Oral biotillgänglighet av arsenik, antimon och ett urval av metaller i askor

MILJÖRIKTIG ANVÄNDNING AV ASKOR 1056 Oral biotillgänglighet av arsenik, antimon och ett urval av metaller i askor Christel Carlsson, David Bendz, Celia Jones

Oral biotillgänglighet av arsenik, antimon och ett urval av metaller i askor Oral bioavailability of arsenic, antimony and a selection of metals in ashes Christel Carlsson, David Bendz, Celia Jones Q6-634 V:RMEFORSK Service AB 101 53 STOCKHOLM J Tel 08-677 25 80 Juni 2008 ISSN 1653-1248

A"#$%&'$ I denna rapport sammanstrlls kunskaper om oral biotillgrnglighet av metaller och de in vitro metoder som finns fxr dess analys. Vidare rapporteras resultat fr[n en experimentell studie av den gastrointestinalt (magtarmkanal) biolxsliga fraktionen av arsenik, antimon och ett antal metaller i ett urval flyg- och bottenaskor som lagrats mellan 1-13 [r. Den biolxsliga fraktionen av metallerna har bestrmts experimentellt med RIVMs in vitro test och kan anvrndas fxr att konservativt uppskatta oral biotillgrnglig fraktion. Genom att ta hrnsyn till den oralt biotillgrngliga fraktionen av en fxrorening vid berrkningar av hrlsorisker vid intag av aska kan precisionen i riskbedxmningar Xkas. v

S&**&+,&$$+-+. I VRrmeforskprojektet Q4-238 Miljöriktlinjer för askanvändning i anläggningskonstruktioner var halten arsenik och bly kritiska fxr mxjligheten att [teranvrnda vissa askor i konstruktioner a4b. I den berrkningsmodell som anvrndes drr anvrndes totalhalten av metallerna som jrmfxrelsegrund vid bedxmning av hrlsorisk vid intag, vilket kan resultera i att onxdigt konservativa bedxmningar gxrs. Genom att utg[ ifr[n den oralt biotillgrngliga andelen av arsenik och bly i berrkningsmodellen kan en brttre precision i riskbedxmningen gxras och eventuellt resultera i att fler askor kan visa sig vara miljxmrssigt acceptabla fxr anvrndning i anlrggningsbyggande. Syftet med studien var (i) att sammanstrlla kunskap om den oralt biotillgrngliga fraktionen av arsenik, antimon och ett urval av metaller i askor och andra liknande material samt om in vitro metoder fxr bestrmning av oral biotillgrnglighet och (ii) att experimentellt uppskatta oral biotillgrnglighet av arsenik, antimon och ett urval av metaller fxr ett antal fxrbrrnningsaskor genom att bestrmma den gastrointestinalt biolxsliga fraktionen av elementen (d.v.s. de element som kan lxsas ut i mage och tunntarm). De element som undersxktes i studien var antimon, arsenik, bly, kadmium, koppar, krom, nickel och zink. I den litteraturstudie som utfxrdes inom projektet sammanstrlldes bl.a. ett antal statiska och dynamiska in vitro metoder som simulerar mrnniskans gastrointestinala upptag av fxroreningar. Metoderna inneh[ller en eller flera segment, dvs munh[la, magsrck och tunntarm. Av de sammanstrllda in vitro metoderna valdes RIVMs (Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu, NederlRnderna) metod ut fxr att anvrndas i den experimentella delen av studien. FXrdelarna med denna metod var! att metoden i hxg grad liknade mrnniskans gastrointestinala processer (inkluderade munh[le-, mag- och tarmdel)! att metoden var relativt enkel att utfxra jrmfxrt med en dynamisk metod! att metoden kunde inkludera ett anaerobt steg om behov fanns! att metoden kunde inkludera fxda! att kunskap om metodens utfxrande fanns i Sverige! att metoden utvrrderats i en vetenskapligt publicerad jrmfxrande studie. I den laborativa delen av studien undersxktes den gastrointestinala biolxsligheten av antimon, arsenik, bly, kadmium, krom, koppar, nickel och zink i sju utvalda fxrbrrnningsaskor vid tv[ olika partikelstorleksfraktioner (c63 dm och c2 mm) med RIVMs in vitro metod fxr biolxslighet. De tv[ olika partikelstorleksfraktionerna valdes fxr att representera avsiktligt (c2 mm) och oavsiktligt (c63 dm) intag av aska. De undersxkta fxrbrrnningsaskorna kom fr[n olika anlrggningar och representerade olika kategorier av askor m.a.p. typ av aska (flyg- eller bottenaska), panna, brrnsle samt lagringstid. I den experimentella delen undersxktes ocks[ inverkan av elementens totalhalt och typen av aska (flygaska eller bottenaska) fxr storleken p[ den biolxsliga fraktionen, samt betydelsen av partikelstorleksfraktion och asktyp fxr totalhalten av de olika elementen i askorna. vi

Resultaten visade p[ en stor variation hos den biolxsliga fraktionen som var stxrre mellan de olika elementen Rn mellan de olika askorna. Den gastrointestinalt biolxsliga halten var vrsentligt lrgre Rn den totala halten fxr alla undersxkta metaller i samtliga askor, med undantag fxr arsenik i tv[ av de studerade askorna. Den biolxsliga fraktionen av arsenik var hxg b[de i flygaskor (>85%) och i bottenaskor (40-85%). Den biolxsliga fraktionen av bly var ocks[ fxrh[llandevis hxg och varierade mellan 14 och 60% i de olika askorna. Kadmium hade ocks[ en hxg biolxslig fraktion som varierade mellan 50-75% i de studerade askorna. Den biolxsliga fraktionen av krom var mycket lrgre Rn den biolxsliga fraktionen av Xvriga metaller och l[g med ett par undantag under 12%. Den biolxsliga fraktionen av koppar var relativt hxg och varierade mellan 20-70% i askorna. PartikelstorleksfXrdelningen hade endast en inverkan p[ den biolxsliga fraktionen av arsenik, krom och koppar i denna studie, s[dan att den biolxsliga fraktionen av dessa element var stxrre vid den mindre partikelstorleksfraktionen, som representerar ofrivilligt intag. PartikelstorleksfXrdelningen hade Rven en inverkan p[ totalhalten av kadmium, nickel, antimon och zink, med en hxgre totalhalt i den mindre partikelstorleksfraktionen som representerar ofrivilligt intag. Det var drrmed olika element som uppvisade en inverkan av partikelstorleksfxrdelning m.a.p. biolxslig fraktion respektive totalhalt. Totalhalten hade en inverkan p[ storleken av den biolxsliga fraktionen av arsenik, koppar och bly, med en hxgre biolxslig fraktion vid lrgre totalhalt. Typen av aska hade betydelse fxr den biolxsliga fraktionen av arsenik, kadmium, krom och antimon. Av dessa element var den biolxsliga fraktionen av kadmium hxgre i bottenaska jrmfxrt med i flygaska, medan den biolxsliga fraktionen av arsenik, krom och antimon var hxgre i flygaskorna jrmfxrt med i bottenaskorna. Asktypen hade ocks[ en inverkan p[ totalhalten av arsenik, krom, koppar, nickel och zink. Totalhalten av arsenik, krom och zink var hxgre i flygaskor Rn i bottenaskor, medan totalhalten koppar och nickel var hxgre i bottenaskorna Rn i flygaskorna. I denna studie beror drrmed den biolxsliga fraktionen av arsenik p[ b[de partikelstorleksfxrdelningen, totalhalten av arsenik samt typen av aska. Litteraturstudien visade att ytterst lite Rr krnt om oral biotillgrnglighet av metaller i fxrbrrnningsaskor. De resultat som genererats i den experimentella delen av studien f[r drrfxr anses ha stor betydelse fxr de kunskaper som idag finns p[ omr[det. Samtidigt bxr p[pekas att studien omfattar ett litet antal askor och att RIVMs (Rijksinstituut voor volksgesundheid en milieu) in vitro metod som anvrnts fxr att simulera den gastrointestinala biolxsligheten, fxr flera av de undersxkta metallerna inte Rr validerad med in vivo studier, varfxr tolkning av resultaten bxr gxras med fxrsiktighet. Nyckelord: oral biotillgrnglighet, in vitro test, gastrointestinal biolxslighet, arsenik, metaller, partikelstorleksfxrdelning vii

