Echinocandin B Rolf G. Eklund Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling VT2012 Institutionen för Läkemedelskemi, Avdelningen för Farmakognosi Uppsala Universitet Författare: Rolf G. Eklund rolf.g.eklund@telia.com Handledare: Elisabet Vikeved elisabet.vikeved@fkog.uu.se
Echinocandin B Rolf G. Eklund Sammanfattning Svampinfektioner (mykoser) är ett tilltagande hälsoproblem i världen. Echinocandin B är en naturlig förekommande substans, vilken fungerat som modell för framtagning av läkemedel för behandling av invasiva mykoser hos människor. Den antifungala aktiviteten hos echinocandin sker genom hämmande av syntesen av de kitinuppbyggda cellväggarna hos svampen. Metoden begränsar tillväxten av svamphyferna och därmed spridningen av infektionen. Echinocandiner kan utgöra ett alternativ i samband med behandlig av mykoser orsakade av svampar resistenta mot syntetiska antifungala substanser. Det är dock inte helt problemfritt att använda echinocandiner vid behandling av mykoser. Biverkningar förekommer och mutationer, hos vissa svamparter, har visat sig kunna ge upphov till resistens mot echinocandiner. Historisk bakgrund De naturligt antifungala ämnen som idag används farmakologiskt, har i huvudsak påträffats i form av metaboliter från fermentering av svamp. Dessa kan därför delvis betraktas som sidofynd i samband med större undersökningar, i sökandet efter nya former av antibiotika (Wiederhold & Lewis, 2003; Hector, 1993). Echinocandin B isolerades första gången 1974 från A. rugulosus (Samuelsson & Bohlin, 2009). Naturligt echinocandin B används dock inte i någon större utsträckning i läkemedels-produktion. För klinisk användning används semisyntetiska derivat av pneumocandin B, en lipopeptid snarlik echinocandin B. Det första att lanseras som läkemedel var Capsofungin (Boucher et al., 2004). Naturligt echinocandin har fungerat som modell för den kliniska formen, trots att ingående kunskaper saknas kring mekanismerna för echinocandins biosyntes. Caspofungin har senare efterföljts av Micafungin och Anidulafungin, samtliga innehåller skilda sidkedjor, eller andra modifieringar i förhållande till den naturligt förekommande molekylen (Samuelsson & Bohlin, 2009). Biologisk aktivitet Echinocandin B är en cyklisk hexapeptid kopplad till en lång fettsyrakedja (Bild 1.) (Samuelsson & Bohlin, 2009; Boucher et al., 2004; Rang et al., 2009; EBI, 2012). 1
Echinocandiner verkar genom icke-kompetetivt hämmande av syntesen av de kitinuppbyggda cellväggarna hos svampen, vilket hämmar tillväxt och förnyelse av svamphyfer. Målet för echinocandins hämmande verkan är subenhet 1,3-β-glukan, verksam vid syntes av kitinkomponenten. Kitin fungerar i svamphyfernas cellväggar som stöd för glukanskelettet och bidrar till den relativa stelhet cellväggen uppvisar (DiNubile et al., 2004). I brist på kitin försvagas cellväggen för att slutligen kollapsa, d.v.s. lysering av svampcellen. På så vis begränsas svamphyfernas tillväxt och eventuellt kan mykosen successivt hävas (Rang et al., 2009; Hector, 1993). Cellväggar (liksom mekanismer för kitinsyntes) saknas hos däggdjur. Inhibering av kitinsyntes (som hos echinocandiner) påverkar därför inte direkt de mänskliga cellerna, utan kan verka selektivt för celldöd hos svampceller (Madigan et al., 2009). Bild 1. Molekylär strukturformel: Echinocandin B (EBI, 2012). Klinisk effekt och användning Traditionellt har mykoser behandlats med syntetiska antifungala preparat, eller t.ex. Amphotericin B utvunnet från Streptomyces nodosus (d.v.s. en bakterie) (Samuelsson & Bohlin, 2009). Amphotericin B verkar genom att binda till ergosterol i svamphyfens cellväggar och skapa kanaler i cellmembranet, vilket i sin tur leder till en hastig förlust av intracellulära jonbalansen med efterföljande lysis av svampcellen. Amphotericin B förblir förstahandsvalet vid behandling av svåra mykoser (Wiederhold & Lewis, 2003; Rang et al., 2009). Den främsta nackdelen med de hittills förekommande syntetiska, antifungala 2
