cobas EGFR Mutation Test v2

cobas EGFR Mutation Test För in vitro-diagnostisk användning cobas DNA Sample Preparation Kit 24 test P/N: 05985536190 cobas cfdna Sample Preparation Kit 24 test P/N: 07247737190 cobas EGFR Mutation Test 24 test P/N: 07248563190

cobas EGFR Mutation Test INNEHÅLLSFÖRTECKNING cobas EGFR Mutation Test : Avsedd användning Sammanfattning och förklaring av testet Bakgrund... 5 Användningsprinciper... 7 Provberedning... 7 PCR-amplifiering... 7 AVSNITT A: ANVÄNDNING MED VÄVNADSPROVER Provberedning Material och reagens Material och reagens som tillhandahålls... 10 Förvaring och hantering av reagens... 12 Extramaterial som behövs... 13 Instrument och programvara som behövs men som inte medföljer... 13 Försiktighetsåtgärder och information om hantering Varningar och säkerhetsåtgärder... 14 God laboratoriesed... 14 Kontamination... 14 Integritet... 15 Avfallshantering... 15 Spill och rengöring... 15 Provtagning, transport och förvaring av prover... 15 Testprocedur Provtagning... 15 Förvaring och stabilitet för prover under transport... 15 Förvaring och stabilitet för bearbetade prover... 16 Körning av testet... 16 Bruksanvisning... 17 Procedur för DNA-isolering... 19 DNA-kvantifiering... 20 Amplifiering och detektion... 20 Förbereda instrumentet... 20 Förbereda testproceduren... 21 Förbereda instrumentet... 21 Beräkning av spädning av DNA-stamlösning från prov... 22 Provspädning... 23 Doc. Rev. 1.0 2

Resultat Reaktionsförberedelser... 23 Beredning av arbetsmastermixar (MMX-1, MMX-2 och MMX-3 )... 23 Förbereda plattan... 24 Starta PCR-körning... 24 Tolkning av resultat... 25 Omtestning av prover med ogiltiga resultat... 25 Kvalitetskontroll och giltighet för resultaten... 26 Mutant kontroll... 26 Negativ kontroll... 26 Testets begränsningar... 26 Icke-klinisk egenskapsutvärdering Analytisk sensitivitet blankprovsgräns... 27 Detektionsgräns med FFPET-provblandningar... 27 Lägsta tumörandel... 29 Specificitet mikroorganismer och EGFR-homologer... 30 Lungrelaterade mikroorganismer... 30 Plasmider med EGFR-homologer... 30 Interferens... 30 Nekrotisk vävnad... 30 Repeterbarhet... 30 Reproducerbarhet för provhantering... 31 Klinisk egenskapsutvärdering Studie av klinisk reproducerbarhet... 31 Korrelation till referensmetod med fas III-prover från EURTAC-studie... 32 Data för kliniskt utfall... 33 AVSNITT B: ANVÄNDNING MED PLASMAPROVER Provberedning Material och reagens Material och reagens som tillhandahålls... 36 Förvaring och hantering av reagens... 39 Extramaterial som behövs... 39 Instrument och programvara som behövs men som inte medföljer... 40 Försiktighetsåtgärder och information om hantering Varningar och säkerhetsåtgärder... 40 God laboratoriesed... 40 Kontamination... 41 cobas EGFR Mutation Test Doc. Rev. 1.0 3

cobas EGFR Mutation Test Integritet... 41 Avfallshantering... 41 Spill och rengöring... 41 Provtagning, transport och förvaring av prover... 42 Provtagning och provhantering... 42 Förvaring och stabilitet för prover under transport... 42 Förvaring och stabilitet för bearbetade prover... 42 Testprocedur Körning av testet... 43 Bruksanvisning... 43 Amplifiering och detektion... 46 Förbereda instrumentet... 47 Reaktionsförberedelser... 47 Förbereda plattan... 48 Starta PCR-körning... 49 Resultat Tolkning av resultat... 49 Semi-kvantitativt index (SQI)... 50 Omtestning av prover med ogiltiga resultat... 50 Kvalitetskontroll och giltighet för resultaten... 50 Mutant kontroll... 50 Negativ kontroll... 50 Testets begränsningar... 50 Icke-klinisk egenskapsutvärdering Detektionsgräns med cellinje-dna... 51 Korrelation till MiSeq med kliniska K2 EDTA-plasmaprover... 52 Linjäritet... 52 Repeterbarhet... 55 Ytterligare information Symboler... 56 Tillverkare och distributörer... 57 Varumärken och patent... 57 Copyright... 57 Referenser... 58 Revidering av dokumentet... 59 Doc. Rev. 1.0 4

cobas EGFR Mutation Test cobas EGFR Mutation Test : Avsedd användning cobas EGFR Mutation Test är ett realtids-pcr-test för kvalitativ detektion och identifiering av mutationer i exonerna 18, 19, 20 och 21 i EGFR-genen (epidermal tillväxtfaktorreceptor) i DNA från formalinfixerad paraffininbäddad (FFPET) tumörvävnad eller plasma från patienter med icke småcellig lungcancer (NSCLC). Testet är också avsett som hjälpmedel för att kunna välja ut patienter med NSCLC för behandling med en tyrosinkinashämmare (TKI) som har EGFR som mål. cobas EGFR Mutation Test för användning med plasma är därtill avsett för semi-kvantitativa mätningar av mutationer i exonerna 18, 19, 20 och 21 i EGFR-genen från seriella prover av human plasma som hjälpmedel vid behandling av NSCLC-cancerpatienter. FFPET-prover bearbetas med cobas DNA Sample Preparation Kit och plasmaprover bearbetas med cobas cfdna Sample Preparation Kit. cobas EGFR Mutation Test och analysinstrumentet cobas z 480 används tillsammans för automatisk amplifiering och detektion. Sammanfattning och förklaring av testet Bakgrund Aktiverande mutationer i genen som kodar för EGFR uppstår huvudsakligen i NSCLC, och resulterar i konstitutiv aktivering av kinasaktiviteten i EGFR-proteinet, vilket bidrar till den onkogena processen. 1 Prevalensen för de här mutationerna i icke utvalda fall av NSCLC är ungefär 10 30 %. 2, 3 De här mutationerna uppstår oftare, men inte uteslutande, hos kvinnliga patienter med asiatiskt ursprung som inte röker eller röker måttligt och som har fått diagnosen adenokarcinom vid histologi. 4 De vanligaste EGFR-mutationerna i NSCLC inkluderar olika deletioner i exon 19 och substitutionsmutationen L858R i exon 21; dessa mutationer utgör tillsammans ungefär 85 % av observerade EGFR-mutationer i NSCLC. 5 cobas EGFR Mutation Test (cobas EGFR Test) är en realtids-pcr-analys som är utformad för att detektera G719X-substitutionsmutationer i exon 18, deletionsmutationer i exon 19, T790M- och S768I-substitutionsmutationer i exon 20, insertionsmutationer i exon 20 samt L858R- och L861Q-substitutionsmutationer i exon 21. I Tabell 1 visas de EGFR-mutationer som detekteras av cobas EGFR Test. Doc. Rev. 1.0 5

