör vävnadsprover tas i samband med provfisken där även annan information samlas in. Generellt bör all mal som infångas DNAprovtas, men ett särskilt fokus på små individer kan vara befogat då åldern hos dessa är lättare att bedöma. Erkännanden Vi tackar Helena Hörngren (Lst. Södermanland), Tobias Borger (Lst. Kalmar) och Olof Lessmark (Lst. Kronoberg) för hjälp med insamling av vävnadsprover och andra uppgifter. Tack också till Alex Triantafyllidis (Universitetet i Thessaloniki, Grekland) som vänligen har delat med sig av vävnadsprover, vilket möjliggjort direkta jämförelser med mal från övriga Europa. Studien har finansierats av Fiskeriverket och Naturvårdsverket, samt genom ett forskningsanslag från FORMAS (Foass-tjänst) till SP. - 9 -

Referenser Anderson EC, Thompson EA (2002) A model-based method for identifying species hybrids using multilocus genetic data. Genetics 160:1217 1229. Borger T, Kjellberg A (2006) Malprovfiske Emån 2006. Länsstyrelsen I Kalmar Län. Meddelande 2006:16. 10p. Cavalli-Sforza LL, Edwards AWF (1967) Phylogenetic analysis: models and estimation procedures. American Journal of Human Genetics 19:233-257. Felsenstein J (2004) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle. Goudet J (1995) FSTAT (vers. 1.2): a computer program to calculate F-statistics. Journal of Heredity 86:485 486. Kalinowski ST (2005) HP-RARE 1.0: a computer program for performing rarefaction on measures of allelic richness. Molecular Ecology Notes 5:187-189. Lessmark O (2007) Malprovfiske i Möckeln 2006. Länsstyrelsen i Kronobergs län. 13p. Nathanson JE (1986) Projektet malen - Slutrapport för åren 1982-86. Sveriges Sportfiske- och Fiskevårdsförbund, Stockholm. 34p. Nathanson JE (1995) Malens (Silurus glanis) reproduktions- och uppväxtplatser i Sverige samt förslag till åtgärder för dess överlevnad. Del 1. Information från Sötvattenslaboratoriet, Drottningholm. 41p. Nathanson JE (1998) Åtgärdsprogram för bevarande av mal. Fiskeriverket och Naturvårdsverket. 28p. Nathanson JE, Prestegaard T (2005) Släktskapsanalys och beståndsidentifiering av mal (Silurus glanis), en studie från nedre Helgeå. Fiskeriverkets Sötvattenslaboratorium. 6p. Palm S, Laikre L, Jorde PE, Ryman N (2003) Effective population size and temporal genetic change in stream resident brown trout (Salmo trutta, L.). Conservation Genetics 4:249 264. Piry S, Alapetite A, Cornuet JM, Paetkau D, Baudouin L, Estoup A (2004) GeneClass2: A Software for Genetic Assignment and First-Generation Migrant Detection. Journal of Heredity 95:536-539 Pritchard J, Stephens M, Donnelly P (2000) Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155:945 959. Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599. Triantafyllidis A, Krieg F, Cottin C, Abatzopoulos J, Triantaphyllidis C, Guyomard R (2002) Genetic structure and phylogeography of European catfish (Silurus glanis) populations. Molecular Ecology 11:1039 1055. Wang J (2004) Sibship reconstruction from genetic data with typing errors. Genetics 166:1963-1979. Waples RS (2006) A bias correction for estimates of effective population size based on linkage disequilibrium at unlinked gene loci. Conservation Genetics 7:167-184. Waples RS, Do C (in press) LDNE: A program for estimating effective population size from data on linkage disequilibrium. Molecular Ecology Notes. - 10 -

2 Båven 1 Emån 3 Möckeln - N Båven Båven 10 km 10 Km Högsby 8 6 5 Finsjö Karlshammar 3 2 Emsfors 1 2 7 Fliseryd Emån (nedre delen) 4 1 10 km 3 Möckeln Möckeln 10 10 km Km Figur 1. Vattensystem i Sverige med ursprungliga malbestånd. Inrutade delområden är för Båven: Lillsjön-Hornsundssjön/Kvarnsjön (1), Skarvnäsviken (2), Edebysjön (3), samt för Möckeln: Agunnarydsån (1), Lilla Helgeå (2), Helgeå (3). Namn för dellokalerna i Emån (1-8) ges i Figur 2 och Tabell 1. Observera att i Helgeå (Möckeln) är ett antal av malarna fångade längre nedströms än vad som markeras av det inrutade området (3).

Meter över havet +90 +80 +70 +60 +50 +40 +30 +20 +10 ± 0 HÖGSBY 8 7 6 FINSJÖ 5 1 Nedströms Emsfors (n=24) 2 Nedströms Karlshammar (n=15) 3 Uppströms Karlshammar (n=6) 4 Gåsgöl (n=8) 5 Finsjö (n=25) 6 Ryssängshöljan (n=1) 7 Fliserydsplatån (n=42) 8 Högsbyplatån (n=17) 4 KARLSHAMMAR 3 2 EMSFORS 1 HAVET 70 60 50 40 30 20 10 0 Kilometer från havet Figur 2. Fallhöjdsprofil över Emåns nedersta lopp med lokaler (1-8) där mal för genetisk analys samlats in. Från lokal 5 (Finsjö) har några individer insamlats strax uppströms den plats som är markerad.

