Avgiftning av läkemedel och tensider med och utan aktivt slam

Avgiftning av läkemedel och tensider med och utan aktivt slam Gabriella Herger Uppsats för avläggande av naturvetenskaplig masterexamen i Miljövetenskap 30 hp Institutionen för växt- och miljövetenskaper, Göteborgs universitet Juni 2011

Sammanfattning Läkemedel har flera egenskaper som gör att de kan vara problematiska när de kommer ut i naturen. Främst bland dessa är att de, till skillnad från andra föroreningar, är tillverkade för att vara biologiskt aktiva. Användningen av läkemedel i Sverige har ökat stort de senaste åren, vilket har den oundvikliga följden att större mängder släpps ut i den akvatiska miljön via avloppsreningsverken. Detta innebär att det har blivit än viktigare att undersöka hur läkemedel påverkar akvatiska organismer, och om en minskning av toxiciteten sker med tid. Tensider är en annan stor grupp föroreningar som släpps ut i mycket stor omfattning till vatten, främst genom deras användning i tvätt- och rengöringsmedel. Tensiders ytaktiva egenskaper påverkar kontaktytorna mellan vattnet och känsliga delar på organismerna såsom gälar, hud och tarm. Resultatet av tensidernas påverkan kan bli problem för växter att suga upp vatten i sina kapillärer, och nedsättning av gälarnas funktion hos fiskar. Användningen av tensider är mycket omfattande, år 2007 producerades sammanlagt över 1,5 miljoner ton bara i Västeuropa av de vanligaste tensiderna som används i tvätt- och rengöringsmedel. I avloppsreningsverken som ska rena vattnet från dessa föroreningar används aktivt slam, dvs. bakterier, som en del av processen. Syftet med denna studie var att undersöka toxiciteten hos ett urval av tensider och läkemedelssubstanser, hur dessa påverkas av avloppsvattenbakterier i laboratoriet samt om toxiciteten avtar med tiden. Sju tensider och fyra läkemedelssubstanser testades för akut toxicitet och av dessa testades fyra tensider och alla läkemedelssubstanser för avgiftning med och utan tillsats av aktivt slam. EC50-värdena för 24h visade en stor spridning mellan de olika testsubstanserna, den mest giftiga substansen (zinkpyrition) hade ett 24-h EC50 värde på 2 µg/l och den minst giftiga substansen (tensiden AG 60206) hade ett 24-h EC50-värde på cirka 2 g/l. Flera tensider uppvisade inga dos-respons-samband, vilket medförde att de inte testades för avgiftning. Dokumentation gjordes av fällningar som uppstod i höga koncentrationer av testlösningarna av paracetamol, ciprofloxacin, ibuprofen och AG 6206 med kamera samt med mikroskåp. Samtliga substanser som testades avgiftades med tiden både med och utan tillsats av aktivt slam. Ett samband kunde hittas mellan 24-h EC50-värde och slamtillsats för bägge grupperna, vilket indikerade att aktivt slam hjälper nedbrytningen av de testade substanserna. Avgiftningshastigheten skiljde sig inte åt mellan de två grupperna, men däremot inom grupperna. Vidare studier behövs för att hitta lösningar på problemet med att få dos-responskurvor för tensider och vidare studier skulle även kunna göras för att undersöka vilka nedbrytningsprodukter som orsakade fällningarna. 1

Summary Pharmaceuticals have several properties that can make them problematic when they are released into nature. Chief among these is that they, unlike other pollutants, are designed to be biologically active. The use of pharmaceuticals in Sweden has increased greatly in recent years, which has the inevitable consequence that larger amounts are released into the aquatic environment via sewage treatment plants. Thus it has become even more important to examine how drugs affect aquatic organisms, and if a reduction of toxicity occurs with time. Surfactants is another large group of contaminants released in large amounts to water, due primarily to their use in washing detergents and cleaners. The surfactant properties affect the interface between water and critical parts of organisms such as gills, skin and bowels. This can cause a problem for plants to imbibe water into their capillaries, and a reduction of the function of the gills in fish. The use of surfactants is very extensive; in the year 2007 a total of over 1.5 million tons of the most common surfactants used in detergents were produced in Western Europe alone. To purify water from these contaminants sewage treatment plants activated sludge, ie. bacteria, is used as a part of the process. The purpose of this study was to investigate the toxicity of a range of surfactants and pharmaceutical substances, how they are affected by sewage bacteria in the laboratory, and if toxicity decreases with time. Seven surfactants and four pharmaceuticals were tested for acute toxicity and of these four surfactants and all pharmaceuticals were tested for detoxification with and without the addition of activated sludge. EC50 values for 24 h showed a large spread between the different test compounds, the most toxic substance (zinc pyrithione) having a 24-h EC50 value of 2 mg / l and the least toxic compound (surfactant AG 60 206) having a 24-h EC50 value of about 2 g / l. Several surfactants showed no dose-response relationship, which meant that they were not tested for detoxification. Precipitation that occurred in high concentrations of test solutions of paracetamol, ciprofloxacin, ibuprofen, and AG 6206 was documented using camera and a microscope. All tested substances showed detoxification with time, both with and without the addition of activated sludge. A relationship was found between 24-h EC50 value and sludge addition for both groups, indicating that activated sludge aids in the degradation of the tested substances. The detoxification rate did not differ between the two groups, but did so within the groups. Further studies are needed to find solutions to the problem of obtaining dose-response curves for surfactants, and further studies could also be done to investigate what degradation products caused the precipitation. 2

