Downstream Processing



Relevanta dokument
Jonbyteskromatografi

Kromatografi. Kromatografi

Kromatografimetod. Separation genom olika distribution av molekyler mellan en mobil fas och en stationär fas

Isolering och rening av proteinet tiopurinmetyltransferas

BASÅRET KEMI B BIOKEMI VT PROTEINER OCH ENZYMER (sid )

Rening, inmärkning och användning av ett målprotein

Introduktion till laboration Biokemi 1

Rening av proteiner: hur och varför?

Kromatografi. Den kromatografiska processen. Fördelar med HPLC - (utförs under högt tryck ca 400 Bar) Vätskekromatografi. Olika former av LC

Proteiner. Biomolekyler kap 7

Lite basalt om enzymer

Expression, produktion och rening av Fatty acid binding protein (FABP) från ökenmyran Cataglyphis fortis

DNA-labb / Plasmidlabb

Institutionen för laboratoriemedicin Bilaga 2 Biomedicinska analytikerprogrammet Analytisk Kemi och Biokemisk metodik Ht 2010, Termin 3

Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området

Felveckning och denaturering av proteiner. Niklas Dahrén

Tentamen i Analytisk kemi II,

Preparation av hemoglobin med hjälp av gelfiltrering

Proteiner. Biomolekyler kap 7

JÄMVIKT i LÖSNING A: Kap 12 Föreläsning 3(3)

Ke2. Proteiner. Pär Leijonhufvud. Förstå proteinernas och aminosyrornas kemi och betydelse i levande organismer (och samhället) (alanin)

JÄMVIKT i LÖSNING A: Kap 12 Föreläsning 2(2)

Preparation och spektroskopisk karakterisering av Myoglobin

Syror, baser och ph-värde. Niklas Dahrén

Cellen och biomolekyler

Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området

Utveckling av reningsmetod för cytokrom c-id1 från Ideonella dechloratans

Introduktion till labkursen på Biokemi 1

Biologi 2. Cellbiologi

Cellbiologi: Intracellulär sortering och cellsignalering

LAB 12. Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli

Proteinstruktur samt Hemoglobin

c) Hur förskjuts jämvikten av en tryckförändring? Motivera svaret. (2) Jämvikten förskjuts åt vänster om trycket ökar:

Proteiner Äggvitan består av proteinet ovalbumin. Farmaceutisk biokemi. Insulin är ett proteinhormon. Gly. Arg. Met. Cys. His. Gly.

Biokemisk analys och separationsteknik VT08

Allmän Kemi 2 (NKEA04 m.fl.)

Vad är MHC? MHC och TCR struktur. Antigen processering och presentation. Kursbok: The immune system Peter Parham

1. a) Markera polära och icke-polära delar i nedanstående molekyl. Vilken typ av ämne är det, och vad heter molekylen? (2p)

Konc. i början 0.1M 0 0. Ändring -x +x +x. Konc. i jämvikt 0,10-x +x +x

Biologiska membran Kap 10 fig10-1, 15, 18, 19 & med tillhörande beskrivningar. Övrigt är repetition.

Transkription och translation. DNA RNA Protein. Introduktion till biomedicin Jan-Olov Höög 1

KEMA02 Oorganisk kemi grundkurs F3

Kvalitativ analys. Kvantitativ analys. Biokemisk analys och separationsteknik. GLP = Good Laboratory Practice. GMP = Good Manufacturing Practice

5. Transkriptionell reglering OBS! Långsam omställning!

Nationellt Samverkansprojekt Biogas i Fordon

4. VÄTSKEKROMATOGRAFI

Kapitel 15. Syra-basjämvikter

Proteiner. Kap 3,

1 Tror du reaktionen nedan är momentan eller ej? Motivera. 1p S 2 O H + S(s) + SO 2 (g) + H 2 O(l)

Tentamen i KEMI del B för Basåret GU (NBAK10) kl Institutionen för kemi, Göteborgs universitet

Den elektrokemiska spänningsserien. Niklas Dahrén

Biokemisk Analys och Separationsteknik

Från DNA till protein, dvs den centrala dogmen

Antikroppar:Från gen till protein skapande av diversitet. Kursbok: The immune system Peter Parham

Modellbaserad processutveckling för Läkemedelsindustrin

Värmens påverkan på livsmedel. Vad sker vid upphettning av vår mat?