S/**&%0 In an earlier study, financed by VRrmeforsk, Q4-238 Environmental guidelines for reuse of ash in civil engineering applications, the total content of arsenic and lead was shown to determine whether or not reuse of some of the ashes in construction work is feasible a4b. The model used to calculate the guidelines uses the total concentration of metals to evaluate the health risks resulting from exposure to the ashes. The use of total concentration can lead to overly conservative risk assessments if a significant fraction of the total metal content is not bioavailable. Better precision in the risk assessment can be given by the use of the bioavailable fraction of arsenic and lead in the model. As a result, ashes which are rejected on the basis of total metal concentration may be acceptable for use in engineering construction when the assessment is based on the bioavailable fraction. The purpose of the study was to (i) compile information on the oral bioavailability of arsenic, antimony and a selection of metals in ashes and similar materials, and on in vitro methods for determination of oral bioavailability, and (ii) experimentally estimate oral bioavailability of arsenic, antimony and some metals in a selection of ashes by analysis of the gastrointestinal bioaccessibility of these elements. The investigated elements were antimony, arsenic, lead, cadmium, copper, chromium, nickel and zinc. In the literature study performed within the project a number of static and dynamic in vitro methods simulating gastrointestinal processes of contaminants were compiled. The methods include one or several segments, i.e. mouth, stomach and intestine. Among the compiled methods, the RIVM (Rijksinstituut voor volksgesundheid en milieu) in vitro method was used in the experimental part of the project. The advantages with the method was that! the method to a high degree mimicked the human gastrointestinal processes (the method included three segments mouth, stomach, and intestine)! the method was relatively simple! the method could include an anaerobic step if needed! the method could include food! knowledge of the method existed in Sweden! the method had been compared and evaluated in a scientific publication In the experimental part of the study the bioaccessibility of antimony, arsenic, lead, cadmium, chromium, copper, nickel and zinc in seven different ashes at two different particle size fractions (c63 dm and c2 mm) was investigated. These fractions were chosen to represent voluntary (c2 mm) and involuntary (c63 dm) ingestion of ash. The investigated ashes were produced in different incineration plants and represented different categories, i.e. type of ash (fly ash or bottom ash), fuel and incinerator. In the experimental part the influence of total concentration of the elements on their bioaccessibility was also investigated, as well as the influence of particle size fraction on total content of the elements. The influence of type of ash on both bioaccessibility and total concentration of the specific elements was also investigated. viii

The bioaccessible fraction of antimony, arsenic, cadmium, chromium, copper, lead, nickel and zinc in a selection of ashes showed a higher variation between the different elements than between the different ashes. With the exception of arsenic in two of the investigated ashes, the bioaccessible concentration was substantially less than the total concentration of all elements in all ashes. The bioaccessible fraction of arsenic was high both in fly ashes (>85%) and in bottom ashes (40-85%). The bioaccessible fraction of lead was also relatively high and varied between 14 and 60% in the different ashes. Cadmium also had a high bioaccessible fraction which varied between 50-75% in the investigated ashes. The bioaccessible fraction of chromium was much smaller compared to the bioaccessible fraction of the other elements, and was with two exceptions less than 12%. The bioaccessible fraction of copper was relatively high and varied between 20 and 70% in the different ashes. In this study, particle size fraction only had an effect on the bioaccessible fraction of arsenic, chromium, and copper. For these elements, bioaccessibility was higher in the smaller particle size fraction representing involuntary ingestion. Particle size fraction also had an effect on the total concentration of cadmium, nickel, antimony and zinc, with higher total concentrations in the smaller particle size fraction. Total concentration only had an effect on the bioaccessible fraction of arsenic, copper and lead, with higher bioaccessible fractions at lower total concentrations. The type of ash had an influence on the bioaccessible fraction of arsenic, cadmium, chromium and antimony, with a higher bioaccessible fraction of arsenic, chromium and antimony in fly ashes compared to in bottom ashes, and a higher bioaccessible fraction of cadmium in bottom ashes compared to in fly ashes. Type of ash also had an influence on the total concentration of arsenic, chromium, copper, nickel and zinc. Whereas the total concentration of arsenic, chromium and zinc was higher in fly ashes than in bottom ashes, the total concentration of copper and nickel was higher in the bottom ashes compared to in the fly ashes. Thus, the bioaccessible fraction of arsenic in this study depended on particle size fraction, total arsenic concentration and type of ash. The literature study performed within the project revealed that very little is known about oral bioavailability of metals in ashes. The results generated in the experimental part of the project therefore contribute important information to this area of research. However, caution should be used when interpreting the experimental results as the study only included a small number of ashes. In addition, the in vitro model used for analysis of the bioaccessible fraction is not validated with in vivo data for several of the metals investigated. Keywords: oral bioavailability, bioaccessibility, in vitro test, arsenic, metals, particle size fraction ix

1++23455#,6%$2'7+-+. 8 9AK;R=>? OAB SCFEE GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG 8 H I1EEERAE=RSAMMA>SEÄII>1>;LORAI 91OE1II;Ä>;I1;BEE AV ARSE>1KN A>E1MO> OAB EEE =RVAI AV MEEAIIER GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG H HG8 91OE1II;Ä>;I1;BEE L?EF1>1E1O> OAB E1IIÄMO>1>; GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG H HGH FPREKOMSE OAB 91OE1II;Ä>;I1;BEE AV MEEAIIER 1 QOR? OAB AVFAIIGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG R HGS 1> V1ERO MEEO?ER FPR 9ESEÄM>1>; AV 91OIPSI1; FRAKE1O> GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG T HGU VAI AV 1> V1ERO MEEO?GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG 8R S 9ESEÄM>1>; AV 91OIPSI1; FRAKE1O> AV ARSE>1KN A>E1MO> OAB EEE =RVAI AV MEEAIIER 1 EEE A>EAI FPR9RÄ>>1>;SASKOR ME? R1VMS 1> V1ERO MEEO? GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG 8V U SG8 MEEO?9ESKR1V>1>;GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG 8V SGH RES=IEAE GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG HW SGS RES=IEAEA>AICS GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG SW SGU SI=ESAESER GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG SR FORESAEE FO= GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG SV R I1EEERAE=RREFERE>SER GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG SX x