Innehållsförteckning Sammanfattning...1 Summary...2 Innehållsförteckning...3 1 Inledning...4 1.1 Läkemedelssubstanser och deras användning samt effekt på miljön...4 1.2 Tensiders användning och effekt på miljön...5 1.3 Reningsverk med aktivt slam...6 1.4 Problemställning...7 1.5 Syfte...8 2 Material och metod...8 2.1 Testade ämnen...8 2.2 Testorganism...11 2.3 Bestämning av akut toxicitet...11 2.4 Biotisk och abiotisk avgiftning...12 2.5 Dokumentation av fällningar...12 2.6 Statistisk analys...12 3 Resultat...12 3.1 Akut toxicitet...12 3.2 Biotisk och abiotisk avgiftning...14 3.3 Dokumentation av fällningar...22 3.4 Variansanalys...26 4 Diskussion...29 4.1 Akut toxicitet...29 4.2 Biotisk och abiotisk avgiftning...30 5 Slutsatser...31 Tackord...32 Referenser...32 3

1 Inledning 1.1 Läkemedelssubstanser och deras användning samt effekt på miljön Läkemedel skiljer sig från många andra föroreningar på flera sätt, bland annat genom deras kemiskt komplexa strukturer, samt det faktum att de introduceras till miljön efter att först ha genomgått mänsklig metabolism (Fatta-Kassinos et al., 2011). Läkemedel framställs för att uppnå en biologisk effekt, och för att vara tillräckligt kemiskt stabila för att kunna passera magsäcken (Naturvårdsverket, 2008). Förekomsten av föroreningar från läkemedel i den akvatiska miljön har det senaste decenniet fått stor uppmärksamhet. Följaktligen har forskningen inom detta område varit både omfattande och bred, vilket har medfört att många frågor har blivit besvarade. Dock kvarstår fortfarande många obesvarade frågor och det finns ett stort utrymme kvar för en utveckling av en mer gedigen förståelse av konsekvenserna av utsläpp av läkemedel till miljön (Fatta-Kassinos et al., 2011). Den totala läkemedelsförsäljningen per invånare har ökat med 22 % mellan åren 2003 och 2011 (Läkemedelsindustriföreningen (LIF), 2011). I Sverige används idag cirka 1200 (siffra från år 2007) olika substanser (Gunnarsson & Wennmalm, 2009) i över 11 000 olika preparat (LIF, 2011). Paracetamol är en av de tre receptföreskrivna läkemedelssubstanser som används av flest personer, fler än var tionde svensk hämtade ut receptförskrivet paracetamol år 2010. Ungefär lika många personer hämtade ut receptföreskrivet läkemedel tillhörande gruppen NSAID (icke-steroida antiinflammatoriska och smärtstillande läkemedel), till vilken ibuprofen hör. Till detta kommer försäljningen av receptfria läkemedel, som 2010 uppgick till 338 miljoner kronor för paracetamol, som var den näst största receptfria läkemedelssubstansen, och 180 miljoner för ibuprofen som var den tredje största. Sifforna för den receptfria försäljningen gäller endast det som expedierats på apotek, ej övriga försäljningsställen (Socialstyrelsen, 2011). I en rapport om läkemedel i miljön från Apoteket AB (Gunnarsson & Wennmalm, 2009), pekas gruppen fluorokinoloner (till vilken ciprofloxacin hör) ut som en av de läkemedelsgrupper som bör ges särskild uppmärksamhet på grund av att de ger verkan i låga koncentrationer, är långlivade samt har tydliga biologiska effekter. En norsk miljöriskbedömning av elva läkemedelssubstanser (Grung et al., 2008) erhöll en PEC/PNEC-kvot * på 1401 för ciprofloxacin. Även ibuprofen och paracetamol ingick i undersökningen. För dessa två läkemedelssubstanser erhölls PEC/PNEC-kvoter på 0,50 respektive 0,70. Zinkpyrition är främst känt som den aktiva ingrediensen i mjällschampon men används även som konserveringsmedel i kosmetika samt som tillsats i båtbottenfärger (Svenska Naturskyddsföreningen, 2004) och till behandling av psoriasis (Crutchfield et al., 1997). Zinkpyrition är mycket giftigt för vattenlevande organismer (Svenska Naturskyddsföreningen, 2004). LC50-värden för fisk har legat mellan 2,6 och 34 µg/l i tester och för Daphnia magna har EC50-värdet befunnits vara mellan 3,6 och 34 µg/l (Fitzpatrick et al., 2001). Utöver utsläpp av metaboliserade läkemedelssubstanser via avloppsresningsverk tillkommer de problem som finns med större utsläpp av läkemedel från fabriker. I Indien uppmättes i ett reningsverk som tog emot avloppsvatten från ett flertal läkemedelstillverkare en koncentration av cipro- * Predicted Environmental Concentration/Predicted No Effect Concentration. Används som en indikator för risk. En riskkvot över 1 indikerar risk för miljöpåverkan. 4