cobas EGFR Mutation Test Tabell 1 cobas EGFR Test är utformat för att detektera följande mutationer Exon EGFR-mutationsgrupp EGFR-nukleinsyrasekvens COSMIC ID 6 Exon 18 Exon 19 Exon 20 Exon 21 G719X Ex19Del 2156G>C 6239 2155G>A 6252 2155G>T 6253 2240_2251del12 6210 2239_2247del9 6218 2238_2255del18 6220 2235_2249del15 6223 2236_2250del15 6225 2239_2253del15 6254 2239_2256del18 6255 2237_2254del18 12367 2240_2254del15 12369 2240_2257del18 12370 2239_2248TTAAGAGAAG>C 12382 2239_2251>C 12383 2237_2255>T 12384 2235_2255>AAT 12385 2237_2252>T 12386 2239_2258>CA 12387 2239_2256>CAA 12403 2237_2253>TTGCT 12416 2238_2252>GCA 12419 2238_2248>GC 12422 2237_2251del15 12678 2236_2253del18 12728 2235_2248>AATTC 13550 2235_2252>AAT 13551 2235_2251>AATTC 13552 2253_2276del24 13556 2237_2257>TCT 18427 2238_2252del15 23571 2233_2247del15 26038 S768I 2303G>T 6241 T790M 2369C>T 6240 2307_2308ins9GCCAGCGTG 12376 2319_2320insCAC 12377 Ex20Ins 2310_2311insGGT 12378 2311_2312ins9GCGTGGACA 13428 2309_2310AC>CCAGCGTGGAT 13558 L858R 2573T>G 6224 2573_2574TG>GT 12429 L861Q 2582T>A 6213 Doc. Rev. 1.0 6

cobas EGFR Mutation Test Användningsprinciper cobas EGFR Test baseras på två grundläggande processer: (1) manuell provberedning för att få fram DNA från FFPET eller plasma, och (2) PCR-amplifiering och detektion av mål-dna med hjälp av komplementära primerpar och oligonukleotidprober märkta med fluorokromer. cobas EGFR Test är utformat för att detektera följande mutationer: Exon 18: G719X (G719A, G719C och G719S) Exon 19: deletioner och komplexa mutationer Exon 20: S768I, T790M och insertioner Exon 21: L858R och L861Q Mutationsdetektion uppnås genom PCR-analys med analysinstrumentet cobas z 480. Både en mutant kontroll och en negativ kontroll ingår i varje körning för att bekräfta körningens giltighet. Provberedning cobas DNA Sample Preparation Kit och cobas cfdna Sample Preparation Kit är manuella provberedningar som baseras på nukleinsyrabindning till glasfiber. Nukleinsyrorna frigörs och det frigjorda DNA:t skyddas mot DNaser med hjälp av ett proteas och en kaotropisk lyserings-/bindningsbuffert. Därefter tillsätts isopropanol i lyseringsblandningen som sedan centrifugeras genom en kolonn med ett glasfiberfilter. Under centrifugeringen binds DNA till glasfiberfiltrets yta. Obundna ämnen, t.ex. salter, proteiner och andra cellulära föroreningar tas bort genom centrifugering. De adsorberade nukleinsyrorna tvättas och elueras sedan med en vattenbaserad lösning. Mål-DNA amplifieras och detekteras sedan med analysinstrumentet cobas z 480 med hjälp av de amplifierings- och detektionsreagens som medföljer i cobas EGFR Mutation Test -kitet. PCR-amplifiering Val av målsekvens cobas EGFR Test använder primers som definierar specifika basparssekvenser för var och en av målmutationerna. För G719X-substitutionsmutationen i exon 18 amplifieras målsekvenser som är 104 106 baspar långa; för deletionsmutationer i exon 19 amplifieras målsekvenser som är 125 141 baspar långa; för S768I-substitutionsmutationen i exon 20 amplifieras en 133 baspar lång målsekvens; för T790M-substitutionsmutationen i exon 20 amplifieras en 118 baspar lång målsekvens; för insertionsmutationer i exon 20 amplifieras målsekvenser som är 125 143 baspar långa; för L858R-substitutionsmutationen i exon 21 amplifieras en 138 baspar lång målsekvens; för L861Q-substitutionsmutationen i exon 21 amplifieras en 129 baspar lång målsekvens. Hela EGFR-genen amplifieras inte utan endast sekvenserna mellan de specifika primrarna. Målsekvensamplifiering Ett derivat av Thermus-arter Z05-AS1 DNA-polymeras används för målsekvensamplifiering. Först värms PCRblandningen så att det genomiska DNA:t denatureras och primrarnas målsekvenser exponeras. När blandningen svalnar binder uppströms- och nedströmsprimers till mål-dna-sekvenserna. Z05 DNA-polymeras, i närvaro av divalenta metallkatjoner och överskott av dntp, förlänger varje bunden primer och syntetiserar därmed en andra DNA-sträng. Detta slutför den första PCR-cykeln och ger en dubbelsträngad DNA-kopia som innehåller de basparsregioner av EGFRgenen som var målet. Proceduren upprepas i cykler, där varje cykel effektivt fördubblar mängden amplikon-dna. Doc. Rev. 1.0 7

cobas EGFR Mutation Test Automatiserad mutationsdetektion i realtid I cobas EGFR Test används realtids-pcr-teknik. Varje målspecifik oligonukleotidprob i reaktionen är märkt med en fluorokrom som fungerar som reporterfluorokrom, och med en quenchermolekyl som absorberar (släcker) den fluorescerande emissionen från reporterfluorokromen i en intakt prob. Under varje amplifieringscykel binder prober som är komplementära till den enkelsträngade DNA-sekvensen i amplikon och klyvs sedan av 5' till 3'-nukleasaktiviteten i Z05- AS1 DNA-polymeras. När reporterfluorokromen har separerats från quenchern genom denna nukleasaktivitet kan fluorescens med en specifik våglängd mätas när reporterfluorokromen exciteras av rätt ljusspektrum. Fyra olika reporterfluorokromer används för att märka de mutationer som var målet i testet. Amplifiering av de sju mål-egfrsekvenserna detekteras oberoende av varandra i de tre reaktionerna genom att mäta fluorescensen vid de fyra specifika våglängderna i dedikerade optiska kanaler. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av mål-nukleinsyra från provet kan göras med cobas EGFR Test genom användning av AmpErase (uracil-n-glykosylas) och deoxiuridintrifosfat (dutp). 7 AmpErase-enzymet känner igen och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin, men inte DNA som innehåller tymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA, men alltid i amplikon på grund av användningen av dutp i stället för deoxitymidintrifosfat som en av nukleotiodtrifosfaterna i Master Mix-reagens. Följaktligen innehåller endast amplikon deoxiuridin. Deoxiuridin gör kontaminerande amplikon känsligt för nedbrytning av AmpErase-enzym före DNA-amplifieringen. AmpErase-enzymet, som ingår i Master Mix-reagens, katalyserar klyvning av DNA innehållande deoxiuridin vid deoxiuridinresterna genom att öppna deoxiriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmning i det första termocyklingssteget vid alkaliskt ph bryts amplikon-dna-kedjan vid deoxiuridinets position vilket ger icke amplifierbart DNA. AmpErase-enzymet är inaktivt vid temperaturer över 55 C, dvs. genom alla termocyklingssteg. Därför förstörs inte nybildade amplikon. cobas EGFR Test har visat sig inaktivera EGFR-mutant amplikon innehållande deoxiuridin. Doc. Rev. 1.0 8