8 9&7.%/+Y Z'3 #0,$2 I VRrmeforskprojektet Q4-238 Miljöriktlinjer för askanvändning i anläggningskonstruktioner a4b utvecklades ett system fxr berrkning av generella riktlinjer med avseende p[ hrlso- och miljxeffekter vid anvrndning av askor i konstruktioner. BedXmningssystemet inkluderade hrlso- och miljxrisker vid spridning av fasta partiklar, hrlsorisk vid intag av grundvatten, miljxeffekter i ytvatten samt hrlsooch miljxeffekter efter avslutad drift av vrgen. De berrkningar fxr hrlsoriskeffekten vid partikelspridning som genomfxrdes visade att intag av grxnsaker, frukt och brr som fxrorenats med damm utgjorde en viktig exponeringsvrg. Totalhalten av arsenik och bly visade sig vara kritiska och kan drrmed vara begrrnsande fxr mxjligheten att [teranvrnda vissa askor i vissa anlrggningar. Enligt vad som framkom i projektet behxvdes kraftiga fxrbrttringar gxras av en del komponenter i modellbeskrivningen fxr att riskbedxmningen skulle bli srkrare. En s[dan komponent Rr bedxmning av hrlsorisk vid oralt intag av aska. I bedxmningssystemet Rr analys av totalhalten den jrmfxrelsegrund som anvrnds fxr att avgxra hrlsoriskerna vid intag av askpartiklar, vilket i de flesta fall Rr ett mycket konservativt m[tt. Andra testmetoder finns tillgrngliga som ger ett m[tt p[ den biotillgrngliga fraktionen vid exponering via inandning eller oralt intag. Syftet med fxreliggande studie Rr att (i) gxra en sammanstrllning av kunskap om den oralt biotillgrngliga fraktionen av arsenik, antimon och ett urval av metaller i askor och andra liknande material samt om in vitro metoder (provrxrsmetoder) fxr bestrmning av gastrointestinalt biolxslig fraktion. (ii) experimentellt uppskatta oral biotillgrnglighet av arsenik, antimon och ett antal metaller fxr ett urval av fxrbrrnningsaskor genom att bestrmma den gastrointestinalt biolxsliga fraktionen av elementen med en utvald in vitro metod baserat p[ steg (i). Den litteraturstudie som utfxrdes inom projektet visade att ytterst lite Rr krnt om oral biotillgrnglighet av metaller i fxrbrrnningsaskor. I denna rapport sammanstrlls drrfxr kunskaper om oral biotillgrnglighet av metaller i jord, samt in vitro metoder fxr bestrmning av biolxslighet av metaller i jord. 1

H I-$$2%&$/%#&**&+#$[55+-+. L O%&5 "-Z$-55.[+.5-.32$ &\ &%#2+-7N &+$-*Z+ Z'3 2$$ /%\&5 &\ *2$&552% I litteratursammanstrllningen representerar samlingsnamnet metaller b[de metaller och halvmetaller. HG8 9-Z$-55.[+.5-.32$ L Y2,-+-$-Z+ Z'3 $-55[*]+-+. Med ett biotillgrngligt Rmne menas ett Rmne som kan tas upp i vrvnaderna hos en levande organism. Hur biotillgrngligt ett Rmne Rr beror p[ ett flertal olika faktorer som t.ex. Rmnets kemiska och fysikaliska egenskaper, det omgivande mediets sammansrttning och individens fysiologi. Ett Rmne kan tas upp i mrnniskan genom oralt intag, inhalering och dermalt upptag. Den vanligaste exponeringsvrgen fxr upptag av metaller Rr genom oralt intag av fxrorenad jord, fxrorenat vatten, via vrxter p[ vilka askpartiklar deponerats p.g.a damning, eller annan fxda. Vid hrlsoriskbedxmningar fxrutsrtts oftast att 100% av mrngden av det intagna Rmnet Rr biotillgrngligt. Detta antagande Rr ofta onxdigt konservativt och kan ge missvisande information om den verkliga hrlsoriskrisken a25b. FXreliggande rapport fokuserar p[ oralt intag och oral biotillgrnglighet hos mrnniskan. Processen fxr upptag av metallfxroreningar vid oralt intag sker p[ samma srtt som fxr nrringsupptaget i stort. I nrstfxljande avsnitt beskrivs mekanismen fxr upptag av nrringsrmnen (inklusive metallfxroreningar) i kroppen och en rad begrepp som rxr oral biotillgrnglighet fxrklaras. HG8G8 KZ%$ Z* *[++-#7&+# +[%-+.#/]]$&. MatsmRltningen sker i mag-tarmkanalen och innefattar nedbrytning och absorption av fxdan. Processen bxrjar redan i munnen drr fxdan sxndertuggas och enzymer i saliven bxrjar bryta ned strrkelsen i fxdan. Efter att maten passerat matstrupen n[r den magsrcken, drr den sura miljxn (ph:1,5-2,0) hjrlper till att sxnderdela fxdan. Hur l[ng tid fxdan stannar kvar i magsrcken beror p[ om den intagits under fastande fxrh[llanden eller inte. Halveringstiden fxr txmning under fasta Rr 8-15 minuter a18ba6b och i Xvriga fall Rr den 0.5-3 timmar a24b a25b. Fr[n magsrcken transporteras fxdan l[ngsamt vidare till tunntarmen drr nedbrytningen fortsrtter med hjrlp av enzymer. HRr sker det mesta upptaget av nrringsrmnen. I tarmarna och i matstrupen Rr ph-vrrdet fxr det mesta neutralt eller svagt basiskt, d.v.s. ph " 7. Till tunntarmen kommer galla fr[n levern och bukspott fr[n bukspottskxrteln, vars roll Rr att finfxrdela fetter respektive neutralisera miljxn och fortsrtta spjrlkningen av makromolekyler. I tunntarmen tas nrringsrmnena upp d[ de absorberas genom tarmvrggen till blodet. VRggytan Rr klrdd med sm[ utskott, s.k. mikrovilli, som Xkar absorptionsytan ca 5 g[nger och p[ s[ srtt fxrbrttrar nrringsupptaget i stor grad. FXr att ett Rmne ska kunna absorberas krrvs att det Rr upplxst, d.v.s. i sin fria form eller bundet till en transportxr, 2