floxacin som var cirka en miljon gånger högre än den i svenska reningsverk (Gunnarsson & Wennholm, 2009). Listan med prioriterade ämnen inom Vattendirektivet kommer att utökas med läkemedel, bland andra Ibuprofen (Cirkulation, 2010). Den nya listan beräknas träda i kraft i juli 2011 (Europeiska Kommissionen, 2010). Ibuprofen har blivit uppmärksammat eftersom toxicitetstester på olika alger, kräftdjur och fiskar har visat på både akuta och kroniska negativa effekter (Entec, 2011). Vid ansökan om att få ett nytt läkemedel godkänt inom EU krävs sedan år 1995 en miljöriskbedömning. År 2004 tog Läkemedelsindustriföreningen ett initiativ till miljöklassificering av läkemedel, med målet att information om miljöpåverkan för alla aktiva ämnen skulle finnas tillgängliga 2011 (LIF, 2007). Detta mål har ej uppnåtts, då information om miljöpåverkan fortfarande saknas på Fass för 38 % av substanserna (LIF, 2011), en siffra som inkluderar ibuprofen och ciprofloxacin. Det saknas således fortfarande, trots den intensiva forskning som bedrivits, information om miljöriskerna med läkemedel. 1.2 Tensiders användning och effekt på miljön Tensider i tvätt- och rengöringsmedel samt i andra produkter (exempelvis i färg och som emulgatorer i livsmedel) används i stora volymer, och förekommer i stor utsträckning i avloppsvattnet från både hushåll och industrier. De kan därigenom ge skadliga effekter på vattenlevande djur och växter. Toxiciteten hos tensider beror på att deras ytaktiva egenskaper påverkar kontaktytorna mellan vattnet och känsliga delar på organismerna såsom gälar, hud och tarm. Cellmembranen i dessa vävnader påverkas både genom ändrad ytspänning och ändrad genomsläpplighet för tensiderna och andra ämnen. Efter att de tagit sig in genom exempelvis gälarna kan tensiderna även påverka de inre organen (Swedmark, 1986). Resultatet av tensidernas påverkan kan bli problem för växter att suga upp vatten i sina kapillärer, och nedsättning av gälarnas funktion hos fiskar (Akzo Nobel, 2000). Den påverkan som ett ämne har på miljön är beroende av dess nedbrytbarhet, dess toxicitet och dess bioackumulering. Nedbrytbarheten är oftast god för moderna tensider, toxiciteten ligger vanligen kring ett LC50-värde på 1-100 mg/l och bioackumulering sker inte i någon större omfattning. Tensiders nedbrytbarhet är främst beroende av längden och formen av den hydrofoba delen av tensiden - en lång och grenad kolkedja är betydligt mer svårnedbrytbar än en kort och ogrenad. Nedbrytningen påverkas även av temperatur, syrehalt och bakteriehalt (Swedmark, 1986). Exempel på svårnedbrytbara tensider är katjontensider och tensider som innehåller aromatgrupper, på grund av att de är giftiga för bakterier (som annars hade kunnat assistera nedbrytningen). Katjontensider är giftiga även för andra organismer (Akzo Nobel, 2000). De kan binda till viktiga makromolekyler som peptider, enzymer och DNA och förändra peptiders och proteiners biologiska funktion genom att poypeptidkedjans vikning och ytladdning ändras. Katjontensiders antibakteriella verkan sker främst genom att skada bakteriernas innermembran (Ivankovic & Hrenovic, 2010). Andra exempel på svårnedbrytbara tensider är de nonjonaktiva tensidtyperna alkylfenoletoxylater och sekundära alkoholetoxylater (Swedmark, 1986). Nonjontensider verkar antibakteriellt genom att de binder till diverse proteiner och till fosfolipidmembran och på detta vis ökar genomsläppligheten hos membran, vilket innebär ett ökat utflöde av mindre förningar och slutligen celldöd genom förlust av joner eller aminosyror (Ivankovic & Hrenovic, 2010). Anjoniska tensider påverkar enzymaktivitet genom att binda till enzymproteinet. De kan dock även ha en positiv effekt på miljön genom att de hjälper nedbrytningen av andra föroreningar som exempelvis pesticider (Bragadin et al., 1996). Amfolytiska tensider är vanligen lättnedbrytbara och ej skadliga (Akzo Nobel, 2000). Den biologiska nedbrytningen är den huvudsakliga nedbrytningstypen ute i naturen, och även en viktig del av nedbrytningen i avloppsreningsverk. Mikroorganismerna använder antingen tensiderna som substrat för energi och näring eller co-metaboliserar dem (Ying, 2005). En studie av den biologiska nedbrytningen av kvartära ammoniumtensider och betydelsen av kolkedjans längd för dessa har bekräftat att en längre kedja gav långsammare nedbrytning. Man observerade vidare att ned- 5