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test FÖLJ INSTRUKTIONERNA I AVSNITT A FÖR ANVÄNDNING MED VÄVNADSPROVER. FÖLJ INSTRUKTIONERNA I AVSNITT B FÖR ANVÄNDNING MED PLASMAPROVER. AVSNITT A: ANVÄNDNING MED VÄVNADSPROVER Provberedning FFPET-prover bearbetas och genomiskt DNA isoleras med cobas DNA Sample Preparation Kit, en manuell provberedning baserad på nukleinsyrabindning till glasfiber. Ett avparaffinerat 5 µm-snitt av ett FFPET-prov lyseras genom inkubering i förhöjd temperatur med ett proteas och en kaotropisk lyserings-/bindningsbuffert som frigör nukleinsyror och skyddar det frigjorda genomiska DNA:t mot DNaser. Därefter tillsätts isopropanol i lyseringsblandningen som sedan centrifugeras genom en kolonn med ett glasfiberfilter. Under centrifugeringen binds genomiskt DNA till glasfiberfiltrets yta. Obundna ämnen, t.ex. salter, proteiner och andra cellulära föroreningar tas bort genom centrifugering. De adsorberade nukleinsyrorna tvättas och elueras sedan med en vattenbaserad lösning. Mängden genomiskt DNA bestäms spektrofotometriskt och justeras till en fastställd koncentration som ska tillsättas i amplifierings-/detektionsblandningen. Mål-DNA amplifieras och detekteras sedan med analysinstrumentet cobas z 480 med hjälp av de amplifierings- och detektionsreagens som medföljer i cobas EGFR Mutation Test -kitet. Doc. Rev. 1.0 9

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Material och reagens Material och reagens som tillhandahålls Kit/kassetter cobas DNA Sample Preparation Kit 24 test (P/N: 05985536190) Komponenter och reagensingredienser DNA TLB (DNA-vävnadslyseringsbuffert) (P/N: 05517613001) Tris-HCl-buffert Kaliumklorid 0,04 % EDTA 0,1 % Triton X-100 0,09 % natriumazid PK (Proteinas K) (P/N: 05860695102) Proteinas K, frystorkat DNA PBB (DNA-paraffinbindningsbuffert) (P/N: 05517621001) Tris-HCl-buffert 49,6 % guanidinhydroklorid 0,05 % urea 17,3 % Triton X-100 WB I (DNA-tvättbuffert I) (P/N: 05517656001) Tris-HCl-buffert 64 % guanidinhydroklorid WB II (DNA-tvättbuffert II) (P/N: 05517664001) Tris-HCl-buffert Natriumklorid DNA EB (DNA-elueringsbuffert) (P/N: 05517630001) Tris-HCl-buffert 0,09 % natriumazid FT (filterrör med lock) (P/N: 05089506102) CT (uppsamlingsrör) (P/N: 05880513001) Mängd per test Säkerhetssymbol och varning a 1 x 10 ml Fara H302 + H332: Skadligt vid förtäring eller vid inandning. H315: Irriterar huden. H317: Kan orsaka allergisk hudreaktion. H318: Orsakar allvarliga ögonskador. 1 x 100 mg H334: Kan orsaka allergi- eller astmasymtom eller andningssvårigheter vid inandning. H335: Kan orsaka irritation i luftvägarna. P261: Undvik att inandas damm/rök/ 1 x 10 ml gaser/dimma/ångor/sprej. P280: Använd skyddshandskar/ ögonskydd/ansiktsskydd. P284: Använd andningsskydd. P305 + P351 + P338 + P310: VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj 1 x 25 ml försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. P342 + P311: Vid besvär i luftvägarna: 1 x 12,5 ml Kontakta GIFTINFORMATIONS- CENTRALEN/läkare. P362 + P364: Nedstänkta kläder tas av och tvättas innan de används igen. 1 x 6 ml 1 x 25-pack 3 x 25-pack Doc. Rev. 1.0 10

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Kit/kassetter cobas EGFR Mutation Test 24 test (P/N: 07248563190) Komponenter och reagensingredienser EGFR MMX-1 (EGFR Master Mix 1) (P/N 06471366001) Trisbuffert Kaliumklorid Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoxid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntps < 0,01 % Z05-AS1 DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,01 % AmpErase-enzym (uracil-nglykosylas) (mikrobiellt) < 0,01 % aptamer < 0,01 % uppströms- och nedströms- EGFR-primers < 0,01 % fluorescensmärkta EGFR-prober EGFR MMX-2 (EGFR Master Mix 2) (P/N 06471382001) Trisbuffert Kaliumklorid Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoxid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntps < 0,01 % Z05-AS1 DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,01 % AmpErase-enzym (uracil-nglykosylas) (mikrobiellt) < 0,01 % aptamer < 0,01 % uppströms- och nedströms- EGFR-primers < 0,01 % fluorescensmärkta EGFR-prober EGFR MMX-3 (EGFR Master Mix 3) (P/N 07248610001) Trisbuffert Kaliumklorid Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoxid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntps < 0,01 % Z05-AS1 DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,01 % AmpErase-enzym (uracil-nglykosylas) (mikrobiellt) < 0,01 % aptamer < 0,01 % uppströms- och nedströms- EGFR-primers < 0,01 % fluorescensmärkta EGFR-prober Mängd per test 2 x 0,48 ml 2 x 0,48 ml 2 x 0,48 ml Säkerhetssymbol och varning a N/A N/A N/A Doc. Rev. 1.0 11

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Kit/kassetter cobas EGFR Mutation Test 24 test (P/N: 07248563190) Komponenter och reagensingredienser MGAC (magnesiumacetat) (P/N 05854326001) Magnesiumacetat 0,09 % natriumazid EGFR MC (EGFR-mutationskontroll) (P/N 06471455001) Trisbuffert EDTA Poly-rA RNA (syntetiskt) 0,05 % natriumazid < 0,1 % plasmid-dna med EGFRsekvenser (exon 18, 19, 20 och 21, mikrobiellt) < 0,1 % EGFR vildtyp-dna (cellodling) DNA SD (DNA-spädningsbuffert) (P/N 05854474001) Tris-HCl-buffert 0,09 % natriumazid a Produktsäkerhetsmärkningen följer huvudsakligen EU:s GHS-system Mängd per test 6 x 0,2 ml 6 x 0,1 ml 2 x 3,5 ml Säkerhetssymbol och varning a N/A N/A N/A Förvaring och hantering av reagens Reagens Förvaringstemperatur cobas DNA Sample Preparation Kit* 15 C till 30 C cobas EGFR Mutation Test ** 2 C till 8 C Med undantag för reagenset PK ska reagens inte frysas. Förvaringstid I öppnad förpackning är hållbarheten upp till 8 användningstillfällen under 90 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. I öppnad förpackning är hållbarheten 4 användningstillfällen under 90 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. * Efter tillsats av sterilt, nukleasfritt vatten i PK ska oanvänt rekonstituerat PK förvaras i portioner om 450 µl i 20 C. Efter rekonstituering måste PK användas inom 90 dagar, dock före angivet utgångsdatum. Efter tillsats av absolut etanol ska WB I och WB II förvaras i 15 C till 30 C. Dessa arbetslösningar är hållbara i 90 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. ** EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 och arbets-mmx (beredda genom tillsats av MGAC i EGFR MMX-1 eller EGFR MMX-2 eller EGFR MMX-3 ) ska skyddas mot långvarig exponering för ljus. Arbets-MMX måste förvaras mörkt i 2 C till 8 C. De beredda proverna och kontrollerna måste tillsättas inom 1 timme efter beredning av arbets-mmx. Amplifieringen ska startas inom 1 timme efter att de bearbetade proverna och kontrollerna tillsatts i arbets-mmx. Doc. Rev. 1.0 12