KEMA02 Oorganisk kemi grundkurs F4

Analytisk kemi. Kap 1 sid 15-22, Kap 9 sid

Kapitel 16. Lägre magtarmkanalen. Löslighet och komplex

Tillämpning av olika molekylärbiologiska verktyg för kloning av en gen

Kapitel Var är vi i kursen???

Kapitel 14. HA HA K a HO A H A. Syror och baser. Arrhenius: Syror producerar H 3 O + -joner i lösningar, baser producerar OH -joner.

Så började det Liv, cellens byggstenar. Biologi 1 kap 2

Den elektrokemiska spänningsserien. Niklas Dahrén

Glattmuskel laboration

Övningstentafrågor i Biokemi, Basåret VT 2012

Titrering av en stark syra med en stark bas

Extraktion och isolering av naturprodukter

Proteinstruktur och Hemoglobin

Sluttentamen Biokemi KE7001p3, 15:e mars 2007, Max poäng = 76 p. Slutlig gräns för godkänd = 36 p (47 %).

Intermolekylära krafter

Kapitel 16. Löslighet och komplex

TENTAMEN I STRUKTURBIOLOGI

Intermolekylära krafter

30. Undersökning av aminosyror i surkål

Sluttentamen Bke2/KE0003, 29:e Oktober 2003, Max poäng = 94 p. Preliminär gräns för godkänd = 50 p (53 %).

Johan Benesch. Null Ellipsometry and Protein Adsorption to Model Biomaterials

Kapitel 14. Syror och baser

Från DNA till protein, dvs den centrala dogmen

Kromatografi. Kromatografi. Kromatografi. Användningsområde. Den kromatografiska processen. Typer av kromatografi. Separation.

Transkription och translation = Översättning av bassekvensen till aminosyrasekvens

Tentamen i Immunteknologi 29 maj 2002, 8-13

Prokaryot proteinproduktion

UTTAGNING TILL KEMIOLYMPIADEN 2006

Svar: 3. a) Vid enzymkatalys binder enzymet in substratet/substraten till aktiva ytan. Närhet och orientering är förutsättning för katalys.

Elektrolysvatten. Miljövänlig teknologi för vattenrening,desinfektion och sterilisering

RNA-syntes och Proteinsyntes

KARLSTADS UNIVERSITET KEMI

Upplev Skillnaden. Total Purity System

Anolytech ANK-Anolyt för bättre djurhälsa och ökad produktion. Enkelt, miljövänligt och ekonomiskt.

Kap 8 Redox-reaktioner. Reduktion/Oxidation (elektrokemi)

Analys av nukleinsyra. Molekylärbiologisk metodik T3 ht 11 Märit Karls

DNA FRÅN BLOD & KINDCELLER

Kemi. Fysik, läran om krafterna, energi, väderfenomen, hur alstras elektrisk ström mm.

Kap. 8. Bindning: Generella begrepp

Vätskebalansen och syra-basbalansen. Vätske- och syra-basbalansen. Innehåll Människan: biologi och hälsa SJSE11

Kromatografi. Idag

Användning av kol och energikällor

Integrerad signaltransduktion

Identifiera okända ämnen med enkla metoder. Niklas Dahrén

Transkript:

Downstream Processing 4 huvudsteg i ett reningsförfarande 1. Förfraktionering Avlägsna fasta partiklar, ex celldebris. Sker via centrifugering, filtrering, sedimentering, flockulering Ställa in ph, jonstyrka. Sker via gelfiltrering eller dialys 2. Produktisolering För att ex reducera vätskevolymen. Utförs med Ultrafiltrering, adsorbering, sedimentering 3. Reningssteg Används för att separera produkten från kontaminanter vilkas egenskaper till stor del liknar produktens 4. Polishing För att få produkten i stabilt, lätt-transporterat, bekvämt format. Använd gärna kristallisering, frystorkning Vissa reningsförfaranden kombinerar flera av dessa steg! Jonbyteskromatografi Den mest frekvent använda proteinreningsmetoden Bygger på laddad interaktion mellan målproteinet i lösning och en fast matris. Beroende av: Lösningens ph Målproteinet och kontaminanternas pka Laddningskoncentrationen hos målproteinet och kontaminanterna 1