brytningen av dessa ämnen i kustvatten sammanföll med en ökad densitet av bakterieplankton vilket indikerar att tensiderna används som tillväxtsubstrat (García et al., 2001). Anledningen till att oro finns för tensiders ekotoxicitet är att de som sagt används i väldigt stora mängder. I Västeuropa producerades år 2007 sammanlagt över 1,5 miljoner ton av de vanligaste tensiderna som används i tvätt- och rengöringsmedel (Europeiska Kommissionen, 2009). Den största delen av tensiderna bryts ned i avloppsreningsverk, men en viss mängd kommer att passera dessa och hamna i vatten, sediment eller mark. Ett annat möjligt problem är ansamling av tensider i slammet i reningsverken (Holt et al., 1995), vilket kan störa funktionen hos bakterierna i slammet och med dem hela reningsprocessen genom nedbrytning (Ivankovic & Hrenovic, 2010). En genomgång av tillgänglig forskning 2009 angående tensiders toxicitet för markbundna organismer visade att detta har studerats i mindre omfattning, men att det inte verkar vara ett stort problem (Liwarska-Bizukojc, 2009). Fokus för forskningen bör alltså ligga på toxiciteten för vattenlevande organismer. 1.3 Reningsverk med aktivt slam Avloppsreningsverk i Sverige idag är konstruerade för att ta emot vatten av hushållskaraktär, och rena detta vatten från toalettpapper, fosfor, kväve, partiklar och lättnedbrytbart organiskt material. Trots att läkemedelsrester och andra farliga ämnen släpps ut till avloppsreningsverken har avloppsreningsverken inte anpassats till att behandla dessa substanser. I dagsläget pågår dock allt mer forskning i laboratorie- och pilotskala för utveckling av nya metoder. Vidare utvärdering av existerande metoder behövs dock för att kunna jämföra dessa och utveckla effektiva tekniker som reducerar läkemedelssubstanserna med rimlig resursförbrukning och till en rimlig kostnad. Avloppsreningsverk med utbyggd kväverening har dock redan bättre reduktion av även andra ämnen förutom kväve, vilket till stor del beror på den höga slamåldern (Naturvårdsverket, 2008). Värt att notera är att i stort sett inga svårnedbrytbara ämnen försvinner i reningsverket, de går alla antingen till atmosfären om de är flyktiga eller till slammet eller recipienten. Två huvuddelar kan urskiljas i ett avloppsreningsverk: en del för avloppsvatten och en del för slam. Avloppsvattnet behandlas mekaniskt, kemiskt och biologiskt. Slammet stabiliseras vanligen med rötning. Vattnet uppehåller sig 4-5 timmar i ett enklare verk, och uppemot ett dygn för verk med utbyggd kväverening. För avloppsreningsverk med utbyggd kväverening är även uppehållstiden för bakterierna i aktivslamsteget längre - de har en uppehållstid på 10 25 dygn, jämfört med 2 4 dygn för verk utan kväverening (Naturvårdsverket, 2008). Reningen i ett avloppsreningsverk sker i flera steg som på olika sätt tar hand om ämnena i vattnet. Den största delen av reningen sker genom sedimentering, där man avskiljer så mycket som möjligt i partikelform i flera steg: försedimentering, mellansedimentering och slutsedimentering. Det separerade materialet är det som benämns slam. I det efterföljande biologiska reningssteget reduceras huvudsakligen lättnedbrytbara lösta ämnen. Lösta organiska ämnen binds i vissa fall till partiklar och följer med slammet. På vissa stora avloppsreningsverk finns ett sista steg där det renade vattnet filtreras genom en sandbädd innan det släpps ut. Detta filter ger en ytterligare avskiljning av partikar, och därmed av partikelbundna ämnen (Naturvårdsverket, 2008). Det vanligaste sättet att utföra det biologiska reningssteget är den kontinuerliga aktivslamprocessen. Denna process bygger på att flockar, som huvudsakligen består av bakterier, hålls svävande med luft. Den kontinuerliga inblåsningen av luft tillgodoser också avloppsvattnets syrebehov. Bakterierna bryter ner organiskt material med hjälp av syret i luften och bildar vatten och koldioxid samtidigt som 6

ny biomassa byggs upp. Reningsgraden är mellan 90 och 95 procent reduktion av BOD 7 (Naturvårdsverket, 2008). Vid Ryaverket i Göteborg där man har utbyggd kväverening utförs aktivslamprocessen i två steg, en luftad (aerob zon) och en oluftad (anoxzon). I anoxzonen sker denitrifikation när vattnet blandas med vatten från biobäddar och aktivt slam från eftersedimenteringen. I biobäddarna har nitrifikation skett, vilket innebär att det vattnet nu innehåller kväve i nitratform. Eftersom processen i anoxzonen är anaerob tvingas bakterierna i slammet att använda nitraterna för att bryta ner organiskt material, vilket innebär att nitratet omvandlas till kvävgas som avgår till atmosfären. I den aeroba zonen blåser man in luft i vattnet för att ge bakterierna de bästa förutsättningarna för en effektiv nedbrytning av det resterande organiska materialet (Gryaab, 2011). Nya metoder för att förbättra reningen av läkemedel i avloppsreningsverken har, som nämndes tidigare, studerats i relativt stor omfattning de senaste åren, och det finns flera möjliga metoder. I en genomgång av den befintliga forskningen rörande hantering av antiinflammatoriska och febernedsättande läkemedel fann Ziylan och Ince (2011) att de mest effektiva metoderna för nedbrytning var behandling med klor och ozon. Vidare behandling för att uppnå total nedbrytning är möjlig med avancerade oxidationsprocesser, men dessa behöver studeras i större omfattning innan de kan komma att användas. De mest effektiva av dessa är kombinationer som sonolys/sonokatalys och fotolys och foto-fenton processer (Ziylan & Ince, 2011). Det har också visats att nedbrytningen av svårnedbrytbara tensider i avloppsreningsverk kan förbättras genom ozonering och avancerad oxidation med kombinationer av ozon, väteperoxid, ultraviolett strålning och järnsalter (Ikehata & El- Din, 2004). Nedbrytning med hjälp av aktivt slam har tidigare studerats bland annat för tvättmedel och mjukmedel (Pettersson et al., 2000), för krom (Wu et al., 2010) samt för nitrobensen (Ji et al., 2010). I tidigare studier (Pettersson et al., 2000) har man simulerat ett reningsverk ur toxikologisk aspekt genom att tillsätta bakterier från avloppsreningsverk till testlösningar med tvättmedel eller läkemedel. Detta är vad som har gjorts i denna studie med testlösningar av läkemedelssubstanser och tensider. Ett flertal examensarbeten som behandlat toxicitet hos olika typer av produkter och substanser har genomförts vid Göteborgs Universitet. Ett exempel är De Souzas (2008) arbete om nedbrytning av receptfria läkemedel med och utan tillsats av aktivt slam, vilket detta arbete bygger vidare på genom att undersöka andra fabrikat av substanserna paracetamol och ibuprofen, samt att även inkludera den receptbelagda antibiotikan ciprofloxacin. Även zinkpyrition och tensider har behandlats i tidigare examensarbeten (Boll, 2011; Pettersson, 1996; Hult, 2010), men då som delar av innehållet i schampon respektive tvättmedel. Detta arbete bygger vidare på dessa genom att testa de rena substanserna. 1.4 Problemställning Tensider och läkemedel är två grupper av ämnen som används i stora mängder i dagens samhälle. Det är också två grupper som är relativt väl undersökta, men kunskapsluckor existerar ännu. För att nya metoder för rening av avloppsvatten ska kunna utvecklas är det viktigt att kunskapen utvidgas om nedbrytning av olika ämnen och de skillnader som finns mellan dem, vilket denna studie ämnar bidra till. 7