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Extramaterial som behövs Material P/N Xylene (ACS, > 98,5 % xylen) Absolut etanol (200 proof, för molekylärbiologi) Isopropanol (ACS, > 99,5 %) Sterilt nukleasfritt vatten (för molekylärbiologi) Blekmedel Valfri produkttillverkare Sigma E7023 eller Fisher Scientific BP2818-500 eller motsvarande Sigma 190764 eller Fisher Scientific A451-1 eller motsvarande Applied Biosystems (Ambion) AM9937 eller GE Healthcare Hyclone TM SH3053801 eller motsvarande Valfri produkttillverkare 70 % etanol Valfri produkttillverkare Sterila serologiska engångspipetter om 5 och 25 ml Mikrotiterplatta (AD-platta) och skyddsfilm för cobas 4800- systemet Skyddsfilmapplikator för cobas 4800-systemet (medföljer vid installation av cobas 4800-systemet) Justerbara pipetter* (kapacitet 5 1 000 µl) DNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning Pipet-Aid TM * Bänkmikrocentrifug* (kapacitet för 20 000 x g) Två värmeblock med kapacitet att värma mikrocentrifugrör till 56 C och 90 C* Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör (1,5ml sterila, RNase/DNase-fria, PCR-grad) Mikrocentrifug-rörrack Spektrofotometer för mätning av DNA-koncentrationen* Vortexblandare* Engångshandskar, puderfria Kalibrerade termometrar för värmeblock* Vattenbad* som kan hålla en temperatur på 37 C Enkeleggat skalpellblad eller liknande * All utrustning ska hanteras enligt tillverkarens instruktioner. Valfri produkttillverkare Roche 05232724001 Roche 04900383001 Valfri produkttillverkare Valfri produkttillverkare Drummond 4-000-100 eller motsvarande Eppendorf 5430 eller 5430R eller motsvarande Valfri produkttillverkare Eppendorf 022363204 eller motsvarande Valfri produkttillverkare Valfri produkttillverkare Valfri produkttillverkare Valfri produkttillverkare Valfri produkttillverkare Valfri produkttillverkare Valfri produkttillverkare Kontakta Roche kundsupport om du vill ha mer information om material som säljs separat. Instrument och programvara som behövs men som inte medföljer Instrument och programvara som behövs men som inte medföljer Analysinstrumentet cobas z 480 Kontrollenhet till cobas 4800-systemet med systemprogramversion 2.1 eller högre Programmet EGFR Tissue Analysis Package version 1.0 eller högre Streckkodsläsare ext. USB-anslutning Skrivare (till exempel HP P2055d) Kontakta Roche kundsupport om du vill ha mer information om material som säljs separat. Doc. Rev. 1.0 13

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Försiktighetsåtgärder och information om hantering Varningar och säkerhetsåtgärder Liksom för alla testmetoder är det mycket viktigt att använda god laboratoriesed för att denna analys ska fungera korrekt. Endast för in vitro-diagnostisk användning. Säkerhetsdatablad (SDS) erhålls på begäran hos närmaste Roche-kontor. Detta test är avsett att användas med FFPET NSCLC-prover. Prover ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner, exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 8 och i CLSI-dokumentet M29-A4. 9 DNA PBB och DNA TLB innehåller Triton X-100 som är irriterande för slemhinnor. Undvik kontakt med ögon, hud och slemhinnor. Xylen är en farlig kemikalie som ska användas i dragskåp. Kassera den som kemiskt avfall enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. Användning av sterila engångspipetter och DNase-fria pipettspetsar rekommenderas. God laboratoriesed Pipettera inte med munnen. Ät, drick eller rök inte i laboratoriet. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och kitets reagenser. Använd engångshandskar, laboratorierock och skyddsglasögon vid hantering av reagens. Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Om spill förekommer, späd med vatten innan spillet torkas upp. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor i laboratoriet med en nyberedd lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i destillerat eller avjoniserat vatten (hushållsblekmedel utspätt 1:10). Torka därefter av ytan med 70-procentig etanol. Kontamination Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. Handskar ska användas och ska bytas mellan hantering av prover och cobas EGFR Test-reagens för att undvika kontamination. Undvik att förorena handskarna när du hanterar prover. Handskar ska bytas ofta för att minska risken för kontamination. Handskar ska bytas innan DNA-isoleringsutrymmen lämnas, eller om kontakt med lösningar eller ett prov misstänks. Undvik mikrobiell kontamination och ribonukleaskontamination av reagens. Arbetsområdet för amplifiering och detektion ska rengöras ordentligt innan beredning av arbets-mmx. Förbrukningsmaterial och utrustning ska speciellt tilldelas varje aktivitet och får inte användas för andra aktiviteter eller flyttas mellan områden. Exempelvis så ska pipetter och förbrukningsmaterial som använts för DNA-isolering inte användas till att bereda reagens för amplifiering och detektion. Vi rekommenderar starkt att arbetsgången i laboratoriet sker i en enda riktning, så att en aktivitet slutförs innan nästa aktivitet påbörjas. Till exempel ska DNA-isolering slutföras innan amplifiering och detektion påbörjas. DNA-isolering ska utföras i ett utrymme som är separerat från amplifiering och detektion. För att undvika kontamination av arbetsmastermix med DNA-prover ska utrymmet där amplifiering och detektion skett rengöras noggrant innan arbetsmastermix bereds. Doc. Rev. 1.0 14

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Integritet Använd inte kit efter utgångsdatum. Blanda inte reagens från olika kit eller loter. Använd inte engångsartiklar efter utgångsdatum. Alla engångsartiklar är avsedda att användas en gång. Återanvänd dem inte. All utrustning ska hanteras enligt tillverkarens instruktioner. Avfallshantering DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3, EGFR MC och DNA SD innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket kallt vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. Kassera oanvända reagens och avfall enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. Spill och rengöring DNA PBB och WB I innehåller guanidinhydroklorid. Utspilld vätska som innehåller den här bufferten torkas upp med lämplig laboratoriedetergent och vatten. Om spill med potentiellt smittbärande agens förekommer ska det aktuella området först rengöras med laboratoriedetergent och vatten, och därefter med 0,5 % natriumhypoklorit. Om spill förekommer på instrumentet cobas 4800 ska anvisningarna i motsvarande systemhandbok till cobas 4800-systemet följas vid rengöringen. Använd inte natriumhypokloritlösning (blekmedel) vid rengöring av analysinstrumentet cobas z 480. Rengör analysinstrumentet cobas z 480 enligt anvisningarna i motsvarande systemhandbok till cobas 4800-systemet. Ytterligare varningar, försiktighetsåtgärder och procedurer för att minska kontaminationsrisken för analysinstrumentet cobas z 480 finns i instrumenthandboken till analysinstrumentet cobas z 480. Provtagning, transport och förvaring av prover Hantera alla prover som potentiellt smittbärande. Provtagning NSCLC FFPET-prover har validerats för användning med cobas EGFR Test. Förvaring och stabilitet för prover under transport NSCLC FFPET-prover kan transporteras i 15 C till 30 C. Vid transport av FFPET-prover ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas. 10 Hållbarhet har bekräftats för FFPET-prover som förvaras i 15 C till 30 C i upp till 12 månader efter provtagning. Snitt på 5 µm som placeras på objektglas kan förvaras i 15 C till 30 C i upp till 60 dagar. Doc. Rev. 1.0 15