t.ex. lxst i galla. OpolRra organiska Rmnen passerar cellmembranen i tarmen genom diffusion, medan metaller oftast transporteras mellan celler via s.k. intercellulrr transport. Molekylerna diffunderar med eller pumpas mot en koncentrationsgradient genom slemhinnan i tarmvrggen och vidare in i blod- eller lymfkrrlen. HRrifr[n transporteras de till levern, vars roll bl.a. Rr att omvandla och bryta ned frrmmande Rmnen samt lagra blod, jrrn samt ett flertal vitaminer. Fr[n levern kan molekylerna sedan spridas med blodet till diverse organ och vrvnader i kroppen. Till skillnad fr[n organiska fxroreningar som kan metaboliseras i kroppen och drrmed brytas ned, elimineras metaller endast ur kroppen via utsxndring med t.ex. urin, brxstmjxlk eller med galla till avfxringen. Olika metaller har olika utsxndringsmekanismer och olika halveringstider som kan variera mellan n[gon vecka och flera [r. HG8GH O%&5 "-Z$-55.[+.5-.32$ Absolut, oral biotillgrnglighet definieras som den fraktion av en oralt intagen dos som n[r stora kretsloppet (dvs den blodcirkulation som n[r ut i hela kroppen fxrutom lungorna) och kan konceptuellt delas in i tre olika huvudprocesser: 1) utlakning i tunntarmsvrtskan, 2) transport Xver tunntarmen, 3) metabolism/reduktion vid en fxrsta passage Xver levern. Figur 1 beskriver dessa processer fxr jordfxroreningar. Matematiskt kan absolut oral biotillgrnglighet uttryckas som en biotillgrnglighetsfaktor, F, enligt F $ F # F # F b a h Efter oralt intag av jord kan fxroreningarna frigxras delvis eller helt fr[n jorden under matsmrltningen. Den fraktion av fxroreningen som frigxrs fr[n jorden till matsmrltningsvrtskan kallas p[ engelska fxr the bioaccessible fraction, F b. Eftersom ingen riktigt bra svensk XversRttning finns, benrmns denna fraktion den biolxsliga fraktionen i fxreliggande rapport. Denna fraktion anses vara den maximala mrngd av fxroreningen som kan transporteras Xver tunntarmen och kan uppskattas experimentellt med hjrlp av en in vitro metod som simulerar de gastrointestinala fxrh[llandena. Den experimentellt bestrmda fraktionen F b kan anvrndas fxr att (konservativt) approximera den absoluta orala biotillgrngligheten, F. I Figur 1 representerar F a den andel av den i tunntarmsvrtskan utlakade (biolxsliga) mrngden fxrorening som transporteras Xver tunntarmen in i portal[dern eller lymfan. En del fxroreningar kan metaboliseras i tunntarmen eller levern och F h Rr den fraktion av mrngden fxrorening som passerat Xver tunntarmen och levern utan att ha metaboliserats, och som transporteras ut i kroppen av stora kretsloppet och som drrmed kan ha en toxisk effekt p[ vrvnader och organ. 3

INTAG UPPLÖSNING ABSORPTION REDUKTION JORD Mun Mage och tunntarm Membran i mage och tunntarm Membran och lever MÅLORGAN Intagen mängd M Biolöslig mängd M b Absorberad mängd M a Biotillgänglig mängd M h Yttre exponering Biolöslighets faktor F b Absorptions faktor F a Metabolism factor F h Inre exponering Biotillgänglig fraktion: F = F b x F a x F h Figur 1. Konceptuell illustration av de ingående processerna i oralt upptag. Från Grøn [16]. HG8GS F&7$Z%2% #Z* #$0% "-Z$-55.[+.5-.32$ Metallers biotillgrnglighet Rr en funktion av de processer som p[verkar deras lxslighet och rxrlighet i det omgivande mediet. Vid oral exponering finns det inte alltid en korrelation mellan en metalls mobilitet i jord (eller aska) och biotillgrnglighet. IstRllet Rr det primrrt de fysiologiska och kemiska fxrh[llandena i kroppen som kontrollerar metallens biotillgrnglighet. NRr jord (eller aska) kommer ner i den sura miljxn i magen frigxrs metaller och organiska fxreningar som varit associerade med olika oxider, sulfider och karbonater a16b. Hur biotillgrnglig en metallfxrorening Rr bestrms av hur mycket av metallfxroreningen som lxses upp i magen och tunntarmen, och tunntarmens fxrm[ga att absorbera metallen, vilket beror av de kemiska egenskaperna hos metallen, jordmatrisens egenskaper och sammansrttningen hos mag- och tarmvrtskorna. FXr de flesta metaller Rr ph den viktigaste tillst[ndsparametern som styr dess utlakning, (och drrmed biotillgrnglighet) fr[n askor. Detta har visats i flera termodynamiska studier a23b och i studier baserade p[ empiriska data. Oxyanjoner och katjoner uppvisar olika ph-beroende utlakningsmxnster. Den maximala utlakningen av oxyanjoner fr[n aska sker vid ph 8-11 a8b. Katjoner uppvisar ett motsatt ph-beroende i aska s[dant att utlakningen Rr minimal vid ph 8-11 och Xkar vid lrgre ph-vrrden. FXr vissa katjoner kan utlakningen ocks[ Xka vid hxgre ph genom att de bildar lxsliga anjoniska hydroxylkomplex. Det finns ocks[ andra faktorer som p[verkar utlakningen, t.ex, nrrvaro av kloridjoner och lxst organisk kol a38b. En metalls lxslighet kan ocks[ bero p[ redox-potentialen i det omgivande mediet a38b. Effekten av redox-potential fxr utlakningen av metaller i askor Rr srllan kvantifierad 4

eller kontrollerad i samma omfattning som t.ex. effekten av ph. De studier som finns visar dock p[ en stor skillnad i lakbarhet av flera metaller mellan oxiderade och reducerade miljxer. Arsenik, krom och antimon Rr exempel p[ redox-krnsliga Rmnen. Andelen organiskt material i det omgivande mediet kan ocks[ ha betydelse fxr hur lxslig en metall Rr. M[nga metaller kan bilda komplex med organiskt material a38b och drrigenom bli mindre tillgrngliga fxr upptag Xver tarmen. Partikelstorleken hos en jord eller askmatris kan ocks[ ha betydelse fxr hur biotillgrnglig en metall Rr. Eftersom sm[ partiklar har stxrre specifik yta och drrmed hxgre adsorptionskapacitet kan man fxrvrnta sig att sm[ partiklar av en metallfxrorenad jord har hxgre metallinneh[ll Rn stora. Detta har ocks[ visats i flera studier a44b a34b. Sm[ askpartiklar har ocks[ visat sig vara mer reaktiva Rn stora, eftersom den tillgrngliga ytan Rr styrande vid utlakning och upplxsning a5ba3b. Det kunde drrfxr fxrvrntas att den biolxsliga halten av metaller Rven i denna studie skulle vara negativt korrelerad med partikelstorleken. Ljung et al. a22b visade dock i sin undersxkning av sandiga jordar att Rven om totalhalten av metallerna var hxgre i mindre partiklar s[ var inte den biolxsliga fraktionen hxgre vid den mindre partikelstorleksfraktionen. Utlakning av metaller kan Xka med stigande temperatur och drrmed ocks[ p[verka biotillgrngligheten. MetallfXreningar fr[n antropogena krllor Rr oftast mer lxsliga Rn de fr[n naturliga krllor. Studier har visat att metallfxroreningar som befunnit sig i jord lrnge ([ldrade fxroreningar) ofta Rr mindre tillgrngliga a11b. Åldring kan ocks[ p[verka sorptionskapaciteten hos jrrn oxider/hydroxider. Med tiden rekristalliseras jrrnoxiderna till en mera ordnad struktur och dess ytor minskar. Denna ombildning och minskning av sorptionsplatsdensitet kan leda till Xkad mobilitet av arsenik. Men [ldring kan ocks[ leda till att sorberade metalljoner inkorporeras i strukturen vid [terkristallisering. Ainsworth et al. a2b fann indikationer p[ att [ldrandet av jrrnoxid/hydroxider kan leda till l[ngsam desorption fxr Co, Cd och Pb beroende p[ den Rndrade kristalliseringsstrukturen. HGH 9-Z56#5-.32$ - ^Z%Y En metalls biolxslighet beror delvis av i vilken kemisk form den fxreligger, och en rad olika faktorer styr detta, bl.a. jordens egenskaper. I Tabell 1 finns en sammanstrllning av litteraturuppgifter p[ biolxslighet i jord fxr de metaller som undersxktes experimentellt i fxreliggande arbete. I underkapitlen ges ocks[ en kortare beskrivningar av de olika metallernas egenskaper i jord. 5