Tensiderna valdes i samarbete med Dr. Natalija Gorochovceva på Akzo Nobel, för att få ett urval av olika typer av tensider. Bland de testade tensiderna finns en högre andel med högre toxicitet än vad som är representativt för de tensider som tillverkas och används idag, detta för att tydligare kunna studera avgiftningen. Läkemedlen valdes med stöd av artikeln Weitere Massnahnmen gegen Mikrovereinigungen (Schärer, 2010). 1.5 Syfte Uppgiften syftar till att undersöka toxiciteten hos ett urval av tensider och läkemedelssubstanser, hur dessa påverkas av avloppsvattenbakterier i laboratoriet samt om toxiciteten avtar med tiden. 2 Material och metod 2.1 Testade ämnen Testet utfördes på fyra läkemedelssubstanser och sju tensider. Läkemedelssubstanserna var paracetamol (Panodil, GlaxoSmithKline), ibuprofen (Burana, Orion Corp), ciprofloxacin (Hexal) och zinkpyrition (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh) och tensiderna var ARQUAD T-50 HFP, AG 6202, OMA 4, AMPHOLAK YJH-40, ETHYLAN 1005, AG 6206 och BEROL 522, samtliga från Akzo Nobel, Stenungssund. Närmare beskrivningar av ämnena finns i tabell 1 för läkemedel och tabell 2 för tensider. 8

Tabell 1. Testade läkemedelssubstanser (Schelin, 2010; Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc., (2011); Leviso, 2009; FASS 2011a, 2011b; PharmWeb, 2011; Nationalencyklopedin, 2011; PubMedHealth, 2010; Kastelein, 2007; Crutchfield et al., 1997; Kemikalieinspektionen, 2011). Läkemedelsubstans (produktnamn och tillverkare) Ciprofloxacin (Ciprofloxacin, Hexal) 1-cyclopropyl- 6- fluoro- 4-oxo- 7- piperazin- 1-ylquinoline- 3-carboxylic acid Ibuprofen (Burana, Orion Corp) p- Isobutylhydratropasyra Paracetamol (Panodil, GlaxoSmithKline) N-Acetyl-p-aminofenol Zinkpyrition bis(2-pyridylthio)zinc 1,1'-dioxide Sigma-Aldrich Chemie Gmbh CAS-nr: 13463-41-7 EINECS-nr: 236-671-3 Strukturformel HN C H 3 HO F N CH 3 N + O- S - NH 2+ Zn O S - O - Beskrivning OH OH Tillhör antibiotikagruppen kinoloner O Bredspektrumantibiotika som verkar genom inhibition av N enzymerna DNA gyras och topoisomeras, som är nödvändiga för bakteriernas DNA-replikation. CH 3 Antiinflammatoriskt läkemedel OH med smärtstillande och febernedsättande effekt Tillhör gruppen NSAID (ickesteroida antiinflammatoriska O och smärtstillande läkemedel) Hämmar enzymgruppen cyklooxygenas (COX), vilket ger minskad bildning av prostaglandiner (påverkar feber, smärta och inflammation) CH 3 Febernedsättande (genom påverkan av värmereglerande centra i det centrala nervsystemet) Smärtstillande (detaljerad mekanism ej känd men antas ha koppling till molekylens förmåga att oskadliggöra fria OH- Och O-radikaler) Svamp- och bakteriedödande Används i mjällschampon samt för behandling av psoriasis. N + 9