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Förvaring och stabilitet för bearbetade prover Bearbetade prover (extraherat DNA) är stabila i: Förvaringstemperatur för extraherat DNA 15 C till 25 C 2 C till 8 C 15 C till 30 C Förvaringstid Upp till 3 frys-tiningscykler under 60 dagar Upp till 14 dagar Upp till 1 dag Extraherat DNA ska användas inom den rekommenderade förvaringstiden, dock innan utgångsdatum för det cobas DNA Sample Preparation Kit som användes för att extrahera DNA. Testprocedur Körning av testet Bild 1 cobas EGFR Mutation Test : arbetsgång med cobas DNA Sample Preparation Kit 1 Starta systemet 2 Utför underhåll av instrumentet 3 Ta ut prover och reagens från förvaringen 4 Avparaffinera proverna 5 Utför DNA-isolering 6 Eluera DNA 7 Skapa arbetsbeställning och skriv ut plattlayout 8 Bered amplifieringsreagens 9 Ladda mikrotiterplattan med amplifieringsreagens 10 Ladda mikrotiterplattan med prov 11 Försegla mikrotiterplattan 12 Ladda mikrotiterplattan i analysinstrumentet cobas z 480 13 Starta körningen 14 Granska resultat 15 Med LIS: skicka resultaten till LIS 16 Mata ut mikrotiterplattan ur analysinstrumentet Doc. Rev. 1.0 16

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Bruksanvisning Endast NSCLC FFPET-snitt med 5 µm tjocklek där minst 10 % av arean utgörs av tumör får användas i cobas EGFR Test. Alla prover där mindre än 10 % av arean utgörs av tumör ska makrodissekeras efter att de avparaffinerats. I instrumenthandboken till analysinstrumentet cobas z 480 finns detaljerad information om användning av analysinstrumentet cobas z 480. Värmeblock med kapacitet att värma Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör ska slås på och ställas in på 56 C och 90 C. Körningsstorlek En och samma körning kan innehålla från 1 till 30 prover (plus kontroller) per mikrotiterplatta med 96 brunnar. Vid körning av mer än 24 prover måste flera cobas EGFR Test-kit användas. cobas EGFR Test innehåller reagens som räcker till totalt 8 körningar av 3 prover (plus kontroller), vilket ger maximalt 24 prover per kit. Reagensberedning Bered arbetsreagens på det sätt som visas nedan innan kitet används första gången. Fördela vattnet med en serologisk 5 ml engångspipett. Fördela etanolen med serologiska 25 ml engångspipetter. Om proteinas K redan har rekonstituerats och frusits, tina ett tillräckligt antal portioner för att bearbeta det antal prover som ska köras. Reagens Proteinas K (PK) Tvättbuffert I (WB I) Tvättbuffert II (WB II) Rekonstituering/beredning Rekonstituera proteinas K (PK) genom att tillsätta 4,5 ml sterilt, nukleasfritt (PCR-grad) vatten i flaskan med hjälp av en steril, serologisk 5 ml engångspipett. Blanda genom att vända flaskan 5 till 10 gånger. Fördela 450 µl rekonstituerat PK i 1,5 ml Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör och förvara i 20 C i upp till 90 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. Om proteinas K redan har rekonstituerats och frusits, tina ett tillräckligt antal portioner för att bearbeta det antal prover som ska köras innan avparaffinering (70 µl rekonstituerat PK behövs till varje prov). Bered arbets-wb I genom att tillsätta 15 ml absolut etanol i flaskan med WB I. Blanda genom att vända flaskan 5 till 10 gånger. Gör en anteckning på flaskan om att etanol har tillsatts och vilket datum det gjordes. Förvara arbets-wb I i 15 C till 30 C i upp till 90 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. Bered arbets-wb II genom att tillsätta 50 ml absolut etanol i flaskan med WB II. Blanda genom att vända flaskan 5 till 10 gånger. Gör en anteckning på flaskan om att etanol har tillsatts och vilket datum det gjordes. Förvara arbets-wb II i 15 C till 30 C i upp till 90 dagar, dock längst till angivet utgångsdatum. Alla lösningar som förvaras i 15 C till 30 C ska vara klara. Om det finns fällning i något reagens, värm lösningen i ett 37-gradigt vattenbad tills fällningen löses upp. Använd inte lösningen förrän all fällning har lösts upp. Avparaffinering av FFPET-snitt på objektglas Xylen är en farlig kemikalie. Alla steg i avparaffineringen ska utföras i ett dragskåp. Se Varningar och säkerhetsåtgärder. Om mindre än 10 % av provets area utgörs av tumör måste snittet makrodissekeras. 1. Placera ett objektglas med ett 5 µm FFPET-snitt i en behållare med så mycket xylen att det täcker vävnaden. Låt stå i 5 minuter. 2. Överför objektglaset till en behållare med så mycket absolut etanol att det täcker vävnaden och låt stå i 5 minuter. 3. Ta ut objektglaset från etanolen och låt snittet lufttorka så att det är helt torrt (5 till 10 minuter). Doc. Rev. 1.0 17

