Redovisning av Fiskevårdsmedel för: pilotprojekt avseende spridning av PKD, proliferativ njurinflammation hos laxfisk till norra Sverige Anders Alfjorden och Anders Hellström Enhet för djurhälsa och antibiotikafrågor Fisksektionen Enligt Fiskeriverkets beslut 2009 (Fiskerivårdsmedel anslaget 1:17; fiskevård 24-899-09) har Fisksektionen vid enheten för djurhälsa och antibiotikafrågor vid SVA, under år 2009, undersökt lax och öring avseende förekomst av parasiten Tetracapsuloides bryosalmonae, orsak till njursjukdomen PKD. Spritfixerade fiskar har insamlats av länsstyrelserna i Jämtland och Västerbotten, och undersökts vid SVA avseende sjukdomsförekomst (svullna njurar). I samband med detta har en PCR metod tagits fram och värderats. Referensmaterial för denna har införskaffats från Norska Veterinærinstituttet (Anders Jörgensen) i Oslo. Metodik Insamlingen av fisk från länsstyrelserna i Jämtland och Västerbotten har pågått under sensommaren/ hösten 2009. Då det under perioden har varit höga vattenflöden så försvårades möjligheterna att samla in laxfisk i ålder 0+ och 1+. Provfiskena blev därför fördröjda men kunde avslutas under oktober månad då en tillräcklig mängd fiskar insamlats. Fiskarna som var 1+ eller äldre har öppnats i buken för att underlätta fixeringen med 95% etanol. Total har mer än 300 öringar från 5 områden i Jämtand och 7 områden i Västerbotten undersökts. Undersökning och materialuttag av insända fiskar genomfördes av fisksektionen/sva genom yttre och inre besiktning samt mätning av kroppslängd. Prov från njure togs ut för molekylärgenetisk undersökning (PCR) och individmärkta prover insamlades för ev. kompletterande immunohistologisk undersökning från gälar och njure. För de minsta fiskarna 0+ var njurmängden ofta så liten att merparten av proverna förbrukades till PCRundersökningen. I de fallen försvårades en kompletterande undersökning genom immunohistologi beroende på otillräcklig njurmängd för denna undersökning. En ny diagnostikmetod (realtids-pcr) har tagits fram genom samarbete med SVA s sektion för virologi, immunbiologi och parasitologi (VIP). Metoden är utarbetad med stöd av forskningsrapporter om PKD, Bettge et. Al. 2009 (ref 1 och 2). Det positiva referensmaterialet från Veterinärinstittuet samt organmaterial från frysta och spritfixerade fiskar (0+), negativa såväl som positiva för sjukdomen, njure och gäle, har använts för att validera metodens tillförlitlighet. Ett begränsat urval av de i Sverige insamlade fiskarna som var positiva för sjukdomen med den framtagna PCR metoden har också kontrollerats gentemot en immunohistologisk metodik som kunnat verifiera resultaten (se nedan). Den framtagna PCR-metoden har även testats med ett förenklat alternativt provtagningsförfarande (bomullstops), anpassad för insamling i fält. Samtliga varianter på
prover har visats fungera för diagnostik avseende sjukdomen PKD. Bäst resultat har dock erhållits genom undersökning av etanolfixerade njurprover, varför beslut togs att fältinsamlade fiskar skulle spritläggas och att prover i första hand tas ut från njuren. Öringar och laxar från fältundersökningarna har alltså fixerats i 95% etanol. En erfarenhet från fältinsamlingen är att ej placera för många och för stora fiskar i ett insamlingskärl då detta kan leda till för stora sänkningar av etanolkoncentrationen och därigenom en nedbrytning av organvävnad innan lösningen trängt in i tillräcklig