Tabell 1. Gastrointestinal biolöslighet av metaller i jord. Metall Biolöslig fraktion (%) Antimon Inga granskade publikationer kunde hittas Arsenik 3-50% (jord, sammanställning i [21]) 10-29% (sandiga jordar, [22]) 12% (jord från gruvområde, [7]) 66% (standard ref jord, [10]) 1-95% (olika jordar, olika in vitro metoder, [28]) Bly 1-91% (olika jordar, olika in vitro metoder, [28]) 10% (standard ref jord, [10]) 0,18% (jord från gruvområde, [7]) 1-25% ((sandiga jordar, [22]) 1-73% (jord, sammanställning i [21]) Kadmium 5-99% (olika jordar, olika in vitro metoder, [28]) 15-50% (sandiga jordar, [22]) 38-68% (Cd-förorenad jord, [33]) Koppar Inga granskade publikationer kunde hittas. Krom 5-70% (olika Cr-förorenade jordar, [36, 37]) Nickel <=10% (sandiga jordar, [22]) Zink Inga granskade publikationer kunde hittas. HGHG8 A+$-*Z+ Dagens kunskaper om fxrekomstformer och biotillgrnglighet av antimon i jord Rr bristfrllig. Enligt Adriano a1b Rr Sb III O x den mest troliga formen som upptrrder i jord. Antimon upptrrder geokemiskt som arsenik. Inga av oss idag krnda granskade vetenskapliga publikationer behandlar in vitro studier av gastrointestinal biolxslighet av antimon. HGHGH A%#2+-7 De vanligaste fxrekomstformerna av arsenik Rr oorganiska oxyanjoner av As(III) och As(V) a1b. LXsligheten Rr hxg vid neutrala fxrh[llanden och minskar med sjunkande ph. Dessa lxslighetsegenskaper Rr de omvrnda jrmfxrt med vad som generellt grller fxr m[nga joner av metaller och metalliknande Rmnen. De oorganiska formerna Rr generellt sett mer rxrliga i marken Rn de organiska och utgxr drrmed stxrre risk fxr att transporteras till yt- och grundvatten. Den femvrrda formen av arsenik, dvs arsenat, dominerar vid aeroba fxrh[llanden medan den trevrrda och mera mobila formen, arsenit, dominerar vid sjunkande redox och phc 9,2 a43b. Oorganisk arsenik Rr carcinogent b[de vid inhalering och oralt upptag. Arsenit har hxgre akut toxicitet Rn arsenat, men den kroniska toxiciteten Rr densamma fxr all oorganisk arsenik oavsett valenstal. 6

Enligt den sammanstrllning som gjorts av Ljung a21b visar resultat fr[n in vitro tester av jord en stor variation i gastrointestinal biolxslighet beroende p[ typ av jord och fxroreningssituation (t.ex. halter, [lder och speciering av element). Den biolxsliga fraktionen av arsenik i denna sammanstrllning varierar mellan 2,7-50 %. BiolXslighet av arsenik analyserad med RIVMs in vitro metod har i jord fr[n lekplatser i urban miljx tidigare funnits variera mellan 9,7 och 28,7% beroende p[ partikelstorlek och mrngd jord som anvrnts i testet a22b. Med andra in vitro metoder har biolxslig fraktion i jord uppmrtts till 12% a7b och 66% a10b. Storleken p[ den biolxsliga fraktionen beror p[ jordens egenskaper, i vilken mineralform arsenik fxreligger, jordens fxroreningsgrad m.m. Arsenik fr[n antropogena krllor Rr vanligen mer biolxsliga Rn fr[n naturliga krllor a15b. Arsenik ses ofta ha hxgre biolxslighet och mobilitet jrmfxrt med andra Rmnen, vilket kan fxrklaras av att arsenik fxrekommer som oxyanjoner och Rr mobilt Xver ett brett redoxintervall och vid vanligt fxrekommande ph-vrrden i grundvatten (ph 6.5-8.5). Detta faktum gxr arsenik till en av de mest problematiska fxroreningarna i miljxn a35b. Den biolxsliga fraktionen arsenik kan ocks[ variera beroende p[ vilken in vitro metod som anvrnds. Vid en jrmfxrelse av den biolxsliga fraktionen av arsenik i tre olika jordar med fem olika in vitro metoder a28b varierade den mellan 6-95%, 1-19% och 10-59% i de tre olika jordarna beroende p[ vilken in vitro metod som anvrndes. De olika metoderna skildes [t med avseende p[ ing[ende segment i modellen (magdel, termdel etc.), ph i mag/tarm-vrtskor, L/S-vRrde, nrrvaro av enzymer och proteiner i vrtskorna, omrxrningshastighet, inkubationstid, nrrvaro av fxda m.m. Det Rr fxr nrrvarande inte utrett i vilken omfattning dessa olika faktorer p[verkar den biolxsliga fraktionen av arsenik. HGHGS 950 Bly fxrekommer i miljxn i Xver 200 olika mineraler med stor variation av lxslighet, men endast ett f[tal fxreningar Rr vanliga a1b. S[dana som bildas vid l[gt ph, t.ex. blysulfat (PbSO 4 ) och jrrnblysulfat (FePbSO 4 ), Rr mer stabila i den sura miljxn i magsrcken och drrmed mindre biolxsliga Rn de som bildats under basiska fxrh[llanden, t.ex. blyoxid (PbO) och blykarbonat (PbCO 3 ) a31b. Organiska former av bly fxrekommer srllan i miljxn, eftersom de har en benrgenhet att bilda oorganiska komplex genom [ldring a27b. Den mest toxiska formen som fxrekommer i avfall Rr Pb(II) a1b. Oral biotillgrnglighet av bly i jord har studerats med b[de in vivo och in vitro metoder i stxrre omfattning Rn andra metaller. Ett flertal faktorer avgxr hur biolxsligt bly Rr. Det r[dande ph-vrrdet i magsaften har visats ha stor betydelse fxr utlakningen av bly, vilken minskade med 65% nrr ph i magen Xkade fr[n ph 1,3 till 2,5 i en studie av Ruby et al. a30b. Vid en jrmfxrelse av den biotillgrngliga fraktionen av bly i tre olika jordar med fem olika in vitro metoder a28b varierade den mellan 4-91%, 1-56% och 3-90% i de tre olika jordarna beroende p[ vilken in vitro metod som anvrndes. De olika metoderna skildes [t med avseende p[ ing[ende segment i modellen (magdel, tarmdel etc.), ph i mag-tarmvrtskor, L/S-vRrde, nrrvaro av enzymer och proteiner i vrtskorna, omrxrningshastighet, inkubationstid, nrrvaro av fxda m.m. :ven i denna studie tillskrevs den stora variationen i biolxslighet frrmst bero p[ skillnader i ph mellan de olika metodernas lakvrtskor. Barn har oftare lrgre ph i magen Rn vuxna och kan 7