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test 4. Makrodissekera om mindre än 10 % av provets area utgörs av tumör. 5. Märk ett 1,5 ml Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör för varje prov med prov-id. 6. Tillsätt 180 µl DNA TLB i 1,5 ml Safe-Lock TM -mikrocentrifugröret. 7. Tillsätt 70 µl rekonstituerat PK i Safe-Lock TM -mikrocentrifugröret som innehåller DNA TLB. 8. Skrapa bort vävnaden från objektglaset och ned i Safe-Lock TM -mikrocentrifugröret. Sänk ned vävnaden i DNA TLB/PK-blandningen. 9. Fortsätt med steg 1 i proceduren för DNA-isolering. Avparaffinering av FFPET-snitt som inte är på objektglas Xylen är en farlig kemikalie. Alla steg i avparaffineringen ska utföras i ett dragskåp. Se Varningar och säkerhetsåtgärder. Om mindre än 10 % av provets area utgörs av tumör måste snittet läggas på objektglas och makrodissekeras, och proceduren som beskrivs i Avparaffinering av FFPET-snitt på objektglas måste följas. 1. Placera ett FFPET-snitt med 5 µm tjocklek i ett 1,5 ml Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör märkt med prov-id. 2. Tillsätt 500 µl xylen i Safe-Lock TM -mikrocentrifugröret med FFPET-snittet. 3. Blanda väl genom att vortexa i 10 sekunder. 4. Låt röret stå i 5 minuter i 15 C till 30 C. 5. Tilllsätt 500 µl absolut etanol och blanda genom att vortexa i 10 sekunder. 6. Låt röret stå i 5 minuter i 15 C till 30 C. 7. Centrifugera vid 16 000 x g till 20 000 x g i 2 minuter. Ta bort supernatanten utan att röra pelleten. Kassera supernatanten som kemiskt avfall. 8. Tillsätt 1 ml absolut etanol och vortexa i 10 sekunder. 9. Centrifugera vid 16 000 x g till 20 000 x g i 2 minuter. Ta bort supernatanten utan att röra pelleten. Kassera supernatanten som kemiskt avfall. 10. Om pelleten flyter i den återstående supernatanten, centrifugera igen i 1 minut vid 16 000 x g till 20 000 x g. Ta bort all återstående supernatant. 11. Torka vävnadspelleten i 10 minuter i 56 C i ett värmeblock med röret öppet. 12. Kontrollera att etanolen har avdunstat fullständigt och att pelleten är torr innan du fortsätter med nästa steg. 13. Om det behövs kan torra pelletar förvaras upp till 24 timmar i 2 C till 8 C. 14. Resuspendera vävnadspelleten i 180 µl DNA-vävnadslyseringsbuffert (DNA TLB). 15. Tillsätt 70 µl rekonstituerad PK. 16. Fortsätt med steg 1 i proceduren för DNA-isolering. Doc. Rev. 1.0 18

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Procedur för DNA-isolering Bearbeta en negativ kontroll samtidigt med provet/proverna. Bered den negativa kontrollen genom att kombinera 180 µl DNA-vävnadslyseringsbuffert (DNA TLB) och 70 µl PK-lösning i ett 1,5 ml Safe-Lock TM - mikrocentrifugrör märkt med NEG. Den negativa kontrollen ska bearbetas enligt samma procedur som proverna. 1. Vortexa rören med provet/dna TLB/PK-blandningen och negativ kontroll-blandningen (NEG) i 30 sekunder. Vävnaden måste vara helt nedsänkt i DNA TLB/PK-blandningen. 2. Placera rören i värmeblocket med 56 C och inkubera i 60 minuter. 3. Vortexa rören i 10 sekunder. Vävnaden måste vara helt nedsänkt i DNA TLB/PK-blandningen. 4. Placera rören i värmeblocket med 90 C och inkubera i 60 minuter. Förbered tillräckligt antal filterrör (FT-rör) med gångjärnsförsedda lock under inkuberingen genom att placera FT-röret på ett uppsamlingsrör (CT-rör) och märka varje FT-lock med aktuell prov- eller kontrollidentifiering. För varje prov behövs 1 FT-rör, 3 CT-rör och 1 elueringsrör (1,5 ml Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör). Under inkuberingen ska tillräckligt antal elueringsrör (1,5 ml mikrocentrifugrör) märkas med aktuell proveller kontrollidentifiering. 5. Låt rören svalna till 15 C till 30 C. När de har svalnat, pulscentrifugera rören för att samla upp vätska från locken. 6. Tillsätt 200 µl DNA PBB i varje rör och blanda genom att pipettera upp och ned 3 gånger. 7. Inkubera rören i 15 C till 30 C i 10 minuter. 8. Tillsätt 100 µl isopropanol i varje rör och blanda lysatet genom att pipettera upp och ned 3 gånger. 9. Överför alla lysat till respektive märkt FT/CT-rör. 10. Centrifugera FT/CT-rören vid 8 000 x g i 1 minut. 11. Placera varje FT-rör på ett nytt CT-rör. Kassera kvarvarande vätska i det gamla CT-röret som kemiskt avfall och avfallshantera det använda CT-röret enligt gällande föreskrifter. 12. Tillsätt 500 µl arbets-wb I i varje FT-rör. Beredning av arbets-wb I beskrivs i avsnittet Reagensberedning. 13. Centrifugera FT/CT-rören vid 8 000 x g i 1 minut. 14. Kassera kvarvarande vätska i varje CT-rör som kemiskt avfall. Sätt tillbaka FT-röret i samma CT-rör. 15. Tillsätt 500 µl arbets-wb II i varje FT-rör. Beredning av arbets-wb II beskrivs i avsnittet Reagensberedning. 16. Centrifugera FT/CT-rören vid 8 000 x g i 1 minut. 17. Placera varje FT-rör på ett nytt CT-rör. Kassera kvarvarande vätska i det gamla CT-röret som kemiskt avfall och avfallshantera det använda CT-röret enligt gällande föreskrifter. 18. Centrifugera FT/CT-rören vid 16 000 till 20 000 x g i 1 minut för att torka filtermembranen. 19. Placera varje FT-rör i ett elueringsrör (1,5 ml mikrocentrifugrör) märkt med prov- eller kontrollidentifiering. Kassera kvarvarande vätska i det använda CT-röret som kemiskt avfall och avfallshantera det använda CT-röret enligt gällande föreskrifter. 20. Tillsätt 100 µl DNA EB i mitten av varje FT-membran utan att vidröra FT-membranet. 21. Inkubera FT-röret med elueringsröret i 15 C till 30 C i 5 minuter. 22. Centrifugera FT-röret med elueringsröret vid 8 000 x g i 1 minut för att samla eluat i elueringsröret. Avfallshantera det använda FT-röret enligt gällande föreskrifter. Doc. Rev. 1.0 19