Tabell 2 Testade tensider (Akzo Nobel, 2000, 2009, 2010a, 2010b, 2010c, 2010d, 2010e, 2010f, 2010g, 2010h; Natalija Gorochovceva, e-post) Varunamn och aktiv substans Kemisk struktur Beskrivning AG 6202 R Nonjonisk C8 Alkyl glucoside O O OH tensid CAS Nr. 108081-06-7 48-h EC50 för EINECS Nr. 414-420-0 D. magna HO OH >100,1 mg/l R = C OH 8 AG 6206 C6 Alkyl glucoside CAS Nr. 54549-24-5 EINECS Nr. 01-2119492545-29 Ampholak YJH-40 Sodium capryliminodipropionate CAS Nr. 94441-92-6 EINECS Nr. 305-318-6 R O HO R = C 6 O O OH OH OH Na + O - N CH 3 CH 3 Nonjonisk tensid 48-h EC50 för D. magna >100 mg/l Amfotär tensid 48-h LC50 för D. magna >100mg/l Arquad T-50 HFP Tallowtrimethylammoniumchloride CAS Nr. 8030-78-2 EINECS Nr. 232-447-4 Berol 522 Decylphosphoric acid, potassium salt CAS Nr. 68427-32-7 EINECS Nr. 270-390-7 Ethylan 1005 Propylheptanol ethoxylate CAS Nr. 160875-66-1 R O - Na + CH 3 N + CH 3 CH 3 Cl - R= tallow (talg) K + O - O P HO O R O R= C 10 O OH n CH 3 Katjonisk tensid baserad på talg Kvartär ammoniumförening 48-h EC50 för D. magna 0,01-0,1 mg/l 1 Anjonisk tensid 48-h EC50 för D. magna 15 mg/l Nonjonisk tensid 48-h EC50 för D. magna 10,1-100mg/l OMA 4 Alkyl monoethanolamide ethoxylate CAS Nr. 26027-37-4 O R NH R = oleyl O OH 4 Nonjonisk tensid 48-h EC50 för Daphnia magna 3,7 mg/l 10

2.2 Testorganism Daphnia magna är ett kräftdjur som kan bli maximalt 5mm (Anderson, 1944). Det är en vanlig testorganism för toxicitetstester av flera anledningar: de kan hittas i många olika miljöer, de har en kort livscykel och det är relativt enkelt att hålla en kultur levande i ett laboratorium (Persoone et al., 2009). 2.3 Bestämning av akut toxicitet Den akuta toxiciteten bestämdes enligt standarden ISO 6341 (ISO, 1989). Substanserna testades vid 10-13 koncentrationer plus ett referensprov (SRW, standard reference water), och två replikat användes. Den högsta koncentrationen späddes tills den lägsta koncentrationen nåddes genom en halvering av koncentrationen i varje steg. Alla lösningar hölls under omrörning med magnetomrörare under spädningen. Koncentrationerna som användes visas i tabell 3 nedan. Koncentrationerna valdes utifrån tidigare uppmätta EC50-värden via litteratur (läkemedel) eller produktdatablad (tensider). Tabell 3. Testade substanser och koncentrationer. Substans Koncentrationer Ciprofloxacin 192 96 48 24 12 6 3 1,5 0,75 0,38 0,19 (mg/l) Ibuprofen (mg/l) 100 50 25 12,5 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 Paracetamol 100 500 250 125 62,5 31,3 15,6 7,81 3,91 1,95 0,98 0,49 (mg/l) 0 Zincpyrithion 128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,13 (µg/l) AG 6202 (mg/l) 800 400 200 100 50 25 12,5 6,25 3,13 1,56 AG 6206 (g/l) 10 5 2,5 1,25 0,63 0,31 0,16 0,078 0,039 0,02 AMPHOLAK 800 400 200 100 50 25 12,5 6,25 3,13 1,56 YJH-40 (mg/l) ARQUAD T-50 HFP 3,71 1,86 0,93 0,46 0,23 0,12 0,058 0,029 0,015 0,0073 0,0036 (mg/l) BEROL 522 (mg/l) 120 60 30 15 7,5 3,75 1,88 0,94 0,47 0,24 ETHYLAN 1005 10 5 2,5 1,25 0,63 0,31 0,16 0,078 0,039 0,02 (g/l) OMA 4 (mg/l) 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,13 0,063 Till samtliga prover användes Petri-skålar med 10cm diameter (se figur 1) med 50 ml testlösning och 10 st vattenloppor (Daphnia magna, 24-48 h gamla). Antalet immobiliserade vattenloppor räknades efter 24 och 48 h för att bestämma varje substans EC50-värde, den Figur 1. Petriskålar med testlösningarna av ciprofloxacin, ibuprofen och paracetamol. 11