200 180 160 140 Längd (cm) 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ålder (år) Figur 3. Tillväxtkurva baserad på längd- och åldersuppgifter för 20 malar från Emån (data från Nathanson 1986). Den tillpassade tillväxtfunktionen är av Von Bertalanffy-typ [L t = L max (L max L 0 ) e -kt ] med L max =300, L 0 =10 och k=0.018455.

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Förväntad heterozygositet (10 loci) VOL DDN SAK $Vod $Hey KIR $Gou $Hod PRU STN $Rus AXI IZN EVR ALI SEY Båven Emån Nedre Emån Övre Möckeln PIN MOR 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Medelantal alleler per locus (10 loci) DDN VOL $Vod EVR SAK STN AXI KIR $Gou $Hod ALI IZN PRU $Hey $Rus SEY Möckeln Emån Nedre Båven Emån Övre PIN MOR Figur 4. Genetisk variation hos mal skattat för samma uppsättning mikrosatelliter (förväntad heterozygositet och medelantal alleler). Populationer från Sverige (svarta staplar) och delar av övriga Europa (vita staplar=vilda, grå staplar=odlade). Rådata för de europeiska populationerna är från Triantafyllidis m.fl. (2002; Appendix I).

S6-95 S7-E Allel 216 212 208 204 200 196 192 188 184 180 176 172 168 164 160 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516171819202122 Allel 283 281 279 277 275 273 271 269 267 265 263 261 259 257 255 253 251 249 247 245 243 241 239 237 235 233 231 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516171819202122 Population Population S3-3 S3-10 Allel 163 161 159 157 155 153 151 149 147 145 143 141 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 Population Allel 143 141 139 137 135 133 131 129 127 125 123 121 119 117 115 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 Population S5-F S7-F Allel 150 148 146 144 142 140 138 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 Population Allel 238 236 234 232 230 228 226 224 222 220 218 216 214 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 Population Figur 5. Grafisk illustration (bubbeldiagram) av allelfrekvenser för 11 mikrosatellitmarkörer hos svenska (nr 19-22) och utländska (nr 1-18, varav 14-18 är odlade) malpopulationer. De svenska populationerna är Båven (19), Emån Nedre (20), Emån Övre (21) och Möckeln (22). Cirklarnas relativa storlek står i proportion till allelernas relativa frekvens. De allellängder som anges följer Triantafyllidis m.fl. (2002). För locus S3-81 finns endast data för de svenska populationerna. Figuren fortsätter på nästa sida.

S3-25 S1-40a Allel 250 248 246 244 242 240 238 236 234 232 230 228 226 224 222 220 218 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516171819202122 Population Allel 138 136 134 132 130 128 126 124 122 120 118 116 114 112 110 108 106 104 102 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516171819202122 Population S1-154a S7-159 Allel 353 351 349 347 345 343 341 339 337 335 333 331 329 327 325 323 321 319 317 315 313 311 309 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 Population Allel 275 273 271 269 267 265 263 261 259 257 255 253 251 249 247 245 243 241 239 237 235 233 231 229 227 225 223 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 Population S3-81 193 191 189 187 Allel 185 183 181 179 177 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 Population Figur 5. Fortsättning

$ Hey VOL $ Rus $ Hod $ Vod IZN $ Gou 98 DDN SAK STN PIN PRU 58 51 Emån Övre Emån Nedre 93 80 77 94 AXI ALI Möckeln Båven EVR KIR 0.1 MOR SEY Figur 6. Orotat Neighbor-Joining dendrogram över vilda och odlade ($) malpopulationer från Sverige (denna studie) och delar av övriga Europa (Triantafyllidis m.fl. 2002) baserat på Cavalli-Sforza & Edwards (1967) "chord distance" och 10 mikrosatelliter (jmf. Figur 5). Siffror indikerar nodernas tillförlitlighet i procent (Bootstrap-analys, 1000 itereringar; endast värden >50% är inritade). De vilda europeiska populationerna är från Grekland (STN, PIN, AXI, ALI, EVR), Rumänien (PRU, DDN), Ryssland (VOL), Turkiet (SAK, KIR, SEY, IZN) samt Schweiz (MOR). De odlade är från Frankrike ($Gou, $Hey), Tjeckien ($Vod, $Hod) och Rumänien ($Rus).

1.0 Högsbyp latån Fliserydsplatån Ryssäng shöljan Finsjö Gåsgöl Uppström s Karlsh ammar Nedströms Karlsh ammar Nedströms Emsfo rs 0.8 q 0.6 0.4 0.2 0.0 Figur 7. Grafisk representation av andelar gener från två populationer (q; mörka/ljusa staplar) hos enskilda malar i Emån, skattade med STRUCTURE. Varje stapel motsvarar genomet hos en individ. Fångstlokalerna är sorterade enligt åns flödesriktning (från vänster till höger; jmf. Figur 2).

1.25 1.00 0.75 Nedre Emsfors 1940-tal Finsjö 1940-tal Övre Övre F1 0.50 Faktor 2 (10%) 0.25 0.00-0.25-0.50-0.75-1.00-1.25-1.00-0.75-0.50-0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 Faktor 1 (29%) Figur 8. Faktoriell korrespondensanalys av mal från Emån: individer från dagens populationer nedströms (ofyllda romber) och uppströms (svarta kvadrater samt kryss, där kryss indikerar sannolika F1-hybrider; jmf. Tabell 4) jämförda med två äldre individer födda på 1940-talet som påträffats i nedre (Emsfors; gul triangel) respektive övre (Finsjö; gul cirkel) delen av ån.