absorbera mer bly Rn vuxna a1b. MRnniskans [lder har allts[ betydelse fxr upptag av bly. HXgre absorption kan ocks[ fxrekomma vid brist av jrrn och kalcium a19b. HGHGU K&Y*-/* Den vanligaste och mest toxiska formen av kadmium som fxrekommer i jord Rr Cd(II) a1b. Kadmium fxreligger i jorden som Cd(II) och fxrekommer i flera kemiska former i miljxn fr[n mindre lxsliga sulfider (CdS) till mer lxsliga karbonater (CdCO 3 ) men ocks[ bundet genom kanjonbyte till jorden i jonisk form. otterst f[ in vivo studier av biotillgrnglighet har genomfxrts fxr kadmium, vilket fxrsv[rar jrmfxrelse och vrrdering av in vitro resultat. Oral absorption (upptag Xver tarmen) av kadmium har visats mycket l[g i vissa studier, ca 1-8 % a19b men det finns studier som visar att absorptionen kan Xka vid underskott av jrrn och kalcium a33b. I en studie av Ljung et al. a22b varierade den biolxsliga fraktionen av kadmium, analyserad med RIVMs in vitro test, i 25 icke-fxrorenade sandiga jordar mellan 15-50%. I en annan studie a33b varierade den biolxsliga fraktionen av kadmium mellan 38 och 63% beroende p[ om mat fanns nrrvarande eller ej i mag-tarmvrtskan. Vid en jrmfxrelse av den biolxsliga fraktionen av kadmium i tre olika jordar med fem olika in vitro metoder a28b varierade den biolxsliga fraktionen av kadmium mellan 7-92%, 5-92% och 6-99% i de tre olika jordarna beroende p[ vilken in vitro metod som anvrndes. De olika metoderna skilde sig [t m. a. p. ett antal faktorer (se kapitel 3.3) varav ph tillskrevs ha stxrst betydelse fxr skillnaderna i biolxslig fraktion kadmium (dvs som fxr bly i samma studie). HGHGR KZ]]&% I vatten fxrekommer koppar vanligen som katjon, Cu 2+, men ocks[ som hydroxider eller karbonater a1b. Koppar komplexbinder ocks[ till organiskt material. Den vanligaste fxrekomstformen av koppar i jord Rr som kopparsulfid i blandning med jrrn (CuFeS 2 ). Koppar Rr ett essentiellt element men toxiskt vid hxgre doser. I dag finns det inga fxr oss krnda in vitro studier av biolxslig fraktion av koppar i granskade vetenskapliga publikationer. HGHG_ K%Z* Krom existerar i jord som trivalent krom, Cr(III), och som hexavalent krom, Cr(VI), drr hexavalent krom Rr mer mobilt Rn trivalent krom a19b. Under oxiderande fxrh[llanden existerar Cr(VI) frrmst som oxyanjonerna bikromat (HCrO 4- ) och kromat (CrO 4 2- ) vilka Rr mobila i de flesta jordar under lrtt sura till alkaliska fxrh[llanden. Under reducerande fxrh[llanden Rr krom drremot relativt immobilt vid neutralt ph eftersom Cr(III) lrtt frller som sv[rlxslig oxid. Kroms mobilitet kontrolleras ocks[ av den organiska halten, fosfat och sulfat som konkurrerar med krom om sorptionsplatser. Cr(III) betraktas som ett essentiellt sp[rrmne medan Cr(IV) Rr toxiskt redan vid l[ga koncentrationer a20b. Cr(VI) har hxg mobilitet vid hxga ph-vrrden. Cr(VI) Rr mer biotillgrngligt Rn Cr(III). Trots detta pekar mycket p[ att Cr(VI) kan reduceras till Cr(III) i den sura och aneroba 8

miljxn i magsrcken hos mrnniskan, vilket p[ s[ srtt kan minska dess biotillgrnglighet a27b. I en in vitro studie av den biolxsliga fraktionen av krom i tv[ olika fxrorenade jordar varierade den mellan 5-70% fxr b[de Cr(III) och Cr(VI). Variationen kunde fxrklaras av skillnader i jordtyp, oxidationstal och totalkoncentration krom a36b. Ju hxgre total kromhalt i jorden desto lrgre var den biolxsliga fraktionen. Samma studie visade ocks[ att krom som f[tt [ldra i jorden har lrgre biolxslig fraktion Rn krom som funnits i jorden endast kort tid. I samma in vitro studie som ovan a22b var den biolxsliga fraktionen av krom i 25 icke-fxrorenade sandiga jordar betydligt lrgre och under 5%. HGHGV >-'725 Nickel fxrekommer oftast som Ni(II), vilken ocks[ Rr den mest toxiska formen a1b. Metallen kan existera i mindre lxsliga former, t.ex. som sulfider (NiS) och fosfater (Ni(PO 4 ) 2 ) men Rven i mer lxsliga varianter, t.ex. karbonater (NiCO 3 ). I jord Rr nickel oftast bundet genom katjonbyte till organiskt material, jrrnhydroxider och lermineral. I en studie av Ljung et al. a22b var den biotillgrngliga fraktionen mindre Rn 10% i samtliga 25 undersxkta sandiga jordar. HGHGX `-+7 Zink fxrekommer huvudsakligen i naturliga vatten som katjon (Zn 2+ ), men bildar komplex med karbonater och hydroxider a1b. Den vanligaste fxrekomstformen i jord Rr som zinksulfid (ZnS), men kan ocks[ fxreligga som zinkfosfat, zinkhydroxid och zinkkarbonat vars lxslighet Xkar med minskande ph. Zink Rr ett essentiellt Rmne och har relativt l[g toxicitet jrmfxrt med andra metaller. Idag finns det inga av oss krnda in vitro studier av biolxslighet av zink i granskade vetenskapliga publikationer. HGS 1+ \-$%Z *2$ZY2%,6% "2#$[*+-+. &\ "-Z56#5-.,%&7$-Z+ Eftersom bestrmning av biotillgrnglighet i djurstudier s.k. in vivo metoder Rr b[de dyra och tidsxdande har olika in vitro metoder utvecklats fxr att bestrmma biolxslig fraktion av metaller. Gemensamt fxr dessa in vitro metoder Rr att de simulerar fxrh[llandena i matsmrltningsorganen hos mrnniskor, d.v.s. in vivo biotillgrnglig fraktion. HGSG8 K%&\ ]4 2+ -+ \-$%Z *2$ZY FXr att en in vitro metod ska vara tillrmplig bxr den baseras p[ mrnniskans fysiologi och helst p[ den hos ett barn, eftersom risken fxr direkt kontakt via hand till mun Rr stxrst fxr den hrr gruppen. Dessutom bxr den av srkerhetsskrl simulera vrrsta trnkbara scenario, d.v.s. hxgsta mxjliga biolxslighet av Rmnet a28b. Enligt Grrn och Andersen a15b finns det en rad generella Xvergripande krav som en in vitro metod bxr uppfylla fxr att kunna anvrndas vid bestrmning av biolxslighet. Den bxr t.ex. vara: 1) reproducerbar (d.v.s. analys av ett prov ska ge samma resultat i olika laboratorium) 2) repeterbarhet 9