koncentration vid vilken 50 % av testorganismerna blir immobiliserade. EC50-värdena räknades ut med den så kallade Moving average-metoden. Innan teststart samt vid varje nytt testtillfälle gjordes en koncentrationsserie av av kaliumdikromat (K 2 Cr 2 O 7 ) för att kontrollera testorganismernas känslighet. 2.4 Biotisk och abiotisk avgiftning För att bestämma hur toxiciteten påverkas av aktivt slam bereddes samtidigt en koncentrationsserie där 20 µl aktiv slamlösning tillsattes varje prov, och undersökningen fortsattes efter det akuta toxicitetstestet så att en ny mätning gjordes med en veckas mellanrum under fyra veckor. Nya vattenloppor tillsattes varje vecka samtliga prover och nytt slam tillsattes de biotiska koncentrationsserierna, vartefter räkning av immobiliserade vattenloppor skedde efter 24 och 48 h. EC50-värdena räknades ut med Moving average-metoden. I de fall då avgiftningen inneburit att EC50-värdet låg över den högsta koncentrationen uppskattades värdet som 2x den högsta koncentrationen. Efter räkningen efter 48 h sögs daphnierna upp med Pasteur-pipett. På detta vis kunde effektiviteten av den biotiska respektive den abiotiska avgiftningen jämföras med avseende på skillnad i avgiftningshastighet. Det aktiva slammet anskaffades från Ryaverket i Göteborg dagen för teststarten, och därefter hämtades nytt slam inför varje ny vecka. 2.5 Dokumentation av fällningar Eftersom tidigare studier av nedbrytning av paracetamol visat en färgförändring till brunt följt av bildandet av en mörk massa (Eldridge et al., 2007; De Souza, 2008), observerades lösningarna med paracetamol noggrant för att upptäcka förändringar och kunna dokumentera dessa. När fällningar uppstod även i lösningar med ciprofloxacin, ibuprofen och AG6206 dokumenterades även dessa. Kamerabilder togs fortlöpande under testperioden med en Sony Cyber-shot DSCW35 och mikroskåpbilder med 10x och 40x förstoring togs efter testperiodens slut med Motic Digital Microscope DM- 1802. 2.6 Statistisk analys EC50-värden beräknades enligt Peltier and Weber (1985). Variansanalys utfördes för 24-h och 48-h EC50 med avseende på tid samt tillsats av aktivt slam. Spearmans korrelationstest utfördes för att utvärdera samband mellan EC50-värden mot tid och slamtillsats för varje substans. Variansanalys och korrelationstest gjordes med hjälp av programmet Crunch (version 4, Crunch, Software Corp., Oakland, CA, USA). 3 Resultat Kontroll av känsligheten hos daphnierna utfördes med kaliumdikromattester som gjordes parallellt med övriga toxicitetstest varje vecka under testperioden. Enligt Svensk Standard SS-EN ISO 6241:1 1996 ska 24-h EC50 för kaliumdikromat vara 0,6-1,7 mg/l. Resultaten av de utförda testerna gav reslutat med medelvärde på 0,68 ± 0,2 mg/l och median på 0,62 mg/l. I bilaga 1 finns EC50-värden från alla testomgångar bifogade. Immobilitet i kontrollerna var i medel 9,4 % för 24 h och 32 % för 48 h. Detta innebär att endast 24-htesten är giltiga enligt ISO 6341 (1989). 3.1 Akut toxicitet Den akuta toxiciteten skiljde sig stort mellan de olika testsubstanserna från zinkpyrition som var den mest giftiga till AG6206 som var den minst giftiga. En sammanställning av EC50-värdena för alla testade ämnen finns i tabell 4, och visas grafiskt i figurerna 2-4. En fullständig tabell finns som bilaga 12

2. Resultaten från testerna av ciprofloxacin, AG6202 och Ampholak YJH-40 visade inga tydliga dosrespons-samband, vilket hade följden att inga EC50-värden kunde bestämmas för dessa. Resultatet för OMA-4 var även det något otydligt, men en uppskattning kunde göras. Även för Ethylan 1005 fick en grov uppskattning göras eftersom immobiliteten var 100 % i alla testkoncentrationer utom den lägsta, där den var 70 %. Figur 2. Akut toxicitet för Daphnia magna. Jämförelse mellan samtliga testade substanser. Figur 3. Akut toxicitet för Daphnia magna. Jämförelse mellan testade läkemedelssubstanser. 13

Figur 4. Akut toxicitet för Daphnia magna. Jämförelse mellan testade tensider. Tabell 4. Akut toxicitet för Daphnia magna utan tillsats av aktivt slam vid teststart. Substans 24-h EC50 (mg/l) 48-h EC50 (mg/l) Ciprofloxacin - - * Ibuprofen 5,70 4,24 Paracetamol 2,04 <0,49 Zinkpyrition 0,0023 0,0005 AG 6202 - * - * AG 6206 1988 760 AMPHOLAK YJH-40 - * - * ARQUAD T-50 HFP 0,01 0,035 BEROL 522 1,90 0,87 ETHYLAN 1005 ca 7 ca 4 OMA 4 ca 16 ca 8 3.2 Biotisk och abiotisk avgiftning Resultaten från mätningarna av förändringar i toxiciteten varierade mellan de olika testsubstanserna. För de flesta substanserna minskade toxiciteten mätt med 24-h EC50 relativt tydligt med tid, men det var svårare att se trender i värdena för 48-h EC50. Kurvor för samtliga läkemedelssubstanser och tensider visar i figurerna 5-28. Tabeller över samtliga EC50-värden för alla veckor finns i Bilaga 3. Resultaten av Spearmans korrelationstest för varje testsubstans visas i tabellerna 6-11. Resultaten har klassats som statistiskt signifikanta för P < 0,05 (α har satts till 0,05). I tabell 5 visas en enkel sammanfattning av korrelationer mellan EC50-värden och tid respektive slamtillsats. Alla substanser visade en korrelation mellan 24-h EC50 och tid, men endast ett fåtal visade ett samband mellan slamtillsats och EC50-värde. Inga tydliga dos-respons-samband uppvisades 14