omfattning. Provuttag och analys av prover: i samband med provuttag har fiskarna märkts löpnummervis och längdbestämts. Organprover har uttagits individuellt med engångsmaterial, en omgång instrument per fisk, för att säkerställa att kontamination ej sker. Uttagna njurprover för realtids PCR förvarades frysta och prover för kompletterande immunhistologi (gäle och främre del njure) har förvarats i ependorfrör med 95% etanol. Undersökningar med Realtids PCR har genomförts på SVAs diagnostiska enhet för virologi, immunbiologi och parasitologi (VIP). Metoden har utförts enligt en standardiserad metod och rutinerna är anpassade att fungera på samma vis som för övriga prover som inkommer till denna diagnostiska enhet. Detta minskar risken för felkällor samt att prover kan köras av den personal som rutinmässigt utför dessa analyser med realtids-pcr. För att ytterligare kontrollera metodiken och resultaten, se ovan så har också ett urval positiva fall av insamlade prover kontrollerats med rutinmässigt använd immunhistologisk metodik som brukar användas för att diagnosticera sjukdomen PKD. Denna baseras på mikroskopisk undersökning av fixerade prover. Samma ursprungsmaterial (spritfixerad njurvävnad) har använts till detta. Proverna har bäddats in i paraffinblock och snittats upp på objektglas. Proverna har därefter märkts med antikroppar riktade med T. bryosalmonae (PKD) varefter dessa i sin tur färginmärkts för analys i mikroskop. I den ursprungliga ansökan avsågs alla positiva prover testas med denna metod, men då erhållna forskningsmedel minskat med 1/3-del, har detta endast kunnat genomföras på ett mindre antal prover. Resultat och diskussion. Resultatet från utförda undersökningar sammanställs i tabell sist i rapporten. I de fall där sjukdoms symtom iakttagits vid provuttaget, har prover direkt, grundat på sjukdomsmisstanke, utan föregående PCR analys, undersöktsmed immunohistologisk metodik. Detta gäller två åar i Jämtland där flera insända öringar hade tydligt förstorade njurar (se jämförande bilder nedan, infekterad öring till höger, notera den kraftigt förstorade njuren, se vit pil).
Dessa fall har rapporterats enligt rutin för anmälningspliktig sjukdom under hösten 2009 till länsstyrelse, Fiskeriverket och Jordbruksverket. Öringpopulationer där sjukom observerats är Hållborgsån i Bräcke kommun samt Slåtteån i Krokoms kommun. I Hållborgsån sågs sjukdomssymtom hos 23 av 30 öringar och i Slåtteån hos 7 av 30 undersökta fiskar. Inga symtom noterades vid provuttag från övriga vattenområden. PCR-undersökningen, som genomförts på de insamlade laxfiskarna, visade på förekomst av T. bryosalmonae i ytterligare 4 provtagna områden. Parasiten har därmed påvisats genom PCR undersökning i 3 av 5 Jämtländska vatten och i 3 av 7 Västerbottniska vattendrag. Alltså har T. bryosalmonae total påvisats i 6 nya vattendrag där det tidigare ej var känt att parasiten skulle förekomma. Förutom redan nämnda vatten (se ovan) så har parasiten identifierats i öring från Strulån, Jämtland samt i Västerbotten hos öringar från Satsån, och laxar från Lögdeälven och Öreälven. Detta resultat visar att sjukdomen har ett betydligt större utbredningsområde än tidigare varit känt. I en klimatsituation där dessa vattendrag kan utsättas för högre temperaturintervall gynnas smittämnet och infektionen kan få en dramatisk effekt på vildlevande bestånd. Detsamma kan komma att orsakas av vissa vattentekniska