Jonbyteskromatografi Hög upplösning Hög kapacitet Mångsidig Enkel både i teori och i praktik Kostnadseffektiv Katjonbytare: binder POSITIVT laddade molekyler Matrisen NEGATIVT laddad Anjonbytare: binder NEGATIVT laddade molekyler Matrisen POSITIVT laddad Mekanism Jonbyte 1) Diffusion av jonen (proteinet) till matrisens laddade yta snabbt! 2) Diffusion av jonen (proteinet) in i matrisen 3) Jonbyte på ytan av matrisen, jämviktsprocess 4) Diffusion av den utbytta jonen ut ur matrisen 5) Selektiv desorption av den bundna molekylen mha ph eller laddningsförändring (saltkoncentrationsförändring) av bufferten 2

Anjonbyteskromatografi Att tänka på - Jonbyte Högre laddning hos proteinet ger starkare bindning Mer hydrofob omgivning ger starkare interaktion mellan laddade grupper pi hos målproteinet avgör (oftast) vilket ph som fungerar Jonbytarmatrisens laddning ska vara stabil vid det ph man använder ph vid matrisens yta skiljer sig från buffertens med ca en ph-enhet Högre jonstyrka i bufferten ger lägre inbindning - tävlande joner 3

His Laddade aminosyror Aminosyra Struktur pka i pka Förekommer proteiner fri % Arg guanidin 12 12.5 5.7 Asp carboxylat 3.9-4.0 3.7 5.3 Cys tiol 9.0-9.5 10.6 1.73 Glu carboxylat 4.3-4.5 4.3 6.2 His imidazol 6.0-7.0 6.1 2.2 Lys ε-amino 10.4-11.1 10.7 5.7 Tyr fenol 10.0-10.3 10.4 3.2 α-amino amino 6.8-8.0 α-carboxyl carboxylat 3.5-4.3 Laddade grupper sitter oftast på proteinets yta Ibland är de internt koordinerade av metalljoner Observera att posttranslationella modifieringar (PTMs) kan påverka pka pi hos proteiner De flesta proteinerna har ett pi under 7 Basiska proteiner har ett överskott av basiska aminosyror pi sällan över 9.7 Sura proteiner med pi under 5 är också ovanliga Titreringskurvor kan göras för proteiner, ger info om pi och laddningsförändring i olika ph-intervall Vid pka bidrar en aminosyra med laddningen +/-0.5, en ph-enhet från pka är 91% titrerade 4

Jonbyteskromatografi - Matrisen Starka jonbytare: Joniserade i ett brett ph-intervall -SO 3 - -N + R 3 Svaga jonbytare: Joniserade i ett smalare ph-intervall - COO- -HN + (CH 2 CH 3 ) 2 Kapacitet Total kapacitet bestäms genom titrering med jonbytande grupper som är tillgängliga (µmol/ml gel) Kapacitet kan också anges i mg protein/ml gel Kapaciteten är mycket proteinberoende 5

Eluering Jonbyte Isokratisk eluering används ibland - Provvolymen bör då ej överstiga 1-5% av kolonnvolymen (jmf gelfiltrering). - Bra separation Stegvis eluering - ger mer koncentrerat protein Gradienteluering används oftast - ph Svårt att få stabila ph-gradienter Kommer nära pi för proteinet - Salt Oftast NaCl Bra upplösning Mer utspätt än vid stegvis eluering Affinitetskromatografi Koncentrering och rening i samma steg Bra som första steg i en reningsprocess 6

