Slurapport för 2015 Ett unikt svenskt system för toleransbehandling av reumatoid artrit Övergripande måluppfyllelse: Projektet startades med tre målsättningar, vilka samtliga har uppnåtts under projektets gång. 1) Den första målsättningen var att erhålla proof-of-principle för att en oral toleransterapi mot reumatoid artrit (RA), kan uppnås om CTA1R7K-COL-DD fusionsproteinet skulle kunna uttryckas i ätbara växter. Denna terapi skulle visa sig effektiv i en experimentell modell i vilken möss äter en sallad som uttrycker rekombinant CTA1R7K- COL-DD. Vi fann att vårt tolerogen CTA1R7K-COL-DD uttryckt i växter skyddades från nedbrytning i magtarmkanalen och därmed effektivare stimulerade till tolerans i musmodellen. Detta medförde att leder utsattes för vävnadsdestruktion i långt lägre grad än kontroll-djurens leder. Vårt nästa mål är nu att pröva om sallads-behandling skulle kunna erbjudas människor i en klinisk prövning. För detta mål söker vi ytterligare finansiering. 2) Den andra målsättningen var att byta ut DD-delen av fusionsproteinet mot single chain Fv (ScFv) antikroppar som skall målsöka dendritiska celler mer direkt. För detta syfte har vi utvecklat två typer av fusionsproteiner med direkt målsökning; ett baserat på CD103 bindning och ett med direkt bindning till CD11c. Dessa ytproteiner (CD103) uttrycks på bestämda undergrupper av dendritiska celler (DC) eller är generella markörer (CD11c) för DC. Preliminära resultat pekar på att DD- kan ersättas av ScFv och uppnå högre specificitet för DC och därmed effektivare kan inducera tolerans i CD4 T cellerna, eftersom det är den CD103 + migratoriska DC-populationen som effektivast stimulerar T cells tolerans. 3) Den sista och 3dje målsättningen i projektet var att utvärdera i ett humant system om toleransterapi kan ha en skyddande effekt på en autoimmun sjukdom. För dessa studier utvecklade vi ett fusionsprotein som bär en peptid från Acetylcholin-receptorn (AChR) och denna uttrycktes väl i CTA1R9K-MG-DD, vilket är ett fusionsprotein som avses att användas som en toleransterapi mot myasthenia gravis (MG) sjukdomen. Initiala studier visade på en bra effekt i en musexperimentell modell av MG och efterföljande prövningar på humana periferblodsceller visade på tolerogena egenskaper. Denna del av projektet går nu vidare i ett nystartat bolag, Toleranzia AB, som skall ta behandlingen till klinisk prövning och för vilket vi erhållit ett stort Eurostar-anslag. Uppnådda resultat: 1) Proof-of-principle studier: CTA1R7K-COL-DD har genom rekombinant teknik uttryckts Arabidopsis thaliana växter och denna växt utgör därmed en terapeutisk behandling av collagen-inducerad artrit (CIA), den mest erkända modellen för reumatoid artrit (RA). Vi har därefter genomfört en serie försök i CIA-modellen för att ta reda på om vi kan tillföra CTA1R7K-COL-DD till möss genom födan och om denna behandling har terapeutisk effekt på ledinflammationen. Vi har uppnått överraskande resultat med mycket god skyddande effekt mot ledinflammation. Således erbjudes behandlingen som en sallad för mössen. Behandlingen gick till så att ledinflammationen initierades och därefter gavs mössen sallad en dag varje vecka i 4 veckor under pågående sjukdomsutveckling. Den terapeutiska effekten av salladsätandet har visat sig signifikant och 20-25% av djuren utvecklade inte någon artrit alls, medan de övriga utvecklade en betydligt mildare artrit. Objektiva parametrar på en mildare
artrit i form av lägre immunpatologi i lederna och låg frisättning av IL-6 eller MMP-3 i serum kunde säkerställas i behandlade djur. COL+CFA COL+IFA CIA progression 1 21-3 7 14 24 Feeding Feeding Feeding Feeding Som En värdefull kontroll har vi nyligen tagit fram Arabidopsis thalania som rekombinant uttrycker CTA1R7K-DD, utan COL peptid. Denna behandling gav inget skydd mot CIA i försöken, varför vi med säkerhet kan påstå att det är COL-peptiden som ger den specifika toleransen i modellen och som ger skydd mot CIA-artriten. Vidare har vi dokumenterat mekanismerna bakom toleransen som induceras genom att äta växterna som uttrycker CTA1R7K-COL-DD. Vi fann att två skyddande mekanismer stimuleras genom salladsätandet. Den ena är en ökning av regulatoriska Foxp3-postiva CD4 T celler i blodet och den andra är förekomsten av IL-10 producerande regulatoriska T celler i de lymfoida organen. Vi konstaterade att förekomsten av inflammationsdrivande IL-17 och IFN- är klart sänkta i de behandlade djuren. Detta fynd är i enlighet med andra modeller för inducerad T cells-tolerans vid autoimmunitet. Arbetet med att utforska varför CTA1R7K-COL-DD ger tolerans i modellen har utvidgats och vi undersöker nu om IL-27 eller IL-35 är involverade. Arthritis Incidence Arthritic Index Weight Change För detta har vi etablerat nya metoder för IL-27 detektion med ELISA för proteindetektion och PCR-för registrering av IL-27 genuttrycket. Anti-IL-27 behandlingar in vivo planeras för