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test 23. Stäng locket på elueringsröret. Elueringsröret innehåller DNA-stamlösningen. Fortsätt med steg 1 i avsnittet DNAkvantifiering. Mätning av DNA-koncentration ska utföras omedelbart efter DNA-isoleringsproceduren och innan förvaring. DNA-kvantifiering 1. Blanda varje DNA-stamlösning genom att vortexa i 5 sekunder. 2. Kvantifiera DNA med en spektrofotometer enligt tillverkarens instruktioner. Använd DNA EB som blankprov för instrumentet. Ett genomsnitt av två konsekventa avläsningar behövs. De två mätningarna ska ligga inom ± 10 % av varandra när avläsningarna av DNA-koncentrationen är > 20,0 ng/µl. Vid DNA-koncentrationsavläsningar < 20,0 ng/µl ska de två mätningarna ligga inom ± 2 ng/µl. Om de två mätningarna inte ligger inom ± 10 % av varandra när den avlästa DNA-koncentrationen är > 20,0 ng/µl eller inom ± 2 ng/µl när avläsningarna av DNAkoncentrationen är < 20,0 ng/µl måste två ytterligare avläsningar utföras tills kraven har uppfyllts. Medelvärdet av de två nya mätningarna ska sedan beräknas. DNA-stamlösningen från den bearbetade negativa kontrollen (NEG CT) behöver inte mätas. 3. DNA-stamlösningskoncentrationen från proverna måste vara > 2 ng/µl för att cobas EGFR Test ska kunna utföras. Tre amplifieringar/detektioner körs per prov, där 25 µl av en spädning med DNA-stamlösning med 2 ng/µl (totalt 50 ng DNA) används för varje amplifiering/detektion. Varje DNA-stamlösning måste ha en minimikoncentration på 2 ng/µl för att cobas EGFR Mutation Test ska kunna utföras. Om koncentrationen av en DNA-stamlösning är < 2 ng/µl ska avparaffinering, DNA-isolering och DNA-kvantifiering upprepas för det provet med två FFPET-snitt på 5 µm. För prover på objektglas: Avparaffinera och lägg vävnad från båda snitten tillsammans i ett rör, sänk ned vävnaden i DNA TLB + PK och utför sedan DNA-isolering och -kvantifiering enligt beskrivningen ovan. För prover som inte är på objektglas: Lägg båda snitten tillsammans i ett rör och sänk ned vävnaden i DNA TLB + PK. Utför sedan DNAisolering och -kvantifiering enligt beskrivningen ovan. Om DNA-stamlösningen fortfarande är < 2 ng/µl ska du beställa ett ytterligare FFPET-snitt från den aktuella kliniska enheten. Bearbetade prover (extraherat DNA) är hållbara i upp till 24 timmar i 15 C till 30 C eller upp till 14 dagar i 2 C till 8 C eller upp till 60 dagar i 15 C till 25 C eller när de har genomgått 3 frys-tiningscykler vid förvaring i 15 C till 25 C. Extraherat DNA ska amplifieras inom den rekommenderade förvaringstiden, dock före utgångsdatum för det cobas DNA Sample Preparation Kit som användes för att extrahera DNA. Amplifiering och detektion För att undvika kontamination av arbets-mmx med DNA-prover ska amplifiering och detektion utföras i ett utrymme som är separerat från DNA-isolering. Arbetsområdet för amplifiering och detektion ska rengöras ordentligt innan beredning av arbets-mmx. En korrekt rengöring innebär att alla rack och pipetter torkas av ordentligt med en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit och därefter torkas av med en lösning med 70 % etanol. Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. Förbereda instrumentet Detaljerad information om förberedelse av cobas z 480 finns i instrumenthandboken till analysinstrumentet cobas z 480. Doc. Rev. 1.0 20

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Förbereda testproceduren Detaljerad information om stegen i EGFR-arbetsgången finns i instrumenthandboken till analysinstrumentet cobas z 480 för cobas 4800-systemet och i användarhandboken till cobas EGFR Mutation Test. Skapa en plattlayout med placeringen av alla prover och kontroller i körningen. Mutationskontrollen laddas i position A01 A03 på plattan. Den negativa kontrollen laddas i position B01 B03 på plattan. Spädda prover läggs sedan till i uppsättningar om 3 kolumner, från C01 C03 till och med H09 H12 (se Bild 2). Bild 2 Plattlayout för cobas EGFR Mutation Test Rad/ kolumn 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 A B C D E F G H MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 Varvid: MC = mutant kontroll, NEG = negativ kontroll, S# = prov-id. MMX-# motsvarar Master Mix-reagens 1, 2 eller 3. Alla givna prov måste fördelas över tre efterföljande kolumner i en rad för att generera ett svar. Arbetsmastermix 1 måste laddas i kolumn 01, 04, 07 och 10 på plattan. Arbetsmastermix 2 måste laddas i kolumn 02, 05, 08 och 11 på plattan. Arbetsmastermix 3 måste laddas i kolumn 03, 06, 09 och 12 på plattan. Upp till 30 prover kan laddas på en enskild platta. Om fler än ett reagenskit krävs för att bearbeta alla proverna på plattan måste alla kit komma från samma lot. Förbereda instrumentet 4. Slå på analysinstrumentet cobas z 480. Det tar flera minuter innan instrumentet värmts upp och körningen kan starta. 5. Slå på kontrollenheten. Kontrollenheten loggar automatiskt in i Windows. 6. Dubbelklicka på programikonen för cobas 4800 och logga in med det angivna labbanvändar-id:t och lösenordet för att utföra körningen. 7. Klicka på ikonen New Run i menyn. 8. Popupfönstret Select Test visas. Välj EGFR Tissue Test och klicka på OK. Doc. Rev. 1.0 21

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test 9. När fönstret Work Place visas skriver eller läser du in MWP-streckkoden i fältet Microwell Plate ID. Läs in streckkoderna för DNA Isolation kit-id:t och cobas EGFR Mutation Test Reagent kit-id:t i respektive fält. Ange 24 för det första kitet och 6 för det andra i fältet Sample (om du tänker köra en full platta med 30 prover). Om du tänker köra färre än 24 prover anger du rätt antal i provfältet i den första raden. 10. Sample ID fylls automatiskt i för kontrollpositionerna. Skriv eller läs in ett unikt Sample ID för varje prov i kolumnen Sample ID. 11. När alla Sample ID är angivna väljer du knappen Save i det nedre vänstra hörnet av skärmen. 12. Spara filen med det förvalda filnamn som programmet tilldelar den. 13. Skapa en plattlayout med positionen för alla prover och kontroller i körningen genom att klicka på knappen Print och välja File -> Print i förhandsvisningsfönstret. Fyll alltid plattan kolumnvis. Börja med EGFR MC-position A01 A03 och EGFR NEG i position B01 B03. Börja med position C01 C03 och fortsätt ned till H01 H03. Fortsätt sedan med position A04 A06 ned till H04 H06 tills alla prover har placerats (bild 2). Beräkning av spädning av DNA-stamlösning från prov Beräkning av spädning av DNA-stamlösningar vid koncentrationer från 2 ng/µl till 36 ng/µl DNA-stamlösningar från prover ska spädas omedelbart innan amplifiering och detektion. Tre amplifieringar/detektioner körs för varje prov, vilket kräver en total volym om 75 µl (25 µl för var och en av de tre reaktionerna) för att få en spädning med DNA-stamlösning med 2 ng/µl (totalt 150 ng DNA). 1. Beräkna volymen (µl) DNA-stamlösning som behövs för varje prov: µl DNA-stam = (90 µl x 2 ng/µl) DNA-stamlösningens koncentration [ng/µl] 2. Beräkna volymen (µl) DNA-spädningsbuffert (DNA SD) som behövs för varje prov: Exempel: µl DNA SD = 90 µl µl DNA-stamlösning DNA-stamlösningskoncentration = 6,5 ng/µl 1. µl DNA-stamlösning = (90 µl x 2 ng/µl) 6,5 ng/µl = 27,7 µl 2. µl DNA SD = (90 µl 27,7 µl) = 62,3 µl Beräkning av spädning av DNA-stamlösningar vid koncentrationer > 36 ng/µl DNA-stamlösningar från prover ska spädas omedelbart innan amplifiering och detektion. Tre amplifieringar/detektioner körs för varje prov, vilket kräver en total volym om 75 µl (25 µl för var och en av de tre reaktionerna) för att få en spädning med DNA-stamlösning med 2 ng/µl (totalt 150 ng DNA). 1. Vid DNA-stamlösningskoncentrationer > 36 ng/µl ska följande formel användas för att beräkna den mängd DNAspädningsbuffert (DNA SD) som behövs för att bereda minst 90 µl spädd DNA-stamlösning. Det är för att säkerställa att minst 5 µl DNA-stamlösning används i varje prov. 2. Beräkna volymen (µl) DNA SD som behövs för att späda 5 µl DNA-stamlösning till 2 ng/µl för varje prov: Exempel: Volymen DNA SD som behövs i µl = [(5 µl DNA-stamlösning x DNA-stamlösningskoncentration i ng/µl)/2 ng/µl] 5 µl Koncentration av DNA-stamlösning = 100 ng/µl 1. Volymen DNA SD som behövs i µl = [(5 µl x 100 ng/µl)/2 ng/µl] 5 µl = 245 µl 2. Använd den beräknade volymen DNA SD för att späda 5 µl DNA-stamlösning. Doc. Rev. 1.0 22