substanser är att dessa också interagerar med kroppsegna celler (Rang et al., 2009). Helt syntetiska antifungala medel, azoler, uppvisar ett spektrum av olika verkningsmekanismer. Gemensamt för merparten av de syntetiska preparaten är att dessa förknippas med besvärliga biverkningar. Vissa isolat av Candida albicans har uppvisat resistens mot azoler men god respons vid behandling med echinocandiner (Rang et al., 2009; FASS, 2012). Mykoser Invasiva mykoser är ett växande hälsoproblem i världen. Från att tidigare ha betraktats som kliniskt ointressanta har mykoser seglat upp som ett allvarligt och svårbehandlat problem i vårdsituationer (Richardson, 2005). Ett flertal svamparter (i dess filamentösa stadier) kan komma i fråga vid humaninfektion, många ytterst specifika med avseende på infektionslokalisering i eller på kroppen, från ytliga hudinfektioner (huvudsakligen Aspergillus spp.) till blodinfektioner (huvudsakligen Candida spp.). Mycoser innebär en särskilt förhöjd risk för personer med nedsatt immunförsvar t.ex. äldre, transplantationspatienter och HIV-smittade (Rajeshkumar & Sundararaman, 2001). Svampar som förekommer i humaninfektioner befinner sig i sin filamentösa form (trådformigt hyfbildande, vanligen från fylum Ascomycota). Detta är svampens anamorfa, eller asexuella, reproduktionsfas, där mitos är det dominerande spridningssättet genom avgivning av sporer (konidier) eller sammansmältning av närliggande hyfer. Spridningen är att betrakta som klonal, då ingen sexuell rekombination äger rum. Vissa arter av svampar förefaller endast förekomma i anamorf fas. Detta kan sammanhänga med kunskapsbrist kring den sexuella, telomorfa, reproduktionsfasens morfologiska kännetecken eller att vissa svampar möjligen helt saknar sexuell reproduktion. Rekombination mellan två skilda (anamorfa) svampindivider kan dock inte uteslutas (Raven et al., 2005). Allmänt förekommande svampar som infekterar människor: Aspergillus spp. i synnerhet Aspergillus flavus Candida spp. i synnerhet Candida albicans Båda tillhörande sporsäckssvampar (fylum Ascomycota) (Boucher et al., 2004; Raven et al., 2005; DiNubile et al., 2004) Den initiala symtombilden vid mykoser är diffus, vilket försvårar för korrekt diagnos. Generell information till behandlande läkare kring symptom, i synnerhet hos patienter med nedsatt immunförsvar kan vara av avgörande betydelse för insättning av adekvat behandling på ett tidigt stadium (Richardson, 2005). 3
Läkemedelsutveckling Med tilltagande problem kring mykoser inom vården är det troligt att marknaden för antifungala läkemedel är växande. Echinocandin B har i sin naturliga form visat hemolytiska egenskaper, vilket också är huvudorsaken till att direkt utvinning av substansen inte tillämpas i samband med läkemedelsproduktion. Fermentering av svamp är dock fortfarande den metod som idag används för extraktion av echinocandiner. Metoden kan förfinas genom utprovning av optimala sammansättningar av medier för effektivisering av produktionen för läkemedelsindustrin (Cockshott & Hartman, 2000). För att öka produktionsvolymerna vid användning av industriella fermenteringsanläggningar har