2014 för att utröna om detta är en central mekanism för toleransen som induceras med CTA1R7K-COL-DD. Preliminära fynd visar på att IL-27 kan vara en mekanistisk förklaring till att CTA1R7K-COL-DD ger stark tolerans i musmodellen. 2) Genteknologi för att ersätta DD med ScFv för bättre målsökning av fusionsproteinet CTA1R7K-COL-DD: Vi har nyligen dokumenterat att vårt tolerogen CTA1R7K-COL-DD tas upp av DC i nässlemhinnan om fusionsproteinet appliceras där. Vi har följt hur vårt tolerogen tas upp och processas av DC i nässlemhinnan och hur DC aktiveras och mognar till tolerogena DC som dämpar bildandet av autoaggressiva CD4 T celler i de dränerande lymfnoderna. Vi fann ett tydligt mönster där CD103 + CD11b + DC specifikt tog upp tolerogenet efter nasal administration, som också uttrycktes tillsammans med MHC-II på dessa cellers yta (se fig. nedan) CD19 CD103 -- CD11b + CD103 + CD11b +/- CD103 + CD8 + 12 h 24 h Yae: E MHCII loaded onto 3) Miljonfinansiering för genombrottsbehandling mot muskelsjukdom och Orphan Drug Designation status vid Amerikanska läkemedelsverket (FDA) (press release) Toleranzia AB är ett läkemedelsbolag som har utvecklat ett patentskyddat koncept med stor potential för en rad autoimmuna sjukdomar. Fokus ligger på diagnosen Myasthenia Gravis (MG), där professor Nils Lycke och hans forskargrupp inom Sahlgrenska Akademien gjort banbrytande insatser för att inte bara behandla utan också bota denna allvarliga muskelsjukdom. Med anledning av att projektet erhållit Eurostars anslag publicerades denna press release. Nedan visas ett experiment i musmodellen för MG och den effektiva dämpningen av muskelsymptom som erhålles genom intranasal behandling med CTA1R7K- MG-DD. Nästa figur visar den tolerogena effekten på humana DC, som resulterar i en stark
produktion av IL-10, vilket talar för att även i ett humant system är stimulering av regulatoriska CD4 T celler mekanismen bakom en klinisk efffekt av intranasal behandling med tolerogent fusions protein CTA1R7K-MG-DD. Personal Arbetet framskrider nu med att hitta finansiering av en klinisk prövning. Två publikationer, som redan föreligger i manuskript, kommer att skickas in för bedömning under 2015 med doktoranden Charlotta Hansson, som förstaförfattare. Hon genomförde sin halvtidsutvärdering av doktorandprojektet i december 2013 med strålande resultat. Företaget Toleranzia AB har avdelad personal som arbetar med MG-delen av projektet. Avvikelser i projektet mot projektbeskrivningen Det finns inga avvikelser gentemot den ursprungliga projektplanen. Publikationer Manuskript inskickade för bedömning eller under sammanställning
1. Hansson C 1, Schön K 1, Kalbina I 2, Stridh Å 2, Andersson S 2,3, Bokarewa M 4, and N.Y.Lycke Feeding transgenic plants expressing a targeted fusion protein protects against arthritis. Submitted to Mucosal Immunology 2. Hansson C 1, Schön K 1, Bokarewa M 4, and N.Y.Lycke. The intranasal tolerogen CTA1R7K-COL-DD specifically targets dendritic cells after nasal administration. Manuscript under preparation. Sammanfattning Arbetet med att ta fram en behandling mot autoimmuna sjukdomar och RA i synnerhet har fortskridit enligt plan under hela projektet. En doktorand, Charlotta Hansson har arbetat heltid med att uttrycka fusionsproteinet CTA1R7K-COL-DD i Arabidopsis thalania växter som sedan möss matats med för att uppnå tolerans av autoaggressiva CD4 T celler och dämpning av ledinflammationen. Resultaten har varit mycket lovande och vi kan idag konstatera att en terapeutisk sallad en gång i veckan tycks reducera incidensen av artrit med 25%, samt att artriten som utvecklas hos dom drabbade är 50% lägre. Vi kommer nu att fortsätta att utveckla terapin för klinisk användning. Ett bolag, Yoleranzia AB, har bildats för att driva projektet vidare mot klinisk prövning och vi har valt myasthenia gravis, som en lämplig sjukdom att initiera klinisk toleransterapi mot. För detta har ett Eurostars-anslag erhållits och orphan-drug designation i USA. Inga personal eller organisationsförändringar eller avvikelser gentemot den ursprungliga projektplanen har gjorts.