Tabell 5. Sammanfattning av resultat av Spearmans korrelationstest för samtliga testade substanser. Korrelationer mellan 24-h och 48-h EC50-värden och tid samt slamtillsats. Ibuprofen Paracetamol Zinkpyrition AG 6206 Arquad T-50 HFP Berol 522 24-h 48-h 24-h 48-h 24-h 48-h 24-h 48-h 24-h 48-h 24-h 48-h Vecka Ja Ja Ja Ja Ja Nej Ja Nej Ja Ja Ja Ja Slam Nej Nej Ja Nej Nej Nej Ja Nej Nej Nej Nej Ja För AG 6202 och Ampholak YJH-40 avbröts testerna efter det första akuta toxicitetstestet på grund av bristen på ett dos-respons-samband. Ciprofloxacin och OMA 4 testades bägge i fyra veckor, men uppvisade aldrig något tydligt dos-respons-samband, vilket innebär att några EC50-värden inte kan redovisas för dem. Den totala immobiliteten i samtliga testkoncentrationer minskade dock relativt tydligt för bägge, bortsett från 48-h räkningen den sista veckan, vilket visas i tabeller 6 och 7 nedan. Resultaten för OMA 4 visade för samtliga veckor och replikat en markant högre immobilitet i koncentrationen 1 mg/l än i alla andra koncentrationer (medelvärde 7,8 jämfört med 2,1 för samtliga). Tabell 6. Total immobilitet i alla testade koncentrationer av Ciprofloxacin för Daphnia magna under 4 veckor. Totalt antal immobila Daphnia magna Vecka 24 h 24h med slam 48 h 48h med slam 1 30 39 73 85 2 30 32 65 82 3 16 23 45 67 4 13 17 66 77 Minskning 57 % 56 % 10 % 9 % Tabell 7. Total immobilitet i alla testade koncentrationer av OMA 4 för Daphnia magna under 4 veckor Totalt antal immobila Daphnia magna Vecka 24 h 24h med slam 48 h 48h med slam 1 54 57 74 76 2 28 22 39 40 3 21 14 36 29 4 20 14 36 36 Minskning 63 % 75 % 51 % 53 % 15

3.2.1 Ibuprofen Figur 5. Utveckling av toxicitet över tid utan tillsats av aktivt slam för D. magna för ibuprofen. Figur 6. Utveckling av toxicitet över tid med tillsats av aktivt slam för D. magna för ibuprofen. Figur 7. Utveckling av toxicitet över tid utan tillsats av aktivt slam för D. magna för ibuprofen Figur 8. Utveckling av toxicitet över tid med tillsats av aktivt slam för D. magna för ibuprofen I tabell 8 visas att Spearmans korrelationstest indikerar att för ibuprofen existerar en korrelation mellan 24-h EC50 och tid, 24-h EC50 och 48-h EC50 samt mellan 48-h EC50 och tid. 16

Tabell 8. Spearmans korrelationstest för ibuprofen. Variabel 1 Variabel 2 Korrelationskoefficient P-värde 24-h EC50 Vecka 0,9487 0,0000 24-h EC50 Slam -0,1088 0,6884 24-h EC50 48-h EC50 0,8375 0,0001 48-h EC50 Vecka 0,9048 0,0000 48-h EC50 Slam -0,0543 0,8417 3.2.2 Paracetamol Figur 9. Utveckling av toxicitet över tid utan tillsats av aktivt slam för D. magna för paracetamol Figur 10. Utveckling av toxicitet över tid med tillsats av aktivt slam för D. magna för paracetamol Figur 11. Utveckling av toxicitet över tid utan tillsats av aktivt slam för D. magna för paracetamol Figur 12. Utveckling av toxicitet över tid med tillsats av aktivt slam för D. magna för paracetamol 17

I tabell 9 visas att Spearmans korrelationstest indikerar att för paracetamol existerar en positiv korrelation mellan 24-h EC50 och tid, och att en negativ korrelation existerar mellan 24-h EC50 och tillsats av slam. Eftersom tillsats av slam gavs värdet 1 och ingen tillsats av slam gavs värdet 2 i analysprogrammet innebär detta att tillsats av slam gav högre EC50, och således hjälpte avgiftningen. En positiv korrelation fanns mellan 24-h EC50 och 48-h EC50 samt mellan 48-h EC50 och tid. Tabell 9. Spearmans korrelationstest för Paracetamol. Variabel 1 Variabel 2 Korrelationskoefficient P-värde 24-h EC50 Vecka 0,6437 0,0071 24-h EC50 Slam -0,5295 0,0349 24-h EC50 48-h EC50 0,8566 0,0000 48-h EC50 Vecka 0,7642 0,0006 48-h EC50 Slam -0,1448 0,5926 3.2.3 Zinkpyrition Figur 13. Utveckling av toxicitet över tid utan tillsats av aktivt slam för D. magna för zinkpyrition Figur 14. Utveckling av toxicitet över tid med tillsats av aktivt slam för D. magna för zinkpyrition 18

Figur 15. Utveckling av toxicitet över tid utan tillsats av aktivt slam för D. magna för zinkpyrition Figur 16. Utveckling av toxicitet över tid med tillsats av aktivt slam för D. magna för zinkpyrition I tabell 10 visas att Spearmans korrelationstest indikerar att för zinkpyrition existerar korrelation mellan 24-h EC50 och tid samt mellan 24-h EC50 och 48-h EC50. Tabell 10. Spearmans korrelationstest för Zinkpyrition. Variabel 1 Variabel 2 Korrelationskoefficient P-värde 24-h EC50 Vecka 0,8635 0,0000 24-h EC50 Slam -0,2720 0,3082 24-h EC50 48-h EC50 0,5182 0,0398 48-h EC50 Vecka 0,4456 0,0837 48-h EC50 Slam 0,1092 0,6873 3.2.4 AG 6206 Figur 17. Utveckling av toxicitet över tid utan tillsats av aktivt slam för D. magna för AG 6206 Figur 18. Utveckling av toxicitet över tid med tillsats av aktivt slam för D. magna för AG 6206 19