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test Provspädning 1. Förbered det antal 1,5 ml Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör för DNA-spädningar som behövs genom att märka dem med aktuell providentifiering. 2. Använd en pipett med aerosolresistent pipettspets och pipettera de beräknade volymerna DNA SD i rören med motsvarande märkning. Pipettera 45 µl DNA SD i ett Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör märkt med NEG. 3. Vortexa varje DNA-stamlösning och den negativa kontrollen i 5 till 10 sekunder. 4. Använd en pipett med aerosolresistent pipettspets (ny spets för varje pipettering) och pipettera försiktigt den beräknade volymen av varje DNA-stamlösning i motsvarande rör med DNA SD. Pipettera 45 µl negativ kontroll (extraherat eluat) i NEG-röret. 5. Förslut rören och vortexa varje rör i 5 till 10 sekunder. 6. Byt handskar. Reaktionsförberedelser Beredning av arbetsmastermixar (MMX-1, MMX-2 och MMX-3 ) EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 och arbets-mmx är ljuskänsliga och måste skyddas mot långvarig exponering för ljus. På grund av viskositeten hos EGFR-blandningarna och arbets-mmx måste pipetteringen utföras långsamt för att säkerställa att all vätska trycks ut fullständigt från spetsen. EGFR MMX-1, EGFR MMX-2 och EGFR MMX-3 kan ha ljusblå/lilaaktig färg. Detta påverkar inte övriga egenskaper hos reagenset. Bered tre arbets-mmx, en som innehåller EGFR MMX-1, en som innehåller EGFR MMX-2 och en som innehåller EGFR MMX-3 i separata 1,5 ml Safe-Lock TM -mikrocentrifugrör. 1. Beräkna volymen EGFR MMX-1 eller EGFR MMX-2 eller EGFR MMX-3 som behövs för varje arbets-mmx med hjälp av följande formel: Volymen EGFR MMX-1 eller EGFR MMX-2 eller EGFR MMX-3 som behövs = (antal prover + 2 kontroller +1) x 20 µl 2. Beräkna volymen MGAC som behövs för varje arbets-mmx med hjälp av följande formel: Volymen MGAC som behövs = (antal prover + 2 kontroller +1) x 5 µl Använd Tabell 2 för att bestämma volymen för varje reagens som behövs för beredning av arbets-mmx baserat på antalet prover som ingår i körningen. Tabell 2 Volym reagens som behövs för arbets-mmx-1, arbets-mmx-2 och arbets-mmx-3 Antal prover* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 µl 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 MGAC 5 µl 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Total vol. för varje arbets-mmx (µl) 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 * Volymerna för antalet prover baseras på summan av antalet prover + 2 kontroller + 1 Doc. Rev. 1.0 23

AVSNITT A: För användning med vävnadsprover cobas EGFR Mutation Test 3. Ta fram motsvarande antal rör med EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 och MGAC från förvaringen i 2 C till 8 C. Vortexa varje reagens i 5 sekunder och samla upp vätska i botten av röret innan användning. Märk ett sterilt mikrocentrifugrör vardera för arbets-mmx-1, arbets-mmx-2 och arbets-mmx-3. 4. Tillsätt den beräknade volymen EGFR MMX-1 eller EGFR MMX-2 eller EGFR MMX-3 i respektive arbets-mmx-rör. 5. Tillsätt den beräknade volymen MGAC i arbets-mmx-rören. 6. Vortexa rören i 3 till 5 sekunder så att innehållet blandas ordentligt. Prover och kontroller ska tillsättas på mikrotiterplattan (AD-platta) inom 1 timme efter beredning av arbets-mmx. Använd endast mikrotiterplatta (AD-platta) och skyddsfilm för cobas 4800-systemet. Förbereda plattan 1. Pipettera 25 µl arbets-mmx i varje reaktionsbrunn på mikrotiterplattan (AD-platta) som behövs för körningen. Se till att pipettspetsen inte vidrör plattan utanför brunnen. Tillsätt arbets-mmx-1 (som innehåller EGFR MMX-1) i brunnarna på mikrotiterplattan (AD-platta) i kolumnerna 01, 04, 07 och 10. Tillsätt arbets-mmx-2 (som innehåller EGFR MMX-2) i brunnarna på mikrotiterplattan (AD-platta) i kolumnerna 02, 05, 08 och 11. Tillsätt arbets-mmx-3 (som innehåller EGFR MMX-3 ) i brunnarna på mikrotiterplattan (AD-platta) i kolumnerna 03, 06, 09 och 12. 2. Pipettera 25 µl EGFR MC i brunnarna A01, A02 och A03 på mikrotiterplattan (AD-platta). Blanda genom att använda en pipett till att aspirera och pipettera upp och ned minst två gånger. 3. Använd en ny pipettspets och pipettera 25 µl NEG i brunnarna B01, B02 och B03 på mikrotiterplattan (AD-platta). Blanda genom att använda en pipett till att aspirera och pipettera upp och ned minst två gånger. Varje körning måste innehålla positiv kontroll (EGFR MC) i brunnarna A01, A02 och A03 och negativ kontroll (NEG) i brunnarna B01, B02 och B03, annars förklaras körningen som ogiltig av analysinstrumentet cobas z 480. Byt handskar för att motverka kontamination mellan prover och utvändig kontamination av PCR-plattan. 4. Använd nya pipettspetsar för varje spätt prov-dna, tillsätt 25 µl av det första prov-dna:t i brunnarna C01, C02 och C03 på mikrotiterplattan (AD-platta). Ta en ny pipettspets för varje brunn. Blanda varje brunn genom att använda en pipett till att aspirera och pipettera upp och ned minst två gånger. Upprepa proceduren för det spädda DNA:t från de andra proverna (brunnarna D01, D02 och D03). Följ mallen i bild 2 tills alla provernas DNA-spädningar är laddade på mikrotiterplattan (AD-platta). Kontrollera att all vätska är samlad i botten av varje brunn. 5. Täck mikrotiterplattan (AD-platta) med skyddsfilm (medföljer plattorna). Använd skyddsfilmapplikatorn för att försluta filmen noga mot mikrotiterplattan (AD-platta). 6. Bekräfta att all vätska är uppsamlad i botten av varje brunn innan PCR-körningen. Amplifiering och detektion ska påbörjas inom 1 timme efter tillsats av den första prov-dna-spädningen i arbets-mmx. Starta PCR-körning Detaljerad information om stegen i EGFR-arbetsgången finns i användarhandboken till cobas EGFR. Doc. Rev. 1.0 24