Affinitetskromatografi + Hög specificitet Färre reningsteg Produktproteiner med låg koncentration kan renas - Dyra matriser Få ligander tillgängliga Proteinligander har - oftast - relativt låg stabilitet Tuffa elueringsförhållanden! Affinitetskromatografi två möjligheter: Genfusioner Tag Target Target Tag Nativt målprotein Target + Generell metod för många målproteiner + Fusionssystem finns att köpa (plasmid) - Reningstaggen kan störa + Rening av det nativa proteinet - Affinitetsligand kan vara svårt att få tag i 7

Human Protein Atlas Storskalig produktion av antigen (ca. 45 000) IMAC generell, effektiv metod Transformering av plasmid Proteinproduktion i E.Coli Rening med IMAC Antigen-del ABP His 6 Antibiotika resistent gen Affinitetskromatografi exempel på ligander Ligand Antikroppar Enzyminhibitorer Lectin Nukleinsyror Hormoner, vitaminer Socker Antigen, ProteinA Rekombinant protein Målprotein Antigen, Cell, Virus Enzymer Polysackarider, Glykoproteiner Proteiner som binder nukleinsyror Receptorer, Bindarproteiner Lectin, Sockerbindande proteiner Antikroppar Utvalt målprotein 8

Affibody - rekombinant protein Selekterat mot utvalt målprotein Anti-xxx prod.nr anv.omr mgd pris Affinitetskromatografi Önskvärda egenskaper hos liganden Kunna bilda ett reversibelt komplex med målproteinet Specificiteten bör vara hög Affiniteten måste vara tillräckligt hög för att kunna retardera målproteinet (K a 10 5-10 6 ) Komplexet ska kunna brytas utan att förstöra målproteinet Liganden bör kunna bindas upp på en fast matris 9

Affinitetskromatografi Önskvärda egenskaper hos matrisen - Måste innehålla aktiva grupper som liganden kan bli kopplad till - Måste vara stabil under hela kromatograficykeln - Bör ej interagera med de molekyler som finns i startmaterialet - Bör tåla höga flöden - Makroporös för att tillåta att stora molekyler vandrar in i porerna Kopplingskemi NHS-aktiverad matris -NH 2 CNBr-aktiverad matris -NH 2 Aktiverad CH matris -NH 2 Epoxiaktiverad matris -OH -SH (tioeter) -NH 2 Tiolpropylmatris -SH (disulfid) EAH-aktiverad matris -COOH Liten ligand kräver extra eftertanke när det gäller spacerarm för att komma ut från ytan 10

Gruppspecifika affinitetsligander Lectiner Används för rening av gykosylerade proteiner Det finns olika lectiner med specificitet för olika sockerarter (glukos, mannos, galaktos ) Protein A & Protein G Används för rening av antikroppar Olika affinitet för olika species och klasser Heparin Används för rening av koagulationsproteiner och även DNA-bindande enzymer Affinitetsrening. Hur? 1. Förfraktionering (se tidigare slide) 2. Inbindning - Tvätt - Eluering - Normalt används bred och kort kolonn, ger snabb separation. Om affiniteten är låg blir proteinet bara retarderat -> kolonnen behöver vara längre - Ibland batchvis inbindning (eluering) - Om inbindningskinetiken är långsam krävs ett långsamt flöde av provet - Låga flöden ger snyggare toppar, mer koncentrerat protein - Gradienteluering om flera bindare finns - Sänkning av ph (2-4) vanligt vid eluering. Sällan, men ibland, höjer man ph - Ibland eluerar man med höjd salthalt - Kompetitiv eluering: låga flöden, annars breda toppar. Detta är en typ av eluering som är skonsam mot målproteinet 11

Regenerering Vanligast på labb är att pulsa kolonnen med omväxlande elueringsbuffert och tvättbuffert avsluta genom att jämvikta med startbuffert igen (om rening ska ske inom kort) alternativt storage buffer (för förvaring, innehållande NaAz eller EtOH) Industriellt används 0.1-1M NaOH för att avlägsna bundet material från matrisen. Cleaning in Place CIP cippa kolonnen Detta är ofta ett problem vid affinitetsrening där man har proteinligander på kolonnen de tål normalt ej så höga phn! Kovalent kromatografi 1 S -S - N P -SH Kan användas då målproteinet har en fri cystein Aktivering av matrisen med 2,2 - dipyridyldisulfid 2 S -S - P N H S Reducera målproteinet Bind till gelen, batchvis Tvätta med 0.1-.3 M NaCl 3 S -S - P R -SH excess Eluera med reduktionsmedel, oftast 10-25mM DTT Tiopyridyl lossnar lättare än proteinet, gradient eller steg 4 S -SH P -SH R- S -S -R Gelfiltrering 12