(samma resultat ska kunna uppn[s flera g[nger fxr samma prov i samma laboratorium) 3) enkel (proceduren ska inneh[lla s[ f[ steg som mxjligt) 4) tolkningsbar (d.v.s. resultaten m[ste kunna korreleras vrl med resultat fr[n in vivo fxrsxk) 5) heltrckande (d.v.s. till[ta analys av ett s[ brett spektra som mxjligt av fxroreningar, jordar etc) 6) konsekvent (d.v.s. testresultaten ska XverensstRmma med processer som fxrutsp[tts utifr[n kunskaper om jordkemi och speciering av fxroreningen). HGSGH E-55.[+.5-.& *2$ZY2% Existerande metoder som bygger p[ mrnniskans fysiologi kan delas upp i tv[ typers (i) statiska metoder som utfxrs i brgare eller (ii) dynamiska metoder som genomfxrs i genomflxdes-reaktorer a39b. Den senare varianten tar hrnsyn till den gradvisa txmningen av intagna fxdormnen i mag-tarmkanalen. Endast ett f[tal dynamiska tekniker har utvecklats, varav en s[dan Rr TIM (se nedan). En in vitro metod som simulerar mrnniskans upptag av fxroreningar, kan inneh[lla mellan 1-3 segment, dessa Rr munh[la, magsrck och tunntarm. De flesta metoder Rr statiska mag-tarmmodeller, som simulerar fxroreningens vrg fr[n munnen till tunntarmen a28b. Den kemiska sammansrttningen i mag-tarmkanalen Rr komplicerad och sv[rt att efterlikna, eftersom den varierar med individens [lder, hrlsa m.m. FXrekomst av fxda i mag-tarmkanalen, d.v.s. om personen har Rtit eller Rr fastande p[verkar ocks[ de kemiska fxrh[llandena. Grrn a16b har identifierat n[gra fxrh[llanden som anses srrskilt viktiga att efterlikna i en in vitro metod:! Buffrad sur miljx i den simulerade magsrcken (phc2)! Buffrad svagt basisk miljx i den simulerade tarmdelen (ph>7)! Aeroba fxrh[llanden fxljt av anaeroba fxrh[llanden fxr att simulera magrespektive tarmdel.! Tillsatser av enzymer, proteiner och galla.! NRrvaro av mat (t.ex. mjxlkpulver) fxr att simulera fxda.! LRmplig verkningstid i varje delmoment, fxrslagsvis 3 timmar i magdelen, 10 h i tarmdelen.! L/S>100 fxr stabilitet, d.v.s. andel vrtskevolym i fxrh[llande till massa fast material i fxrsxket > 100. FXrh[llandet mellan vrtska och fast fas i tillgrngliga metoder varierar fr[n 2,5:1 till 5000:1. FXr att spegla den i mag-tarmsystemet hos ett 2-3 [r gammalt barn, bxr L/SfXrh[llandet vara ca 100:1 a39b. Det finns i dagslrget ingen in vitro metod som omfattar samtliga ovan nrmnda punkter. Vanligtvis inkluderas inte heller mikrobiell aktivitet i mag-tarmsystemet eller aktiv transport av fxroreningar i en in vitro studie. :ven dessa faktorer kan vara viktiga fxr upptag av fxroreningar och innefattas i in vivo data. D[ ingen metod kan efterlikna den mrnskliga matsmrltningsfysiologin i sin helhet blir valet av testmetod en kompromiss mellan Rmnets kemiska egenskaper, matsmrltningsfysiologin, praktiska begrrnsningar och resultatens tilltrnkta anvrndningsomr[de. Tabell 2 visar en sammanstrllning av n[gra befintliga in vitro metoder. Metodernas konstruktion och tillrmpningsomr[de beskrivs mer detaljerat lrngre fram. FXr att en in vitro metod ska vara relevant att 10

anvrnda fxr att simulera in vivo resultat m[ste det finnas ett signifikant samband mellan in vitro data och in vivo data. De olika in vitro metoderna som nrmns nedan har oftast endast validerats fxr enstaka metaller. HGSGHG8?1> DIN (Deutsches Institut ftr Normung) Rr en tysk metod som anvrnds fxr att mrta biolxslighet av b[de organiska och oorganiska Rmnen. I metoden ing[r simulering av magsrck och tunntarm. I vissa fall inkluderas Rven saliv fxr att simulera ett fxrsta steg i munh[lan. Proceduren kan utfxras b[de med och utan tillsats av fxda (mjxlkpulver). DIN har frrmst anvrnts fxr analys av biolxslighet i jord, men en rad andra medier har ocks[ undersxkts med metoden, bl.a. flygaska, blrstringssand och avloppsslam a9b Metoden rekommenderas vid bestrmning av biolxslighet av bly, kadmium, nickel och arsenik a16b. HGSGHGH 1V; IVG (In vitro gastrointestinal method) har utvecklats av Rodriguez et al. a32b fxr bestrmning av biolxslig fraktion av arsenik i jord och avfall a39b. Metoden Rr en tv[stegsextraktion med mag- och tarmdel som kan utfxras b[de med och utan tillsats av fxda. IVG har hittills validerats mot in vivo data fxr bly, arsenik och kadmium. FXr att kunna mrta biolxslighet av arsenik i jord och annat fast material har en variant av IVG utvecklats som kallas IVG-AB. Den skiljer sig fr[n den ursprungliga metoden i det att lakvrtskan i IVG-AB Rven inneh[ller en jrrnhydroxidgel fxr att simulera upptag Xver tunntarmen av arsenik. HGSGHGS M9 MB (massbalans) Rr en trestegsextraktion som innefattar simulering av munh[la, magsrck och tunntarm a17b. Det som frrmst skiljer metoden fr[n andra, Rr att koncentrationen av metallen som testas dels mrts i varje extraktionssteg, men Rven i den jord som finns kvar efter extraktionerna, vilket gxr att en massbalans kan berrknas fxr de element som undersxks. MB har anvrnts fxr bestrmning av biolxslig fraktion av arsenik, bly, kadmium och krom. Vid en jrmfxrande studie av tillgrngligt bly i mrnniskor efter intag av jord (in vivo) visade sig extraktion av samma jord med MB-metoden ge n[got hxgre vrrden a17b. Detta kan tolkas som att MB Xverlag ger n[got hxgre lxslighet av metaller, troligtvis p.g.a. den sura miljxn i magdelen a39b. HGSGHGU O9EE PBET (Physically Based Extraction Test) Rr en tv[stegsextraktion som simulerar fxrh[llandena i mag-tarmkanalen hos ett litet barn. Ing[ende delar Rr mage och tunntarm. PBET har visat p[ en god korrelation till in vivo data fxr bly och arsenik a16b. 11

