Lärarfortbildning 2019-05-07 Marie Danielsson 08 790 97 32 marie.danielsson@vetenskapenshus.se Idag Inledning - kromatografi Extraktion av växtfärgämnen Pappers- och tunnskiktskromatografi Fika Kolonnkromatografi Ev. mer tunnskiktskromatografi Avslut 1
Grekiska: chroma = färg, graphein = skriv Uppfanns 1906 av Mikhail Tsvet Separerade färger från växter Mikhail Tsvet (1872-1919) Teckning: M. Tsvet (1906) Teknik för att separera olika ämnen En stationär och en mobil fas Utnyttjar fördelningsjämvikter 2
Kolonnkromatografi Kolonnkromatografi 3
Papperskromatografi och tunnskiktskromatografi Vätskekromatografi Papperskromatografi Tunnskiktskromatografi Papperskromatografi Pappret polärt Framkalla med t.ex. vatten, saltlösning, etanol beroende på provet Billigt och enkelt: papper eller filterpapper (kaffefilter fungerar också) 4
Vätskekromatografi Papperskromatografi Tunnskiktskromatografi TLC - tunnskiktskromatografi Plattor av glas, plast eller aluminium belagda med ett ytskikt Vanligtvis kiseldioxid, polär Plattor som absorberar ljus vid 254 nm kräver UV-lampa 254 nm 5
sträckan ämnet vandrat R f sträckan lösningsmedlet vandrat Växtextraktion 1. Väg upp 2-3 g blad och finfördela med sax. Alternativt 1-2 g torkade alger som smulas med hjälp av mortel. 2. Mal bladen tillsammans med aceton i morteln, börja med 5 ml och späd med ytterligare 5 ml (eller mer) vid behov. 3. Dekantera lösningen till ett eppendorfrör och centrifugera på högsta hastighet i 3 minuter. Efter centrifugeringen ska supernatanten vara helt klar. För över supernatanten till ett nytt rör. Eller 3. Filtrera lösningen genom filterpapper i tratt ner i en bägare eller e-kolv. Kom ihåg att fukta filterpapperet med aceton innan du häller på växtlösningen. 6
Hantera med handskar! Vätskekromatografi Papperskromatografi Tunnskiktskromatografi Provet appliceras på en platta Ovanför vätskeytan En bit från kanten och med avstånd till andra prover Liten fokuserad prick Plattan sätts ner i en täckt bägare med lösningsmedel Låt lösningsmedlet stå i bägaren ca 10 min innan separation Filterpapper (mätta atmosfären i bägaren med eluenten) Vänta Se eller framkalla resultatet Titel Färger Stationär fas: kromatografipapper Mobil fas: dietyleter:acetone, 9:1 Ämne R f värden β-carotene 0.99 lutein 0.68 violaxanthin 0.40 chlorophyll a 0.30 chlorophyll b 0.13 carotene, violaxanthin, and lutein are carotenoids OBS! Bild från annat kromatografisystem https://commons.wikimedia.org/wiki/file:chromatography_of_ chlorophyll_results.jpg https://www.depts.ttu.edu/ciser/science-teacher-resources/travelinglab/curriculum/plants/plant_pigment_chromatography.pdf 7
TLC Thin layer chromatography Från det synliga till det osynliga Plattor av glas, plast, alliminium belagda med ytskikt Plattor som absorberar ljus vid 254 nm kräver UVlampa 254 nm Framkalla med jod eller nihydrin TLC på Treo från det synliga till det osynliga TLC plattor silica, UV-lampa 254 nm flouroscerande vid 254 nm Mikrokappilär Treo Blyertspenna Etanol:Aceton 1:1 Mortel Kaffein < 0,05 g/ml Acetylsalicylsyra 0,05 g/ml TLC-vanna/bägare med lock 8
Vätskekromatografi SPE solid phase extraction SPE solid phase extraction Används för att rena upp prover Vätskekromatografi på liten öppen kolonn Enkel att hantera Snabb Ser direkt separation av färger 9
SPE - mångsidig Finns olika packningar - Polära/opolära/jonbytare Bild: Wim Staal Exempel från Wim Staal: Normal phase chromatography: separation av färg i lampolja Anjonsbytare: dikromat och permanganat Katjonsbytare: kopparjoner Gaskromatografi M&M/non-stop, thé, silkespapper Kolonn packad med små partiklar 10
Prov 1. Färgämnena fastnar på kolonnens partiklar 2. Om ett färgämne är mer likt lösningsmedlet än partiklarna kommer färgämnet följa med lösningsmedlet genom kolonnen 1 Lösningsmedel Blanding 1 1. Färgämnena fastnar på kolonnens partiklar 2. Om ett färgämne är mer likt lösningsmedlet än partiklarna kommer färgämnet följa med lösningsmedlet genom kolonnen 11
2 Lösningsmedel Blanding 2 1. Färgämnena fastnar på kolonnens partiklar 2. Om ett färgämne är mer likt lösningsmedlet än partiklarna kommer färgämnet följa med lösningsmedlet genom kolonnen 3 Lösningsmedel Blanding 3 1. Färgämnena fastnar på kolonnens partiklar 2. Om ett färgämne är mer likt lösningsmedlet än partiklarna kommer färgämnet följa med lösningsmedlet genom kolonnen 12
Olika metoder att eluera mobilfasen Vi använde pistongen direkt på kolonnen. Vilka för- och nackdelar har den metoden? Bilder: Supelco (Bulltein 910) Olika metoder att eluera mobilfasen Bilder: Supelco, Waters 13
Vad driver separationen Intermolekylära krafter Inducerad dipol inducerad dipol Inducerad dipol-dipol Dipol-dipol Vätebindningar Ämnet kommer framförallt vara i den fas som det binder starkast till. Idag: 1) Välj dryck ni vill undersöka 2) Separera i kolonnen 3) Vad ser ni? Varför? 14
Papperskromatografi - livsmedelsfärg papper/filterpapper Hushållsfärg Koncentrerad dryck 0,1 % NaCl-lösning TLC-vanna/bägare med lock Snabb metod några minuter 15