Några väl använda affinitetsvansar ProteinA 31kDa binder IgG elueras med lågt ph Z 7kDa binder IgG elueras med lågt ph ABP 5-25kDa binder HSA elueras med lågt ph GST 25kDa binder glutation elueras med glutation His6 6 aa binder metalljoner elueras med imidazol eller lågt ph Biotin 13kDa binder avidin elueras med biotin FLAG-peptid 8 aa binder till mono- elueras med lågt ph klonal antikropp elleredta svans = tag = reningshandtag Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC - Metallbindande aminosyror (His, Cys, Trp) måste vara exponerade på ytan - Aminosyrornas läge i förhållande till varandra är viktigt - Jon-jon-interaktioner kan inhiberas med rätt buffertval - ph-beroende - Fler elueringssätt finns beskrivna (ph, kompetitiv eluering, organiska lösningsmedel, kelaterande ämnen) 13

IMAC När aminosyrainnehållet är känt Närvaro av His/Trp på ytan Me-joner som ger adsorption 1 His Cu 2+ > 1 His Cu 2+, Ni 2+ Kluster med His Cu 2+, Ni 2+, Zn 2+, Co 2+ Flera Trp Cu 2+ IMAC Reningshandtag, His 6 - Genetisk fusion mellan målproteinet och en His 6 -svans - Mycket vanligt vid produktion av rekombinanta proteiner - Enkel, relativt specifik rening som är oberoende av målproteinet - Går att rena vid denaturerande förhållanden, bra då proteinet bildar inklusionkroppar och är allmänt olösligt - Eluering sker med lågt ph eller imidazole (His-analog) 14

Expanded bed adsorption (EBA) Odling Första reningssteget EBA - Minimera antalet steg i separationsprocessen - Pumpa materialet på en kolonn direkt från odlingen Målprotein Centrifugering/filtering kan undvikas Eluering kan även ske från en expanderad bädd Handhavande EBA Bädden expanderas mha buffert som pumpas underifrån Den övre adaptorn flyttas upp en bit ovanför bädden Cellsuspension med målprotein appliceras Bädden expanderar vanligvis mer Tvätt med buffert tills den buffert som passerar kolonnen går ner i absorbans Buffertflödet vänds och toppadaptorn flyttas ner Eluering sker från packad bädd (oftast) CIP, Cleaning In Place, ofta NaOH och NaCl över natt 15

Expansion EBA Flödet i kolonnen måste vara jämnt, adaptorerna rena och luftfria, viktigast i botten Kolonnen måste stå rakt Celldebris bör passera genom kolonnen, men matrisen skastannakvar Matrisens partiklar av olika storlek (50-400 µm) och densitet (1.1-1.3 g/cm 3 ) för en jämn distribution i kolonnen Matris EBA Hög densitet nödvändig för att hålla kvar matrisen i kolonnen Agarose med kvarts i för att höja densiteten är den vanligaste matrisen De första försöken på Sepharose, mycket låga flöden Dextran-silika finns också 16

Kolonntvätt Sanitation CIP i allmänhet Speciellt viktigt då man laddar hela celler eller celldelar på kolonnen, vid ex EBA 0.5M NaOH i minst en timme Jonbytesmatriser, EBA och HIC-matriser tål detta, men problem med affinitetsmatriser med proteinligander Råmaterialet Var medveten om eventuella problem med DNA - Innehållet ger hög viskositet -> bädden blir instabil - Anjonbyte -> negtiva laddningar på ytan samt negativt laddat DNA kan ge kanaler i kolonnen 17