En mxjlig nackdel med PBET Rr att den inte tar hrnsyn till eventuell fxrekomst av fxda. En annan begrrnsning Rr att metoden har visat sig sv[r att tillrmpa p[ ett stort antal prov. Olika fxrsxk till vidareutvecklingar har gjorts i syfte att ta fram en mer reproducerbar och fxrenklad version som kan anvrndas fxr stxrre antal prov, se avsnitt 4.2.6. HGSGHGR R1VM RIVMs in vitro metod fxr biolxslighet har utvecklats vid National Institute of Public Health and the Environment i NederlRnderna. Metoden Rr en trestegsextraktion som simulerar matens vrg genom munh[lan, magsrcken och tunntarmen. RIVMs in vitro metod existerar i tv[ varianter, en utan tillsats av fxda fxr oorganiska Rmnen samt en med fxda fxr organiska Rmnen. Metoden har anvrnts fxr att bestrmma biolxslighet av bly, men har visat p[ d[lig korrelation till in vivo studier a16b. Enligt Grrn a16b kan den variant av RIVM som simulerar intag under fasta, ge d[lig korrelation med in vivo data p.g.a. det hxga ph-vrrdet i tunntarmsdelen. Om tunntarmssimuleringen i RIVMs metod exkluderades visade in vitro och in vivo data god linjrr korrelation a16b. RIVMs ursprungliga metod beskrivs dock ge ett realistiskt vrrde p[ vrrsta trnkbara biolxslighet. 12

Tabell 2. In vitro metoder för bestämning av biolöslig fraktion (Modifierad från Wragg & Cave, 2003 [39]) M2$ZY Typ Segment L/S kvot Tid Överskott av syre ph Tillsats av föda Temperatur PBET 1 Batch Magsäck Tunntarm 100 1 h 4 h Nej, argon 2,5 7 Nej 37 %C 37 %C SBRC 2 Batch Magsäck Tunntarm* 1,5 1 h Nej 1,5 Nej 37 %C MB 3 Batch Munhåla, Magsäck Tunntarm 160 2000 4400 5 s 2 h 2 h Ja Nej omgivningens 37 %C 37 %C DIN 4 Batch Munhåla* Magsäck Tunntarm 15 50 100 30 min 2 h 6 h Ja 6,4 2 7,5 Valfritt 37 %C 37 %C 37 %C RIVM 5 Batch Munhåla Magsäck Tunntarm 15 37,5 97,5 5 min 2 h 2 h Ja 6,5 1,1 5,5 Båda varianter finns 37 %C 37 %C 37 %C IVG 6 Batch Magsäck Tunntarm* 150 150 1 h 1 h Nej, argon 1,8 5,5 Valfritt 37 %C 37 %C SHIME 7 Batch Magsäck Tunntarm Tjocktarm* 2,5 4 3 h 5 h Ja 5,2 6,5 Ja 37 %C 37 %C TIM 8 Column Munhåla Magsäck Tunntarm 5 30 51 5 min 1,5 h 6 h Ja 5 2 7,5 1 Physiologically Based Extraction Test method 2 Solubility/Bioavailability Research Consortium method developed from PBET 3 Mass balance [38] 4 Deutches Institute fur Normung (DIN 19738) 5 National Institute of Public Health and the Environment, The Netherlands 6 In vitro gastrointestinal method [32] 7 Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystems of Infants 8 TNO gastrointestinal model * Valfritt segment som kan inkluderas I metoden Ja 37 %C 37 %C 37 %C HGSGHG_ S9RA SBRC st[r fxr Solubility/Bioavailability Research Consortium. Gruppen har tagit fram en metod fxr bestrmning av biolxslighet av metaller i jord. SBRC-metoden Rr en fxrenklad variant av PBET och kallas Rven Drexler-metoden a16b. Det finns tv[ varianter av SBRC. I den ena ing[r simulering av fysiologin av mag- och tarmdelen, medan den andra varianten endast inkluderar magdelen hos mrnniskan. Ingen fxda tillsrtts i n[gon av modellerna. Den senare modellen benrmns SBET (Simple Bioaccessibility Extraction Test) och inneh[ller endast ett extraktionstest vilket gxr den relativt enkel och passar fxr studier med ett stort antal prover. 13

UtmRrkande fxr SBRC Rr att tyngdpunkten lagts p[ god korrelation mellan in vivo biotillgrnglighet och in vitro biolxslighet. Studier har ocks[ visat att resultat fr[n den hrr metoden haft bra korrelation med vrrden fr[n in vivo undersxkningar med grisar a31b. SBET anvrnds utbrett i USA fxr kadmium, bly och arsenik och rekommenderas fxr nickel, medan SBRC med b[de mag- och tarmdel rekommenderas vid bestrmning av biotillgrnglighet av krom och kvicksilver a16b. Metoden ger vrrden fxr vrrsta trnkbara scenario (dvs maximal biotillgrnglighet). HGSGHGV SB1ME SHIME (Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystems of Infants) Rr en metod som anvrnds vid Vitoinstitutet i Belgien fxr studier av fxrorenad mark. Modellen innefattar simulering av magsrck och tunntarm, i vissa fall inkluderas Rven tjocktarm i modellen genom att mikroflora tillsrtts a28b. Metoden g[r att anvrnda b[de med och utan tillrgg av fxda. I det senare fallet tillsrtts grrdde fxr att imitera nrringsupptag hos sm[ barn. Proceduren utfxrs vanligtvis i en reaktor, men den kan ocks[ utxkas till flera vilket ger en dynamisk metod. Metoden har frrmst anvrnts fxr bly, men Rven arsenik och kadmium har testats med SHIME. HGSGHGX E1M TIM (TNO gastrointestinal model) Rr en datorstyrd, dynamisk in vitro modell med simulering av magsrck och tunntarm. FXdans vrg genom mag-tarmkanalen simuleras Xver tid vid fxrh[llanden som r[der efter intag av en halvflytande m[ltid a28b. Reglering av ph-niv[ sker genom att syra pumpas in i magsrckssektionen och lut i tunntarmssektionen. TIM skiljer sig fr[n de flesta metoder genom att magdelen successivt txms p[ provet under det att ph-vrrdet sjunker fr[n 5 till 2. Detta fxr att simulera hur ph-niv[n hxjs vid intag av fxda fxr att sedan [terg[ till normalt ph. Ett flertal extraktionsfraktioner mrts under hela proceduren som totalt tar ca 7,5 timmar. HGSGS Q[*,6%25#2 &\ -+ \-$%Z *2$ZY2% Vid en jrmfxrelse av fem krnda in vitro metoder utfxrd av BARGE (the Bioavailability Research Group Europe) visades de metoder som endast omfattar simulering av magsrcken ge hxgre biolxslighet Rn de som Rven inkluderar en tarmdel a28b. Orsaken Rr sannolikt det l[ga ph-vrrdet i magsrcken. En statisk magmodell (SBET), tre statiska mag-tarmmodeller (DIN, RIVM och SHIME) samt en dynamisk mag-tarmmodell (TIM) anvrndes fxr att testa biolxslighet i tre jordar fxrorenade av bly, arsenik och kadmium. Teknikerna valdes eftersom de i stor utstrrckning anvrnds av BARGE, vars m[l Rr att etablera tillvrgag[ngssrtt fxr att bestrmma biotillgrnglighet vid platsspecifika riskbedxmningar. Studien visade att SHIME genomg[ende gav lrgst biolxslighet, medan SBET resulterade i hxgst vrrden. FXrklaringen Rr sannolikt att fxrekomsten av fxda i SHIME hxjer ph-vrrdet, vilket i sin tur leder till lrgre lxslighet och drrfxr hxgre biolxslighet. SBET [ andra sidan inneh[ller ingen tarmdel med hxgre ph i fxrh[llande 14