effektiviteten vid storskalig produktion av Micafungin (pneumocandinbaserad echinocandin, med ett brett antifungalt spektrum) utprovats experimentellt. Skälet till genomförandet av ett storskaligt experiment var att in vitro-försök på småskalig laboratorienivå har visat sig inte helt avspegla förhållanden i fermentorer med en volym 15m 3. Storskalig fermentering av en mutant stam av Coleophoma empetri (F-11899) utfördes, med samtidig kontroll över tillförsel av kol- och kvävekällor respektive syre, i syfta att åstadkomma ett förbättrat medium. I processen ingår att ersätta (naturliga) sidkedjor med syntetiska för att nå den slutgiltiga produkten, Micafungin. Resultaten visade att justeringar kan ge god utdelning i form av kraftigt ökad produktion av slutprodukten, och därmed lönsamhet (Kanda et al., 2010). Naturliga substanser har potential att vara relativt enkla och billiga att framställa, två viktiga faktorer i t.ex. utvecklingsländer (Rajeshkumar & Sundararaman, 2001). Biverkningar Echinocandin ger generellt sett färre biverkningar och förgiftningar än andra antifungala läkemedel på marknaden (Denning, 2003; Ernst et al., 1997). Trots mycket begränsad påverkan på humana celler förekommer ett antal biverkningar i samband med administrering av echinocandiner. Echinocandinen Casofungin har en långsam maximal distribution in i vävnad (1,5-2 dagar), och en låg initial utsöndring (därefter långsam). Echinocandiner metaboliseras huvudsakligen i levern genom hydrolys och N-acetylering. Särskild försiktighet bör därför iakttagas vid behandling av patienter med nedsatt leverfunktion (Dennings, 2003; FASS, 2012). Vanliga biverkningar: Huvudvärk Feber Takykardi Hypotension 4
Leverpåverkan, förhöjda leverenzymvärden Ökning av eosinofila granulocyter i blodet Hudutslag (Dennings, 2003; FASS, 2012) Biverkningarna är av sådan art att riskerna med användning av echinocandin B, trots allt får vägas mot behandlingsnyttan. Det finns därför behov av ytterligare kliniska studier som kan avgöra vad som är den lämpligaste kombinationen av antifungala preparat vid behandling av olika patientgrupper. Resistens Vissa svamparter har uppvisat resistens mot substanser som verkar hämmande mot 1,3-β-glukansyntas, normalt verksam som katalyserande subenhet i produktionen av kitin (Lee et al., 2012). Mutationer har visat sig kunna ge upphov till resistens mot echinocandiner. Små förändringar i den gen, FKS1, som kodar för 1,3-β-glukansyntas är i vissa fall tillräckligt för att förhindra framgångsrikt hämmande av enzymet med hjälp av echinocandiner. En punktmutation i genen FKS1 ger en förändring i aminosyrasekvensen (från serin till tyrosin vid position 645) i FKS1 och för dess genprodukt. Förändringen resulterar i okänslighet för inhibering av 1,3-βglukansyntesen när echinocandiner används för detta ändamål (Lee et al., 2012). Den tredimensionella strukturen av 1,3-β-glukansyntas förblir i dagsläget outredd. De faktiska mekanismerna bakom echinocandins minskade affinitet för den muterade formen av 1,3-β-glukansyntas är därför okänd (EBI, 2012). Detta förhållande är givetvis oroväckande och manar till noggrann utredning av doseringsråd för framtida administrering av echinocandin B. Ytterligare en effekt som visat sig in vitrio vid administrering av echinocandiner är en sämre respons vid ökade koncentrationer, trots god respons vid lägre doser. En paradoxal tillväxt av kitin äger rum till följd av förhöjda doser av echinocanider, genom en förmodad överexpression av gener inblandade i kitinsyntesen (Lee et al., 2012). Diskussion Svampar i anamorf livsfas genomgår inte sexuell rekombination. Svampar saknar dessutom de mekanismer för upptag av externt genmaterial, lateral genöverföring (LGT), eller upptag av plasmider, som varit viktiga i samband med utvecklandet av antibiotikaresistens hos bakterier (Madigan et al., 2009; Raven et al., 2005). Möjligen har svampangrepp, mykoser hos människor, historiskt begränsats till följd 5