åtgärder genom t.ex. avtappning och minskning av vattenvolymer som indirekt kan medföra en ökad vattentemperatur. Detta riskerar att gynnar parasiten och mellanvärden (referens 1,2 och 5) och därmed få en negativ effekt på lokala laxfiskbestånd (jämför mortaliteter i Åälva i Norge, ref 4.) En medvetenhet om sjukdomens utbredningsområde bör därför ingå i de beredskapsplaner som används för att förutsäga potentiella hot och ev. framtida beståndspåverkan. Denna undersökning som är den första vildfisk kartläggning genomförd i Sverige avseende PKD ger enbart information om begränsade områden av norra Sverige. Det finns anledning att inventera andra angränsande vattenområden och även vatten i andra län för att undersöka sjukdomens utbredningsområde. Resultat från sådana inventeringar bör ingå i de ställningstagandena som regional och lokala myndigheter kan behöva göra. Exempelvis när avvägande om var insatser för bevarande av olika fiskbestånd ska sättas in, och hur dessa skall genomföras. Sjukdomen kan, i de vatten där dess existens är okänd, komma att reducera effekten av planerade åtgärder dvs. motverka önskan att stärka hotade laxfiskbestånd. Referenslista, se bilaga 1 Tabell med resultat från screeningen, se bilaga 2 Karta med provagningskoordinater, se bilaga 3 Anders Alfjorden
Bilaga 1, Referenser: 1. Bettge, K., Segner, H., Burki, R., Schmidt-Posthaus, H., Wahli, T., (2009). Proliferative kidney disease (PKD) of rainbow trout: temperature- and time-related changes of Tetracapsuloides bryosalmonae DNA in the kidney. Parasitology 136:615-625. 2. Bettge, K., Wahli, T., Segner, H., Schmidt-Posthaus, H., (2009). Proliferative kidney disease in rainbow trout: time- and temperature-relatied renal pathology and parasite distribution. Dis. Aquat Org 83:67-76. 3. Forseth, T., Jörgensen, A., Mo, T.-A., (2007). Pilotkartlegging av PKD i norska laksvassdrag. NINA Rapport 259. 4. Sterud, E., Forseth, t., Ugedal, U., Poppe, T., Jörgensen, A., Bruheim, T., Fjeldstad H.-P., Mo, T.-A., (2007). Severe mortality in wild Atlantic salmon, Salmo salar due to proliferativ kidnay disease (PKD) caused by Tetracapsuloides bryosalmonae (Myxozoa), Diseases of Aquatic organisms vol. 77:191-198. 5. Tops S, Lockwood W, Okamura B (2006) Temperature-driven proliferation of Tetracapsuloides bryosalmonae in bryozoans hosts portend salmonid decline. Dis Aquat Org 70:227 236. 6. Wahli T, Knuesel R, Bernet D, Segner H, Pugovkin D, Burkhardt-Holm P, Escher M, Schmidt-Posthaus H (2002). Proliferative kidney disease in Switzerland: current state of knowledge. J Fish Dis 25:491 500.
Bilaga 2, Tabell med resultat från screeningen avseende Tetracapsuloides bryosalmonae (PKD) vattenområde Kommun Fiskart Längd Interv (cm) antal provt fiskar Realtid-PCR T. bryosalmonae påvisad (X) 1 Grytån Strömsund Öring 5,3-14,5 16 0 2 Semsån Östersund Öring 4,5-12,5 30 0 3 Strulån Berg Öring 6,5-16 30 3 (10%) 4 Slåtteån Krokom Öring 7,9-9,8 30 12 (40%) 5 Hållborgsån Bräcke Öring 6,3-13,2 30 30 (100%) 6 Satsån Vilhelmina Öring 3,9-9,8 30 4 (13%) 7 Lillån Dorotea Öring 4,9-10,0 30 0 8 Råbäcken Dorotea Öring 5,2-11,1 30 0 9 Lagbäcken Dorotea Öring 4,2-11,8 30 0 10 Fjällån Dorotea Öring 5,5-16,2 17 0 11 Lögdeälven Hörnefors Lax 4,3-8,0 30 13 (43%) 12 Öreälven Hörnefors Lax 4,8-7,2 31 11 (35%)
Bilaga 3a. Karta över provtagna vattendrag Jämtland Dnr 2008/830
Bilaga 3b. Karta över provtagna vattendrag Västerbotten 6 7 8 9 10 12 11