av befintlig (även kommensal) bakterieflora i kroppen. Det kan inte uteslutas att en ökad användning av antibiotika, brett riktad mot bakterier, i någon mån öppnat för en ökning av humana svampinfektioner. En minskad konkurrens om substrat i och på kroppen kan ha givit opportunistiska arter av (mikro-) svampar en fördel som förskjutit en del av den utbredda infektionsproblematiken till en annan domän, från Bacteria till Eukarya. Referenser Boucher H.W., Groll A.H., Chiou C.C.& Walsh T.J. (2004). Newer Systemic Antifungal Agents Pharmacokinetics, Safety and Efficacy. Drugs 64: 1997-2020 Cockshott A.R. & Hartman B.E. (2001.Improving the fermentation medium for Echinocandin B production part II: Particle swarm optimization. Process Biochemistry 36: 661 669 Denning D. W. (2003). Echinocandin antifungal drugs. The Lancet 362: 1142-51 DiNubile M.J., Motyl M. & Sable C.A. (2004). Caspofungin: the First Licensed Antifungal Drug of the Novel Echinocandin Class. Clinical Microbiology Newsletter 26: 81-85 European Bioinformatics Institute, EBI. www url: http://www.ebi.ac.uk (2012-02-03) Ernst M.E., Klepser M.E., Wolfe E.J. & Pfaller M.A.. (1997). Antifungal Dynamics of LY 303366, an Investigational Echinocandin B Analog, Against Candida ssp. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 26: 125-131 Fass för förskrivare, (2012). www url: http://www.fass.se (2012-01-30) Hector R. (1993). Compounds Active against Cell Walls of Medically Important Fungi. Clinical Microbiology Reviews 6: 1-21 Kanda M., Yamamoto E., Hayashi A., Yabutani T., Yamashita M. & Hiroyuki Honda H. (2010). Scale-up fermentation of echinocandin type antibiotic FR901379. Journal of Bioscience and Bioengineering 109: 138 144 Lee K.K., MacCallum D.M., Jacobsen M.D., Walker L.A., Odds F.C., Gow N.A.R. & Munro C.A. (2012). Elevated Cell Wall Chitin in Candida albicans Confers Echinocandin Resistance In Vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy : 56: 208-217 Madigan M. T., Martinko J. M., Dunlap P. V. & Clark D. P. (2009). Brock Biology of Microorganisms. 12th edition, sid. 802. Pearson Benjamin Cummings, San Francisco. ISBN 978-0-321-53615-0 Rajeshkumar R. & Sundararaman M. (2011). Emergence of Candida spp. and exploration of natural bioactive molecules for anticandidal therapy status quo. Mycoses. doi:10.1111/j.1439-0507.2011.02156.x 6
Rang H.P., Dale M.M., Ritter J.M. & Flower R.J. (2007). Rang and Dale s Pharmacology. sid. 692-697. Churchill Livingstone, Elsevier Philadelphia USA. ISBN 978-0-443-06911-6 Raven P. H., Evert R.F. & Eichhorn S.E.. 2005. Biology of Plants. 7th edition. sid. 260-294. W.H. Freeman and Company, New York. ISBN 0-7167-1007-2 Richardson M.D (2005). Changing patterns and trends in systemic fungal infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 56: 5-11 Samuelsson G. & Bohlin L. (2009). Drugs of Natural Origin: A Treatise of Pharmacognosy. Apotekarsociteten, Stockholm; 6th rev. ed., Sid. 288-290; 542-543. ISBN 978 91 976510 5 9 Wiederhold N.P. & Lewis R.E. (2003). The echinocandin antifungals: an overview of the pharmacology, spectrum and clinical efficacy. Expert Opinion on Investigational Drugs 12: 1313-1333 7